إإكسبلنتس قسيم أرومي لاختبار الالتزام مصير الخلايا أثناء التطور الجنيني

Summary

ويمكن أن يتأثر مصير خلية جنينية عن طريق الجزيئات الفردية الموروثة و / أو عن طريق إشارات من الخلايا المجاورة. استخدام الخرائط مصير الجنين مرحلة الانقسام القيطم، يمكن تحديد blastomeres واحدة للثقافة في عزلة لتقييم مساهمات جزيئات الخلية الموروثة مقابل خلية التفاعلات.

Abstract

خرائط مصير، التي شيدت من النسب تتبع كافة الخلايا من الجنين، التي تكشف الأنسجة ينزل من كل خلية من خلايا الجنين. على الرغم من أن مصير خرائط مفيدة جدا لتحديد السلائف من جهاز لتوضيح والمسار التنموي الذي الخلايا سليل ملء هذا الجهاز في الجنين الطبيعي، فإنها لا توضح الإمكانات الكاملة التنموية للخلية السلائف أو تحديد الآليات التي يتم تحديد مصيرها. لاختبار التزام مصير الخلية، واحدة يقارن مرجع الخلية العادية من أصل أفريقي في الجنين سليمة (خريطة مصير) مع الآراء التي أعرب بعد التلاعب التجريبية. ومصير الخلية ثابتة (الملتزم) بغض النظر عن البيئة المحيطة الخلوية، أم أنها تتأثر بعوامل خارجية المقدمة من جيرانها؟ باستخدام خرائط شاملة مصير الجنين القيطم، ونحن تصف كيفية تحديد وعزل ودعا ثقافة الانقسام المرحلة السلائف واحد، الأرومةمرس. هذا النهج يسمح احد لتقييم ما إذا كانت تلتزم هذه الخلايا في وقت مبكر لمصير يكتسبون في بيئتها الطبيعية في الجنين سليمة، يتطلب التفاعل مع الخلايا المجاورة لها، أو يمكن أن تتأثر للتعبير عن مصائر بديلة إذا تعرضت إلى أنواع أخرى من الإشارات.

Introduction

وقد استخدمت على نطاق واسع المورق القيطم الأجنة للتعرف على الآليات التي الخلايا الجنينية الحصول على مصائرهم محددة لبيضها هي كبيرة بما يكفي للسماح النهج المجهرية. بالإضافة إلى ذلك، فإنها تضع خارجيا دون الحاجة للمكملات الغذائية للثقافة المتوسط ​​لأن كل خلية تحتوي على إمدادات الغنية داخل الخلايا الصفائح الدموية صفار التي توفر مخزن الطاقة الذاتية. رصيدا هاما لدراسة الآليات التي يتم تحديد مصير الخلية هي مجموعة شاملة من خرائط مصير blastomeres مرحلة الانقسام (من 2 - من خلال 32-الخلية مراحل) ^{1، 2، 3، 4، 5، 6.} تم بناء هذه الخرائط من قبل microinjecting جزيء كشف في قسيم أرومي، واحدة للتحديد ورصد في وقت لاحق في التنمية التي يتم ملؤها من قبل الأنسجة ذرية المسمى. خرائط مصير يتفق ممكنة لأنه لا يمكن للمحاور الأساسية للأجنة التي تم تحديدها بشكل صحيح في كثير من امبرينظام التشغيل. أولا، في جميع الأجنة النوع البري نصف الكرة الحيوان مصطبغة، في حين أن نصف الكرة نباتية ليست كذلك. ثانيا، دخول الحيوانات المنوية في الإخصاب يسبب انكماش للحيوان تصبغ نصف الكرة نحو الجانب البطني في المستقبل؛ في الأجنة العديد من الفرق تصبغ بالتالي يمكن استخدامها للتمييز بين الجانبين الظهرية والبطنية. ثالثا، ثلم الانقسام يقارب 1 يمكن استخدام الطائرة منتصف السهمي في معظم الأجنة، وبالتالي لتحديد الجانبين الأيمن والأيسر من الجنين. الخرائط مصير تعتمد أيضا على حقيقة أن البيض المخصب بشكل طبيعي في كثير من الأحيان يلتصق في أنماط منتظمة التي تجعل كل قسيم أرومي التعرف عبر عدد كبير من الأجنة. بينما هناك تفاوتا داخل وبين براثن البيض والانقسام بشأن تصبغ أنماط، وذلك باستخدام إجراءات الاختيار وصف يسمح هنا الكشف عن هويته الخلايا مع مصائر المقررة بدقة حوالي 90٪.

يمكن أن مصير الخلايا ردعالملغومة خلال مرحلة التطور الجنيني من عدة آليات. العوامل الذاتية، مثل mRNAs وحشوية ورثت تفاضلي أو البروتينات، والمساهمة في العديد من جوانب الزخرفة في وقت مبكر. على سبيل المثال، mRNAs والأمهات محددة تحديد الخلايا التي ستسهم في خط الجرثومية، تصبح الأديم الباطن، أو المساهمة في محور الجسم الظهرية (في تاريخ ^7). عوامل خارجي المقدمة محليا من قبل الخلايا المجاورة أو أكثر بعيدة من مركز إشارات الجنينية، هي المسؤولة عن إحداث أنواع الأنسجة محددة والزخرفة تقريبا كل نظام الجهاز. أمثلة على مراكز يشير تشمل المنظم / عقدة في المعيدة أن الحث على الأديم الظاهر العصبي وأنماط الطبقة الجرثومية الوسطى، ومنطقة استقطاب نشاط أنماط المحور الأمامي الخلفي من برعم الطرف. على الرغم من أن خرائط تحديد مصير السلائف من مختلف الأجهزة والكشف عن المسار التنموي الذي اتخذته أولادهم في الجنين الطبيعي، فإنها لا يمكن التمييز بين الذاتيةوالتأثيرات الخارجية على تلك الخلايا. كما أنها لا تكشف عن الإمكانات الكاملة التنموية للخلية، التي تفرق أحفاد في بيئة معقدة من الإشارات الجنين. يمكن نهجين التجريبية اختبار ما إذا كان يتم تحديد مصير الخلية من العوامل الجوهرية أو يتأثر لاحقا من قبل العوامل الخارجية: 1) زرع الخلية إلى موقع الرواية في الجنين، أو 2) إزالة الخلايا من الجنين تليها الثقافة في غياب إشارات خارجية.

وكانت كلا النهجين التجريبية الممكنة في القيطم لأن الخلايا هي كبيرة بما يكفي ليمكن فصلها يدويا. على سبيل المثال، قد حذفت العديد من الدراسات الخلايا من أجنة واحدة (لتغيير خلية خلية التفاعلات) أو الخلايا المزروعة إلى مواقع جديدة في الأجنة المضيفة لاختبار التغييرات مصير (مراجعة في ^{7 و 8 و 9).} وبالإضافة إلى ذلك، فإن النهج الثاني من شرحا أعداد صغيرة من الخلايا من مناطق مختلفة من الجنين أناn لثقافة لتوضيح التفاعلات الأنسجة الاستقرائي في غياب عوامل خارجية ممكن لأن تمتلئ خلايا الجنين القيطم مع تخزين المواد الغذائية داخل الخلايا والصفائح الدموية صفار. ولذلك، يمكن تربيتها أنها لبضعة أيام في المتوسط ​​دون تعريف الملح مكملات الغذائية أو عامل نمو ثقافة المتوسط. وقد استخدمنا هذا النهج لإظهار أن blastomeres الحيوان الظهرية لديها قدرة مستقلة لإنتاج الأنسجة العصبية أرومية متوسطة والظهرية بسبب mRNAs ورثت أمهات ^{10 و 11،} وغيرها أظهرت أن مواصفات الأديم المتوسط ​​من 32 خلية blastomeres تعتمد على كل من المعلومات الجوهرية وخارجي ¹² . ميزة زراعة الخلايا كما هو إإكسبلنتس التي يمكن أيضا أن تستكمل المتوسطة مع عوامل محددة لتحديد أي إشارة الخلية الى خلية الاتصال مسار قد تؤثر على مصير الخلية explanted ^{12 و 13 و 14.} وبالإضافة إلى ذلك، يمكن للمرء أن حقن العلاقات العامة قسيم أروميIOR للثقافة مع مرنا لجين لأكثر من صريحة، أو مع مضاد للاحساس [أليغنوكليوتيد] لمنع ترجمة mRNAs والمحلية. يمكن لهذه، وزيادة والخسائر من الوظائف التحليلات التي تتطلب تحديد جزيئات لمصير أعرب مستقل. لتحليل مصير يزدرع، يمكن إجراء تحديد أنواع معينة من الخلايا عن طريق التعبير الجيني القياسي (على سبيل المثال، في الموقع التهجين، RT-PCR) والمقايسات immunocytochemical. هذا البروتوكول يوفر بسيطة، لكنها قوية، وسيلة للتمييز بين آليات الجوهرية وخارجي التي تنظم كيفية خلية جنينية تطور الى أنسجة معينة.

Protocol

1. إعداد وسائل الإعلام أدوات الثقافة، وأطباق

1. شحذ 4 ملقط باستخدام الفيلم جلخ الألومينا. القيام بذلك تحت المجهر تشريح لرصد حجم الإكراميات. زوج واحد من الملقط بمثابة احتياطية في حالة تلف معلومات سرية أثناء العملية. الأوتوكلاف جميع ملقط أربعة وتخزينها في وعاء معقم.
2. جعل كل 500 مل من مستنبت 0.1X 1.0X و(إما لمارك معدلة قارعو الأجراس [MMR] أو تعديل لبارت المالحة [MBS]؛ صفات في ¹⁵⁾ وفلتر تعقيم. نحن نستخدم بشكل روتيني MBS (1X = 88 مم كلوريد الصوديوم، 1 ملي بوكل، 0.7 ملي CaCl _2، 1 ملم MgSO _4، 5 مم HEPES [الرقم الهيدروجيني 7،8]، 2.5 ملم NaHCO _3). المحل في 14-18 درجة مئوية لمدة شهور.
3. جعل حل الاغاروز 2٪ في المتوسط ​​الثقافة (2 ز الكهربائي الاغاروز في الصف 100 مل مستنبت 1X في زجاجة المسمار CAP). الأوتوكلاف حل الاغاروز. يمكن تخزين هذا في C ° 4 أشهر، وميكرووافيد لتسييل عند الحاجة الاغاروز القادمة عليه.
4. في حين أن السائل هو الاغاروز، صب حوالي 0.5 مل على الجزء السفلي من كل بئر من لوحة العقيمة الثقافة 24 أيضا. وهذا سيمنع إإكسبلنتس من التمسك البلاستيك.
5. في حين أن السائل هو الاغاروز، صب حوالي 2-3 مل على القعر من سنتين إلى ثلاث أطباق بتري 60 مم، وعباب بلطف للتأكد من تغطية القاع. وهذه بمثابة أطباق تشريح والأجنة الاغاروز يمنع من التمسك البلاستيك مرة واحدة تتم إزالة الأغشية.
6. عندما الاغاروز قد بردت وتصلبت، اللهب غيض من ماصة باستور 6 "حتى يذوب في الكرة، ولمس طفيفة على سطح الاغاروز في كل بئر من لوحة الثقافة، وهذا سيخلق الاكتئاب الضحلة التي في سيتم وضع يزدرع.
7. ملء كل بئر من لوحة الثقافة مع 1X ثقافة المتوسط ​​العقيمة.
8. عندما الاغاروز قد بردت وتصلبت، وملء الطبق مع تشريح ثقافة المتوسط ​​المخفف (0.1X 0.1X MMR أو MBS) لتسهيل فصل قسيم أرومي.

2. اختيار الأجنة

1. الحصول على البيض المخصب وإزالة هلام المعاطف وفقا لبروتوكولات المعيار ^15. نقلها إلى ثقافة المتوسط ​​0.5X في طبق بتري 100 ملم.
2. عندما تصل إلى مرحلة الأجنة 2-الخلية، فرز تلك التي ثلم الانقسام يشطر 1 المنطقة المصطبغة طفيفة في نصف الكرة الحيواني (الشكل 1) في طبق منفصل. وستكون هذه الجهات المانحة للإإكسبلنتس. الحفاظ على ما تبقى من الخلايا 2-الأجنة في طبق منفصل بجانب الأجنة المانحة في جميع أنحاء الداخلي لتكون بمثابة ضوابط الأخوة لاستضافة إإكسبلنتس.

3. إعداد إإكسبلنتس

1. وضع الأجنة 5-10 في طبق تشريح، ولكن تعمل فقط على جنين واحد في كل مرة.
2. وضع الجنين أولا حتى يمكن رؤية الغشاء المحي شفافة؛ وفصلها بمسافة واضحة (الحيز المحيط بالمح) فوق سطح القطب الحيواني من الجنين. باستخدام القوة شحذفرع فلسطين في يد واحدة subdominant (اليد اليسرى إذا سلم حق واحد)، فهم الغشاء المحي فوق المحيط بالمح الفضاء. باستخدام ملقط تركيزها في جهة أخرى، فهم على مقربة من غشاء ملقط غيض الأولى، وسحب بلطف في اتجاهين معاكسين لتقشير الغشاء بعيدا. جعل فهم الأولي على مسافة من الخلية التي سيتم تشريح، بحيث لا يتم تلف الخلية المستهدفة خلال إزالة الغشاء. يمكن للمرء أن يقول أنه تمت إزالة الغشاء لأن الجنين سوف تتسطح.
3. انتزاع واحدة الزنزانة المجاورة مع ملقط في اليد subdominant واستخدام هذه الخلية بأنها "مؤشر" بحيث لا يتم الخلية إلى أن تشريح لمست مباشرة. مع ملقط في ناحية أخرى، وسحب بلطف الخلايا المتبقية المجاورة بعيدا عن قسيم أرومي المطلوب. في حال استهدفت خلايا خط الوسط، التي تتقاسم نفس المصير، ويمكن إزالتها معا كزوج. وأخيرا، تشريح بعيدا "مقبض" الخلية.
4. التقاط قسيم أرومي (أو الزوج قسيم أرومي)، مع العقيمةوالزجاج ماصة باستور، وتجنب فقاعات الهواء والشفط الزائد. يمكن أن تكون ماصة النار مصقول لإزالة الحواف الحادة التي يمكن أن تلحق الضرر الخلية، ولكن لم نفعل هذا بشكل روتيني. وضع غيض من ماصة باستور تحت سطح ثقافة المتوسط ​​في بئر الطبق الثقافة يزدرع، وطرد بلطف قسيم أرومي. ينبغي أن ينزلق الى الكساد الضحلة عن طريق الجاذبية. ويمكن الجمع بين قسيم أرومي نفسه من أكثر من جنين واحد إلى واحد يزدرع.
5. كرر هذا الإجراء مع الأجنة المتبقية في طبق تشريح، واحدة تلو الأخرى. بعد حوالي 10 الأجنة، سوف تملأ طبق تشريح بالحطام الخلوي. وعندما يحدث هذا، قم بالتغيير إلى طبق تشريح الطازجة.
6. بعد الانتهاء من جميع التشريح، تأكد من أن إإكسبلنتس هي في المنخفضات الضحلة. إن لم يكن، يمكن أن يدفع برفق في الاكتئاب مع حلقة الشعر الذي تم تعقيمها في الايثانول 70٪ والهواء المجفف.
7. بعد نحو ساعة من تشريح الماضي، إزالة الحطام surrounding في إإكسبلنتس تلتئم مع معقمة، ماصة باستور الزجاج.
8. الثقافة لوحة من إإكسبلنتس في 14-20 ° C بجانب طبق بتري تحتوي على الأخوة والأجنة السيطرة. سوف الأجنة الأخوة تشير إلى مرحلة من مراحل تطور إإكسبلنتس قسيم أرومي.

4. حصاد إإكسبلنتس لتحليل

1. حصاد إإكسبلنتس عندما تصل إلى مرحلة الأشقاء المطلوب التنموية. هذه إإكسبلنتس البقاء على قيد الحياة بشكل جيد حتى وإن كانت بعض الخلايا تتفكك. ولذلك، إذا كان هناك كتلة غائم في الثقافة جيدا، واستكشاف مع حلقة أو ملقط شعر لتحديد ما إذا دفن يزدرع صحية داخل.
2. التقاط إإكسبلنتس في حجم صغير من محلول الثقافة مع ماصة باستور الزجاج، وطرد منهم بلطف إلى المخزن المؤقت مثبت أو تحلل المناسبة لفحص تجرى.

النتائج

قدرة هذا الاختبار إلى تقييم دقيق لإمكانات النمو للخلية يعتمد على تشريح خارج قسيم أرومي الصحيح يعتمد على مصير الخرائط ^{1، 2، 3، 4، 5، 6.} لذا، فمن الأهمية بمكان اختيار الأجنة مع نمط تصبغ الصحيح في المرحلة 2-الخلية، كما هو موضح في الشكل (1)، التي تتوافق مع أنماط ...

Discussion

الخطوات الأكثر أهمية بالنسبة لزراعة ناجحة لblastomeres الفردية هي: 1) تحديد بشكل صحيح قسيم أرومي المصالح؛ 2) الحفاظ على معقمة، والثقافة الصحية؛ 3) خلايا تشريح في الجزء الصحيح من دورة الخلية، و4) تطوير دليل الضرورية البراعة لمنع الضرر خلال تشريح ونقل إلى الثقافة أيضا.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم كاشف	شركة	كتالوج رقم	التعليقات (اختياري)
جلخ فيلم الألومينا	توماس العلمية	# 6775E-38	بالطبع (12 ميكرون)، لإجراء إصلاحات كبيرة من النصائح ملقط
جلخ فيلم الألومينا	توماس العلمية	# 6775E-46	متوسطة (3 ميكرون)، لشحذ غرامة من النصائح ملقط
جلخ فيلم الألومينا	توماس العلمية	# 6775E-54	غرامة (0.3 ميكرومتر)، لتلميع نصائح من ملقط
ملقط: دومون، Dumoxel البيولوجيا # 5	أدوات العلوم الجميلة	# 11252-30	هذه لديها نصائح الغرامة التي لا تحتاج شحذ عند شرائها الأولى. تآكل مقاومة حتى يتمكنوا منيمكن تعقيمها.
جنتاميسين الحل	سيجما	G1397	إضافة إلى متوسطة على نفس يوم استخدام