测量抗体乳鼠心肌细胞对细胞功能的影响

Lars G. Eckerle; Stephan B. Felix; Lars R. Herda

doi:10.3791/4237

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摘要
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摘要

所提出的方法提供了一种方法扩张型心肌病的患者血浆中的检测功能有效的心性自体抗体，不论特异性抗原，通过分析隔离病人免疫球蛋白对大鼠离体心肌细胞的缩短及细胞内钙瞬变的影响。

摘要

扩张型心肌病（DCM）是在年轻的成年人¹心脏衰竭的主要原因之一。虽然遗传倾向和博览会的有毒物质被称为的起源DCM，约三分之一的患者对本病的原因，在很大程度上仍然不清楚。在这些患者中有相当多的，已经对心脏表位抗体检测和怀疑本病的发生和发展^2,3中发挥了举足轻重的作用。心脏自身抗体的重要性，强调消除自身抗体的免疫吸附^3-5后，在DCM患者血流动力学的改善。已经被确定各种特异性抗原^2,3和针对这些目标的抗体，可以通过免疫测定法检测。然而，这些方法不能区分刺激（及因此功能有效）和阻断自身抗体。有越来越多的evidenCE，这种区别是非常重要的^6,7。它也可以被假定，若干心性抗体的目标仍然是身份不明，因此不能检测由免疫测定法。因此，我们建立了功能活性的心性的抗体，独立的各自的抗原的检测方法。用于该方法的背景是通常观察到的功能区域心脏蛋白在哺乳动物^8,9之间的高同源性。这表明，心脏针对人的抗原的抗体与非人类的靶细胞，它允许测试从DCM患者对成年大鼠心肌细胞的IgG交叉反应。我们的方法包括3个步骤：第一，IgG抗体是从病人的血浆，使用琼脂糖凝胶偶联的抗-IgG抗体，从免疫吸附的列（德国，Teterow PlasmaSelect）得到分离。二，成人的心肌细胞分离胶原酶灌注在Langendorff灌流装置，使用AP议定修改以前的作品^10,11。将得到的心肌细胞的附着层粘连蛋白涂层的腔coverglasses和染色的Fura-2，钙的选择性荧光染料，该染料可以容易地进入细胞，观察细胞内钙（Ca ^{2 +）}含量^12。在最后一步中，病人的IgG的效果上的细胞缩短和Ca ^{2 +}瞬变字段刺激心肌在线监视使用市售的细胞钙和收缩监测系统（IonOptix，弥尔顿，MA，USA）连接到一个标准的逆荧光显微镜。

研究方案

1。抗体从患者标本分离

准备迷你免疫吸附柱填充3毫升2毫升病人EDTA血浆抗IgG琼脂糖每到一个空的Econo豆列。 IgG抗体隔离需要至少2毫升的病人血浆中。
将抗-IgG琼脂糖凝胶的顶部上的过滤器，剖开列的前端下部，并按下的过滤器可达到约1滴/秒的流速。让保存液用完的列。
洗柱用3倍体积的0.9％NaCl中，每体积的血浆。
移液器的血浆列。当等离子体已完全沉浸在抗-IgG琼脂糖凝胶，用相同体积0.9％NaCl溶液洗。
吸取1，pH值为2.8的0.2M甘氨酸盐酸血浆体积上的列，并让沉浸到琼脂糖。添加另一个卷甘氨酸盐酸列上。收集的流量，通过在一个15毫升的试管中，将pH调节至7.3，用0.5M的Tris-HCl，pH值8.0。
若要重新列，用3个血浆容量甘氨酸盐酸。用2倍体积的0.9％NaCl的最终洗涤后，这个字段可以被用于下一个血浆样品。可替代地，列可以填充与保存溶液，并存储在4 - 8℃下进行最多达4周。
对于心肌细胞上使用，所收集的IgG级分透析实验缓冲液（EB）。对于制备的EB，添加0.6毫摩尔MgCl _2，117 mM氯化钠，2.8 mM KCl中，1.2毫摩尔KH ₂ PO _4，1.2毫摩尔的CaCl _2，10mM HEPES和20mM葡萄糖的1升蒸馏水，在磁力搅拌器上，并调整pH值7.3。
一种纤维素酯渗析膜管中填充的IgG级分，具有分子量100 kDa的切断。将管在1升的EB，并用磁力搅拌器缓慢搅拌，在4℃下8小时后，在透析管转移到3升的新鲜的EB和另一透析20小时，在4℃。
经过透析，加热样品30分钟，在57℃下在水浴中以inactivatË补体因子。确定总IgG浓度，并准备含330微克的IgG各等份。当心肌细胞样品的测量（4.3），填补了EB的1毫升等分试样。可以存储未稀释的等分试样在-20℃直至进一步使用。

2。大鼠心肌细胞的分离

对于制备的Ca ^{2 +}的隔离缓冲器（IB），添加110 mM氯化钠，2.6 mM KCl中，1.2 mM的用MgSO _4，1.2毫摩尔KH ₂ PO _4，20mM的HEPES，11mM葡萄糖1升蒸馏水中，使用磁力搅拌器。调节pH至7.4，在室温和过滤器通过0.2μm瓶顶过滤器进行灭菌。
填充80毫升Langendorff灌流恒温系统上水库IB。调整恒温器设置，以保持在37℃的温度的缓冲和曝气用95％O _{2/5％CO 2的} 30分钟的缓冲区。
称取约10,000 - 12,000 U的collagenase II型，175毫克无脂肪酸BSA和溶解在20毫升IB含有22.5微升的100mM CaCl _2的原液。控制隔离缓冲液的pH值在上水库和如果需要的话进行调整。
只Wistar大鼠175 - 200克，375微克/公斤体重硫喷妥钠麻醉。 2500 IU肝素以硫喷妥钠解决方案。开胸手术后，切除心小心地用一个完整的主动脉弓，并将其转移到冰冷的0.9％的氯化钠。清洁对心脏的血液和周围组织和转移到新鲜的0.9％NaCl溶液中。暴露主动脉，打开节流的Langendorff系统，获得滴的速度2-3/sec的心脏的套管。
最多3分钟，流速为1滴/秒，洗出剩余的血灌注心脏。开始流通的Langendorff系统中的IB。从上游水库中取出20毫升缓冲液，填补在的胶原酶溶液和填充的缓冲，需要达到80毫升。循环的c另一个27分钟ollagenase溶液。流速应周期性地控制和维持在1滴/秒使用节流。
从套管分离的心，干净的心房和主动脉，切成小块。允许在的胶原酶溶液运行到下水库，降低音量到最大40毫升和进一步消化切碎的心室为10 - 15分钟，在连续曝气与95％O _{2/5％CO 2。}之后，过滤该细胞悬浮液通过200μm的筛目大小的纱布入50毫升的管。
还原的Ca ^{2 +的}含量的细胞在3个步骤：在43×g离心2分钟，在室温和重悬细胞在10ml IB含有200μMCaCl _2的离心细胞悬浮液。再次离心，重悬细胞与500μM _氯化钙 10毫升IB。经过最后的离心重悬心肌在无菌过滤EB（见1.8），50000个细胞/ ml的密度。

e_title“> 3。Fura-2的染色中的心肌细胞

大衣4腔室盖玻片，每孔10微克层粘连蛋白和等待，直到它完全干燥。
导入各孔中，切割尖端用微量填充1毫升上述心肌细胞的悬浮液。允许在室温下的1小时的细胞附着。
稀释10微升的1毫克/毫升的Fura-2 AM在5毫升的EB的原液。保持在黑暗中的染色溶液。
脱掉缓冲液和未连接的细胞从盖玻片和吸移管0.5毫升到各孔中的染色溶液。 10分钟适度的摇晃下培养细胞。随后，起飞染色液，洗细胞一次，用1毫升EB终于填补0.5毫升的EB中，每孔。在染色过程中应避免直射阳光，并始终保持在黑暗中染色细胞。

4。细胞缩短和Ca ^{2 +}瞬态记录

将腔室盖玻片的倒数荧光米icroscope连接到一个心肌细胞的钙和收缩记录系统。一个定制的电极与第一井的流入和流出管的位置。 superfuse心肌细胞与1毫升/分钟的EB和开始电刺激（1赫兹，20伏，5毫秒的持续时间）。使细胞适应约2分钟的刺激。
选择一个完整的棒状清晰的条纹和不断收缩的心肌细胞。的视场中的单元格的中心位置，并打开相机通道。取向的细胞内水平的视频区，通过旋转的小区成帧适配器和移动的显微镜载物台上。
调整视频区域的边缘检测控制单元（ 图2），打开荧光通道和创纪录的10 - 15宫缩获得初始细胞缩短和Ca ^{2 +}瞬态。
关闭显微镜的光通道，以避免漂白的荧光染色。切换流过的样品从EB绕过了3路阀和superfuse心肌细胞用1ml的患者的IgG。停泵前空气达到良好。
打开光通道，并记录10 - 15收缩获得的急性细胞反应。暂停录制，光通道再次关闭。 2和5分钟后重复记录。
取出电极的阱。彻底清洁管，并继续与EB的下一个良好的腔室盖玻片。
细胞缩短和Ca ^{2 +}瞬变与IonWizard软件使用“Edge-Length/Length”和“呋喃-2 -数字/比例减去”窗口，分别分析。计算从初始细胞缩短和Ca ^{2 +}瞬时用于急性称为基线（提单％峰值小时）的峰高，2分钟和5分钟响应的百分比变化。