Explantes blastômero para testar Compromisso destino celular durante o desenvolvimento embrionário

Resumo

O destino de uma célula individual embrionário pode ser influenciado por moléculas hereditárias e / ou por sinais de células vizinhas. Utilizando mapas destino da clivagem embrionária fase Xenopus, blastômeros individuais podem ser identificados para a cultura de isolamento para avaliar as contribuições de moléculas herdados contra interações célula-célula.

Resumo

Mapas de destino, construídos a partir da linhagem de rastreamento de todas as células de um embrião, revelam que os tecidos descendem de cada célula do embrião. Embora os mapas destino são muito úteis para a identificação de precursores de um órgão e para elucidar o caminho de desenvolvimento pelo qual as células descendentes povoar o órgão do embrião normal, não ilustram o potencial de desenvolvimento de uma célula precursora ou identificar os mecanismos pelos quais seu destino é determinado. Para testar compromisso destino da célula, se compara repertório normal de uma célula de descendentes no embrião intacto (o mapa destino) com os indicados depois de uma manipulação experimental. É o destino da célula fixo (comprometido), independentemente do meio ambiente celular, ou é influenciada por fatores externos prestados por seus vizinhos? Usando os mapas destino abrangentes do embrião de Xenopus, descrevemos como identificar, isolar e cultura precursores de estágio único de clivagem, chamado Blastomeres. Esta abordagem permite avaliar se estas células iniciais estão comprometidos com o destino que elas adquirem no seu meio ambiente normal em que o embrião intacto, requerem interacções com as suas células vizinhas, ou pode ser influenciada para expressar destinos alternativos, se forem expostos a outros tipos de sinais.

Introdução

Embriões de Xenopus laevis foram utilizados extensivamente para identificar os mecanismos pelos quais as células embrionárias adquirem os seus destinos específicos, porque os ovos são suficientemente grandes para permitir que as abordagens de microcirurgia. Além disso, desenvolvem-se externamente, sem a necessidade de suplementação nutricional do meio de cultura uma vez que cada célula contém uma fonte rica intracelular de plaquetas gema que proporcionam um armazenamento de energia intrínseca. Um trunfo importante para o estudo dos mecanismos pelos quais o destino da célula é determinado é o conjunto completo de mapas destino dos blastômeros estágio de clivagem (de 2 a 32 - de células-estágios) ^{1, 2, 3, 4, 5, 6.} Estes mapas foram construídos por microinjecting uma molécula detectável em um blastômero, único de identificação e monitoramento mais tarde no desenvolvimento que os tecidos são preenchidos pela descendência rotulados. Mapas destino consistentes são possíveis porque os eixos fundamentais de os embriões podem ser identificados de forma confiável em muitos embryOS. Em primeiro lugar, em todos os embriões de tipo selvagem para o hemisfério animal é pigmentada, enquanto que o hemisfério vegetal não é. Em segundo lugar, a entrada do esperma no momento da fertilização provoca uma contracção da pigmentação hemisfério animal para o lado ventral futuro, em muitos embriões diferença pigmentação, portanto, pode ser utilizado para discriminar entre os lados dorsal e ventral. Em terceiro lugar, o sulco de clivagem primeiro se aproxima do plano sagital mediano na maioria dos embriões, e portanto, pode ser usado para identificar os lados direito e esquerdo do embrião. Os mapas destino também confiar no fato de que, naturalmente, ovos fertilizados freqüentemente apegar em padrões regulares que fazem cada blastômero identificável através de uma grande população de embriões. Enquanto existe variabilidade dentro e entre garras de ovos quanto aos padrões de pigmentação e clivagem, utilizando procedimentos de selecção descrito aqui permite que as células com destino prescritos para ser identificado com cerca de 90% de precisão.

Destinos celulares podem ser determinadas durante a embriogênese através de vários mecanismos. Fatores intrínsecos, como diferencialmente herdados mRNAs citoplasmáticos ou proteínas, contribuem para vários aspectos de padronização cedo. Por exemplo, os mRNAs específicos maternos determinar quais as células que contribuem para a linha germinal, tornar-se a endoderme, ou contribuir para o eixo do corpo dorsal (revisto em ^7). Factores extrínsecos fornecidos localmente por células vizinhas ou mais distante do centro de uma sinalização embrionária, são responsáveis ​​pela indução de tipos específicos de tecidos e padronização do sistema de quase todos os órgãos. Exemplos de centros de sinalização incluem o organizador / nó na gástrula que induz o ectoderma neural e padrões da mesoderme, e da zona de polarização atividade que os padrões do eixo ântero-posterior do botão do membro. Embora os mapas destino identificar os precursores dos diferentes órgãos e revelar o caminho do desenvolvimento tomadas pelos seus descendentes no embrião normal, eles não conseguem distinguir entre intrínsecae influências extrínsecas sobre essas células. Eles também não revelam de todo o potencial de desenvolvimento de uma célula, cujos descendentes diferenciar no ambiente complexo de sinalização do embrião. Duas abordagens experimentais pode testar se o destino de uma célula é determinada por factores intrínsecos ou seja posteriormente influenciado por factores externos: 1) transplantação de células para um local novo no embrião, ou 2) a remoção da célula a partir do embrião seguido por cultura em ausência de sinais exógenos.

Ambas as abordagens experimentais têm sido viável em Xenopus, porque as células são suficientemente grandes para serem separadas manualmente. Por exemplo, vários estudos têm excluído células individuais de embriões (para mudar interações célula-célula) ou células transplantadas para locais novos, em embriões de acolhimento para testar mudanças Fate (revisada em ^{7, 8, 9).} Além disso, a segunda abordagem da explantar pequeno número de células a partir de diferentes regiões do embrião into cultura para elucidar as interacções indutivas tecido na ausência de factores exógenos é possível porque as células do embrião de Xenopus são preenchidos com um armazenamento intracelular de nutrientes, as plaquetas da gema. Portanto, elas podem ser cultivadas durante alguns dias em um meio de sal definido sem suplementação nutricional ou factor de crescimento do meio de cultura. Nós temos usado essa abordagem para mostrar que blastômeros animais dorsal tem uma capacidade autônoma de produzir tecidos neurais e dorsal mesodérmicas devido a mRNAs herdada da mãe ^{10, 11,} e outros mostraram que a especificação mesoderma de 32 celulares blastômeros depende tanto informações intrínsecas e extrínsecas ¹² . Uma vantagem da cultura de células como explantes é que o meio pode ser suplementado com factores definidos de sinalização a fim de determinar qual a célula-a-célula via de comunicação pode influenciar o destino das células explantadas ^{12, 13, 14.} Além disso, pode-se injetar o pr blastômeroior a cultura com mRNA para sobre-expressar um gene, ou com oligonucleotídeos anti-senso para evitar a tradução de mRNAs endógenos. Estes, ganho e perda de função-análises podem identificar quais as moléculas são necessários para um destino autonomamente expressa. Para a análise do destino do explante, a identificação de tipos específicos de células pode ser realizada por expressão de genes padrão (por exemplo, hibridação in situ, RT-PCR) e ensaios imunocitoquímicos. Este protocolo fornece um simples, mas poderoso maneira, a distinção entre mecanismos intrínsecos e extrínsecos que regulam como uma célula embrionária se desenvolve em tecidos específicos.

Protocolo

1. Preparação de instrumentos, meios de cultura e pratos

1. Afie quatro pinças utilizando filme abrasivo Alumina. Fazer isso sob um microscópio de dissecação para monitorar o tamanho da ponta. Um par de fórceps serve como um back-up no caso de uma dica é danificado durante o procedimento. Autoclave as quatro pinças e armazenar em um recipiente estéril.
2. Faça 500 ml cada de meio de cultura 0,1 X 1,0 X e (ou Modificação de Marc Ringers [MMR] ou salinos Modificado Barth [MBS]; receitas em ¹⁵⁾ e filtro de esterilizar. Rotineiramente utilizar MBS (1X = 88 mM de NaCl, 1 mM KCl, 0,7 mM _CaCl2, 1 mM _MgSO4, HEPES 5 mM [pH 7,8], 2,5 mM _de NaHCO3). Guarde-o em 14-18 ° C por meses.
3. Fazer uma solução de 2% de agarose num meio de cultura (2 g de electroforese de agarose de grau em 100 ml de 1X meio de cultura num frasco de vidro com tampa de rosca). Autoclavar para dissolver agarose. Este pode ser armazenado a 4 ° C, durante meses, e microondas para liquefazer a agarose quando é necessário seguinte.
4. Enquanto a agarose é líquido, despeje cerca de 0,5 ml para o fundo de cada poço de uma placa de cultura estéril de 24 poços. Isso vai impedir que os explantes de furar para o plástico.
5. Enquanto a agarose é líquido, derrame aproximadamente 2-3 ml para o fundo de dois a três pratos de Petri 60 milímetros, e agite cuidadosamente para garantir que a parte inferior é coberto. Estes servirão como pratos de dissecção eo agarose impede embriões de degola para o plástico uma vez que suas membranas são removidas.
6. Quando a agarose tiver arrefecido e endurecido, chama a ponta de uma 6 "pipeta Pasteur até que se funde com uma bola, e ligeiramente tocar na superfície da agarose em cada poço da placa de cultura. Isto vai criar uma depressão pouco profunda em que o explante será colocado.
7. Encher cada poço da placa de cultura com meio de cultura estéril 1X.
8. Quando a agarose tiver arrefecido e endurecido, encher o prato de dissecação com meio de cultura diluído (0,1 X 0,1 X MMR ou MBS) para facilitar a separação de blastómeros.

2. Selecção de Embriões

1. Obtenção de ovos fertilizados e remover o revestimento de acordo com protocolos de geléia padrão ^15. Transferi-los para meio de cultura de 0,5 X 100 numa placa de Petri mm.
2. Quando os embriões atingem o estágio de 2 células, classificar aqueles em que o sulco de clivagem primeiro corta a área levemente pigmentados no hemisfério animal (Figura 1) para uma placa separada. Estes serão os doadores para os explantes. Manter os restantes dois embriões de células em um prato separado ao lado dos embriões de dadores de todo o procedimento para servir como controlos para a fase de irmãos explantes.

3. Preparação de Explantes

1. Colocar 5-10 embriões numa placa de dissecação, mas funcionam apenas com um embrião de uma vez.
2. Posicionar o primeiro embrião de modo a membrana vitelina transparente pode ser visto, que é separado por um espaço livre (espaço perivitelino) acima da superfície do pólo animal do embrião. Usando uma força afiadaps na mão subdominante (mão esquerda se for destro), segure a membrana vitelina acima do espaço perivitelino. Usando uma pinça afiada na outra mão, segure a membrana próxima à ponta fórceps primeiro, e puxe em direções opostas para descascar a membrana de distância. Fazer o aperto inicial, a uma distância a partir da célula que está a ser dissecado, de modo que a célula alvo não é danificada durante a remoção da membrana. Pode-se dizer que a membrana foi removido porque o embrião vai achatar.
3. Pegue uma célula vizinha com a pinça na mão subdominante e usar esse celular como uma "alça" para a célula a ser dissecado não está diretamente tocado. Com a pinça na outra mão, puxe as restantes células vizinhas para longe do blastômero desejado. Se as células da linha média, que compartilham o mesmo destino, são alvo, eles podem ser removidos em conjunto, como um par. Finalmente, dissecar afastado a "alça" da célula.
4. Pegue o blastômero (ou par blastômero), com uma estéril, Pipetas de Pasteur de vidro, evitando bolhas de ar e sucção excessiva. A pipeta pode ser fogo-polido para remover bordas cortantes que podem danificar o celular, mas não rotineiramente fazer isso. Colocar a ponta da pipeta de Pasteur sob a superfície do meio de cultura numa cavidade da placa de cultura de explante e suavemente expelir o blastómeros. Ele deve deslizar na depressão rasa pela gravidade. O blastômero mesmo a partir de mais do que um embrião podem ser combinados em um único explante.
5. Repetir este procedimento com os embriões restantes no prato dissecção, uma-a-uma. Depois de cerca de 10 embriões, o prato de dissecação será preenchido com resíduos celulares. Quando isso ocorre, mudar para um prato de dissecação fresco.
6. Depois de todas as dissecções são feito, verifique se os explantes estão nas depressões rasas. Caso contrário, eles podem ser suavemente empurrado para dentro da depressão com um laço de cabelo que foi esterilizada com etanol a 70% e seco ao ar.
7. Cerca de uma hora após a dissecção passado, remover detritos surrounding explantes curadas com uma estéril, vidro Pasteur pipeta.
8. A placa de cultura de explantes em 14-20 ° C ao lado da placa de Petri contendo o irmão, embriões de controlo. Embriões irmãos vai indicar o estado de desenvolvimento dos explantes de blastómeros.

4. Explantes de colheita de Análise

1. Colher os explantes quando os irmãos atingir o estágio desejado desenvolvimento. Estes explantes sobreviver muito bem, mesmo que algumas das células se desintegram. Por isso, se existe uma massa turva no poço de cultura, explorar com uma malha de cabelo ou uma pinça para determinar se um explante saudável é enterrado no interior.
2. Pegar explantes em um pequeno volume da solução de cultura com uma pipeta de Pasteur de vidro, e gentilmente expeli-los para um tampão de lise adequado, ou fixador para o ensaio a ser realizado.

Resultados

A capacidade deste ensaio para avaliar com precisão a potencial de desenvolvimento das células baseia-se dissecando a blastômero correcta com base no destino de mapas ^{1, 2, 3, 4, 5, 6.} Portanto, é importante escolher os embriões com o padrão de pigmentação correcta na fase 2-célula, como se ilustra na Figura 1, que, posteriormente, em conformidade com padrões de clivagem regulares, conforme ilustrado na Figura 2. Se uma observa os embriões classificadas como chegar...

Discussão

Os passos mais críticos para a cultura bem sucedida de blastômeros individuais são os seguintes: 1) identificar correctamente o blastômero de interesse e 2) manutenção de uma cultura estéril e saudável, 3) as células de dissecação na parte correcta do ciclo celular, e 4) o desenvolvimento do Manual necessário destreza para evitar danos durante a dissecção e transferir para a cultura também.

Para manipular blastómeros específicos, é essencial ser capaz de identificar os eixo...

Materiais

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Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários (opcional)
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