Espianti blastomero al test per l'Impegno cellulare Fate durante lo sviluppo embrionale

Riepilogo

Il destino di una singola cellula embrionale può essere influenzata da molecole ereditarie e / o da segnali provenienti da cellule vicine. Utilizzando mappe destino dell'embrione stadio di segmentazione del Xenopus, singoli blastomeri possono essere identificati per la cultura in isolamento per valutare i contributi di molecole ereditarie rispetto interazioni cellula-cellula.

Abstract

Mappe destino, costruiti lineage tracing tutte le cellule di un embrione, rivelano che i tessuti discendere da ciascuna cellula dell'embrione. Sebbene le mappe destino sono molto utili per identificare i precursori di un organo e per chiarire il percorso di sviluppo da cui le cellule discendenti popolano quell'organo nell'embrione normale, non illustrano il potenziale di sviluppo di una cellula precursore o identificare i meccanismi con cui il suo destino è determinato. Per eseguire il test per l'impegno il destino delle cellule, si confrontano normale repertorio di una cellula di discendenti nell'embrione intatto (la mappa destino) con quelli espressi dopo una manipolazione sperimentale. E 'il destino della cellula fissa (impegnato) indipendentemente dall'ambiente circostante cellulare, o è influenzato da fattori esterni, forniti dai suoi vicini? Utilizzando le mappe complete destino dell'embrione Xenopus, si descrive come identificare, isolare e cultura singoli precursori stadio scissione, chiamato blastomeres. Questo approccio permette di valutare se queste cellule precoci sono impegnati nel fato che acquistano nel loro ambiente normale nell'embrione intatta, richiedono interazioni con le loro cellule vicine, o possono essere influenzate esprimere sorti alterne se esposto ad altri tipi di segnali.

Introduzione

Xenopus laevis embrioni sono stati utilizzati ampiamente per identificare i meccanismi con cui le cellule embrionali acquisiscono i loro destini, poichè le loro uova sono grandi abbastanza da permettere approcci microchirurgiche. Inoltre, si sviluppano esternamente senza la necessità di integrazione nutrizionale del terreno di coltura in quanto ogni cella contiene una ricca intracellulare di piastrine tuorlo che forniscono un negozio intrinseca energia. Un elemento importante per lo studio dei meccanismi attraverso i quali si determina il destino della cellula è la serie completa di mappe destino dei blastomeri fase a scissione (da 2 - a 32 celle stadi) ^{1, 2, 3, 4, 5, 6.} Queste mappe sono state costruite da una molecola microinjecting rilevabile in un unico, blastomero identificabile e il monitoraggio in seguito allo sviluppo che i tessuti sono popolate dalla progenie etichetta. Mappe destino consistenti sono possibili perché gli assi cardinali degli embrioni possono essere identificati in molti Embryos. In primo luogo, tutti gli embrioni wild type l'emisfero animale è pigmentata, mentre l'emisfero vegetale non lo è. Secondo, l'ingresso dello spermatozoo nella fecondazione provoca una contrazione della pigmentazione animale emisfero verso il lato ventrale futuro, in molti embrioni una differenza pigmentazione pertanto possono essere utilizzati per discriminare i lati dorsale e ventrale. Terzo, il solco prima segmentazione approssima il piano sagittale nella maggior embrioni, e quindi può essere utilizzato per identificare i lati destro e sinistro del embrione. Le mappe destino si basano anche sul fatto che naturalmente fecondato le uova frequentemente aderire nella schemi regolari che rendono ogni blastomero identificabile attraverso una vasta popolazione di embrioni. Mentre non vi è variabilità all'interno e tra le grinfie di uova in materia di modelli di pigmentazione e scissione, con procedure di selezione descritte nel presente documento consente di cellule con destini prescritti da identificare con circa il 90% di accuratezza.

Destini cellulari possono essere dissuadereestratto durante l'embriogenesi da diversi meccanismi. I fattori intrinseci, come differenzialmente ereditati mRNA citoplasmatici o proteine, contribuiscono a diversi aspetti di patterning precoce. Ad esempio, specifici mRNA materni determinare le celle contribuirà alla linea germinale, diventare il endoderma, o contribuire all'asse dorsale del corpo (recensione in ^7). I fattori estrinseci forniti a livello locale da parte delle cellule vicine o più distanti da un centro embrionale di segnalazione, sono responsabili di indurre specifici tipi di tessuto ed il modello quasi ogni organo del sistema. Esempi di centri di segnalazione comprendono l'organizzatore / nodo nella gastrula che induce ectoderma neurale e il mesoderma modelli, e la zona di attività polarizzante che il pattern asse anteriore-posteriore del germoglio dell'arto. Sebbene le mappe destino identificare i precursori dei diversi organi e rivelano il percorso di sviluppo adottate dai propri discendenti in embrione normale, non in grado di distinguere tra intrinsecae le influenze estrinseche su tali cellule. Inoltre, non rivelano il potenziale di sviluppo di una cella, i cui discendenti differenziare in un ambiente complesso di segnalazione dell'embrione. Due approcci sperimentali può verificare se il destino di una cellula è determinata da fattori intrinseci o successivamente viene influenzata da fattori esterni: 1) trapianto di cellule in una posizione romanzo nell'embrione, o 2) la rimozione della cellula dall'embrione seguita da coltura in assenza di segnali esogeni.

Entrambi gli approcci sperimentali sono realizzabili in Xenopus perché le cellule sono abbastanza grandi da essere separati manualmente. Per esempio, numerosi studi hanno cancellato singole cellule da embrioni (per cambiare interazioni cellula-cellula) o le cellule trapiantate a posizioni nuove in embrioni di accoglienza per verificare i cambiamenti destino (recensione in ^{7, 8, 9).} Inoltre, il secondo approccio di espianto piccolo numero di cellule provenienti da diverse regioni dell'embrione icultura nto di chiarire le interazioni tissutali induttivi in assenza di fattori esogeni è possibile perché le cellule dell'embrione Xenopus sono riempiti con un archivio intracellulare dei nutrienti, le piastrine tuorlo. Pertanto, essi possono essere coltivate per alcuni giorni in un mezzo definito sale senza integrazione nutrizionale o fattore di crescita del mezzo di coltura. Abbiamo usato questo metodo per dimostrare che blastomeri animali dorsali hanno una capacità autonoma di produrre tessuti mesodermiche neurali e dorsale a causa di ereditarietà materna mRNA ^{10, 11,} e altri hanno dimostrato che le specifiche mesoderma di 32 cellule blastomeri si basa su informazioni sia intrinseco ed estrinseco ¹² . Un vantaggio di coltura di cellule come espianti è che il mezzo può anche essere integrato con segnalazione definiti fattori per determinare quale cellula-cellula percorso di comunicazione potrebbe influenzare il destino della cellula espiantato ^{12, 13, 14.} Inoltre, si può iniettare la pr blastomeroior alla cultura con mRNA a un eccesso di esprimere un gene, o con oligonucleotidi anti-senso per evitare la traduzione di mRNA endogeni. Questi, guadagno e perdita di funzione di analisi in grado di identificare le molecole che sono necessarie per un destino autonomamente espressa. Per analizzare il destino della espianto, identificazione di specifici tipi cellulari possono essere eseguite da espressione genica standard (ad esempio, ibridazione in situ, RT-PCR) e saggi di immunocitochimica. Questo protocollo fornisce un semplice, ma potente, modo di distinguere tra i meccanismi intrinseci ed estrinseci che regolano una cellula embrionale si sviluppa nei tessuti specifici.

Protocollo

1. Preparazione di terreni di coltura, strumenti e piatti

1. Contrasta con quattro pinze Alumina pellicola abrasiva. Fate questo sotto un microscopio da dissezione per monitorare la grandezza della punta. Una coppia di pinze serve come back-up in caso di una punta è danneggiata durante la procedura. Autoclavare tutte e quattro le pinze e conservare in un contenitore sterile.
2. Fai 500 ml ciascuna di terreno di coltura e di 0,1 X. 1.0X (sia di Marc Ringers Modified [MMR] o modifica di Barth Saline [MBS], ricette in ¹⁵⁾ e filtro sterilizzare. Noi abitualmente uso MBS (1X = 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 0,7 mM CaCl _2, 1 mM _MgSO4, 5 mM HEPES [pH 7,8], 2.5 mM NaHCO _3). Conservare a 14-18 ° C per mesi.
3. Fare una soluzione al 2% di agarosio in mezzo di coltura (2 g elettroforesi agarosio in 100 ml 1X mezzo di coltura in una bottiglia di vetro con tappo a vite). Autoclave per sciogliere agarosio. Questo può essere conservato a 4 ° C per mesi, e scaldati per liquefare il agarosio quando è necessario successivo.
4. Mentre l'agarosio è liquido, versare circa 0,5 ml sul fondo di ciascun pozzetto di una sterile 24-pozzetti cultura. Questo impedisce l'espianti di attaccarsi alla plastica.
5. Mentre l'agarosio è liquido, versare circa 2-3 ml sul fondo di due o tre piatti di 60 millimetri Petri, e agitare delicatamente per assicurarsi che il fondo è coperto. Questi risultati serviranno come piatti dissezione e l'agarosio embrioni impedisce di attaccarsi alla plastica una volta che le loro membrane vengono rimossi.
6. Quando l'agarosio si è raffreddato e indurito, fiamma la punta di un 6 "pipetta Pasteur finché non si scioglie in un pallone, e leggermente toccare la superficie del agarosio in ciascun pozzetto della piastra di coltura. Ciò creerà una depressione poco profonda in cui l'espianto sarà posto.
7. Riempire ogni pozzetto della piastra di coltura con terreno di coltura 1X sterile.
8. Quando l'agarosio si è raffreddato e indurito, riempire il piatto dissezione con terreno di coltura diluita (0,1 X. MMR o 0.1X MBS) per facilitare la separazione blastomeri.

2. Selezione degli embrioni

1. Ottenere uova fecondate e rimuovere la gelatina cappotti secondo protocolli standard ^15. Trasferirli 0.5X mezzo di coltura in una capsula di Petri 100 millimetri.
2. Quando raggiungono embrioni di 2 cellule stadio, ordinare quelli in cui il solco prima segmentazione biseca l'area leggermente pigmentata nell'emisfero animale (Figura 1) in una piastra separata. Questi saranno i donatori per gli espianti. Tenere le restanti 2-cellule di embrioni in un piatto a parte accanto agli embrioni donatori durante l'intera procedura di servire come controlli di pari livello per mettere in scena gli espianti.

3. Preparazione di espianti

1. Posizionare embrioni 5-10 in un piatto dissezione, ma solo lavorare su un embrione alla volta.
2. Posizionare il primo embrione così la membrana vitellina trasparente può essere visto, è separato da uno spazio libero (spazio perivitellino) sopra la superficie del polo animale dell'embrione. Utilizzando una forza affilataps in mano sottodominante (mano sinistra se si è di mano destra), afferrare la membrana vitellina sopra lo spazio perivitellino. Utilizzando una pinza affilate con l'altra mano, afferrare la membrana vicino alla prima punta pinze, e tirare delicatamente in direzioni opposte a sbucciare la membrana di distanza. Effettuare la presa iniziale ad una distanza dalla cella che deve essere sezionato, in modo che la cellula bersaglio non sia danneggiata durante la rimozione della membrana. Si può dire che la membrana è stato rimosso perché l'embrione si appiattisce.
3. Afferrare una cella confinante con la pinza in mano sottodominante e utilizzare questa cella come "maniglia" così la cella da dissezionare non è direttamente toccata. Con la pinza in altra parte, tirare delicatamente le cellule rimanenti vicine dal blastomero desiderato. Se le cellule della linea mediana, che condividono lo stesso destino, sono mirati, possono essere rimossi insieme come una coppia. Infine, sezionare via la cella "maniglia".
4. Sollevare il blastomero (o coppia di blastomeri), con una sterile, Vetro pipetta Pasteur, evitando bolle d'aria e di aspirazione eccessiva. La pipetta può essere il fuoco lucidato per eliminare spigoli vivi che possono danneggiare la cellula, ma non di routine farlo. Posizionare la punta della pipetta Pasteur sotto la superficie del terreno di coltura in un pozzetto della piastra di coltura espianto, e delicatamente espellere il blastomero. Dovrebbe scivolare nella depressione poco profonda per gravità. Blastomero stesso da più di un embrione possono essere combinati in un unico espianto.
5. Ripetere questa procedura con embrioni rimanenti nel piatto dissezione, uno per uno. Dopo circa 10 embrioni, il piatto dissezione sarà riempita di detriti cellulari. In questo caso, passare a un piatto dissezione fresco.
6. Dopo che tutte le dissezioni sono fatti, verificare se gli espianti sono nelle depressioni poco profonde. Se non, possono essere delicatamente spinto nella depressione con un'ansa capelli che è stato sterilizzato in etanolo 70% ed essiccato all'aria.
7. Circa un'ora dopo l'ultima dissezione, rimuovere i detriti surrounding espianti guarite con una sterile, vetro pipetta Pasteur.
8. Cultura il piatto di espianti a 14-20 ° C vicino alla piastra Petri contenente il fratello, gli embrioni di controllo. Embrioni Sibling indica lo stadio di sviluppo degli espianti blastomeri.

4. Espianti raccolta per l'analisi

1. Raccogliere gli espianti quando i fratelli raggiungono la fase di sviluppo desiderato. Questi espianti sopravvivere abbastanza bene anche se alcune delle cellule disintegrarsi. Pertanto, se vi è una massa nuvoloso cultura bene, esplorare con un'ansa capelli o pinze per determinare se un espianto sano è sepolto all'interno.
2. Raccogliere espianti in un piccolo volume di soluzione di coltura con una pipetta Pasteur di vetro, e delicatamente espellerli in un tampone di lisi o fissativo appropriato per il saggio sia condotto.

Risultati

La capacità di questo test per valutare con precisione il potenziale di sviluppo della cellula si basa su sezionando il blastomero corretta in base al destino mappe ^{1, 2, 3, 4, 5, 6.} Pertanto, è fondamentale scegliere embrioni con il pattern pigmentazione corrette al 2-cellula fase, come illustrato nella figura 1, che successivamente sono conformi ai modelli di scissione regolari, come illustrato nella figura 2. Se si osservano gli embrioni classificate come non giungono al...

Discussione

Le fasi più critiche per la coltivazione di successo di singoli blastomeri sono: 1) identificare correttamente il blastomero di interesse; 2) il mantenimento di una sterile, sana cultura; 3) le cellule dissezione presso la parte corretta del ciclo cellulare e 4) a sviluppare la manualità necessaria destrezza per evitare danni durante la dissezione e trasferire alla cultura bene.

Per manipolare blastomeri specifici, è essenziale essere in grado di identificare gli assi cardinali. In embrio...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo	Commenti (opzionale)
Alumina pellicola abrasiva	Thomas Scientific	# 6775E-38	Corso (12 micron), per riparazioni importanti consigli di forcipe
Alumina pellicola abrasiva	Thomas Scientific	# 6775E-46	Medio (3 micron), per fini affilatura di punte Pinza
Alumina pellicola abrasiva	Thomas Scientific	# 6775E-54	Fine (0,3 micron), per la lucidatura di punte Pinza
Pinza: Dumont, Dumoxel Biologie # 5	Strumenti Scienza Belle	# 11252-30	Questi hanno le punte sottili che non hanno bisogno di affilatura al primo acquisto. Resistente alla corrosione in modo che possanoessere sterilizzati in autoclave.
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