Бластомеров эксплантов для тестирования для сотовых приверженности судьбы во время эмбрионального развития

Резюме

Судьба отдельных эмбриональные клетки может быть под влиянием унаследованного молекул и / или сигналов от соседних клеток. Используя судьба карты расщепления зародыше Xenopus, одной бластомеры могут быть определены для культуры в изоляции для оценки вклада наследственных молекул по сравнению с межклеточных взаимодействий.

Аннотация

Судьба карт, построенных по линии отслеживания всех клеток эмбриона, выявить, какие ткани происходят от каждой клетки эмбриона. Хотя судьба карт очень полезны для выявления предвестников органа и для выяснения развитии путь, по которому потомки клеток заполнения этого органа в нормальном эмбрионе, они не иллюстрируют полное развитие потенциала клеток-предшественников или определить механизмы, с помощью которых его судьба определяется. Для проверки ячейки обязательства судьбы, сравнить нормального репертуара клетки потомков в интактных эмбрионов (судьба карте) с теми, выраженное после экспериментальных манипуляций. Это судьба ячейки фиксированной (совершенные) независимо от окружающей среды сотовый, или это зависит от внешних факторов, предоставленных его соседей? Используя подробные карты судьбы эмбрионов Xenopus, мы расскажем, как выявление, изоляция и культуре одного прекурсоров стадии дробления, называют BlastoМерес. Такой подход позволяет оценить, являются ли эти ранние клетки полны решимости судьбы они приобретают в их обычной среде в неповрежденной эмбриона, требующих взаимодействия с соседними клетками, или можно влиять, чтобы выразить альтернативные судьбы при соприкосновении с другими типами сигналов.

Введение

Xenopus Хепориз эмбрионов были использованы широко определить механизмы, с помощью которых эмбриональные клетки приобретают их конкретными судьбами, потому что их яйца являются достаточно большими, чтобы позволить микрохирургического подхода. Кроме того, они развиваются внешне без необходимости использования пищевых добавок в культуральной среде, потому что каждая клетка содержит богатый внутриклеточного питания тромбоцитов желток, которые обеспечивают внутренний запас энергии. Важным преимуществом для изучения механизмов, посредством которых клетки судьбу определяют это полный набор карт судьбы бластомеров на стадии дробления (от 2 - до 32-клеточной стадии) ^{1, 2, 3, 4, 5, 6.} Эти карты были построены microinjecting обнаружены молекулы в одну, идентифицируемые бластомеров и контроль позднее в развитие которого тканей населенных меченых потомства. В соответствии Карты судьбы возможны, потому что кардинальных осей эмбрионы могут быть надежно выявлены во многих ЭмбриОС. Во-первых, во всех эмбрионов дикого типа животных полушария пигментированные, в то время вегетативного полушария не является. Во-вторых, вступление сперма при оплодотворении вызывает сокращение пигментации животных полушария в будущее брюшной стороны, во многих эмбрионов пигментации разницы, следовательно, может быть использована для различия между спинной и брюшной сторон. В-третьих, первой борозды дробления приближается к середине сагиттальной плоскости в большинстве эмбрионов, и, следовательно, может быть использована для определения правой и левой сторон эмбриона. Судьба карты также рассчитывать на то, что, естественно оплодотворенные яйца часто расщепляют в закономерности, которые делают каждого бластомеров идентифицируемые по большому населения эмбрионов. В то время как изменчивость внутри и между кладки яиц в отношении пигментации и расщепление моделей, с использованием процедур отбора, описанные здесь позволяет клеткам с заданными судьбы должны быть определены с 90% точностью.

Сотовые судьбы может быть определенадобываются во время эмбриогенеза несколько механизмов. Внутренние факторы, такие как дифференциально унаследовал цитоплазматических мРНК или белков, способствуют некоторые аспекты раннего паттерна. Например, конкретных материнских мРНК определить, какие клетки будут способствовать зародышевой линии, становятся энтодермы, или вклад в спинной оси тела (обзор ^7). Внешние факторы при условии, локально соседними клетками или более отдаленно от центра эмбриональных сигнализации, несут ответственность за склонение конкретные типы тканей и структурирование почти каждый орган системы. Примеры сигнализации центры включают в себя организатором / узел в гаструлы, что вызывает нервные эктодермы и мезодермы моделей, и в зоне поляризующей активности, что модели передне-задней оси конечности почки. Хотя судьба карты выявления предвестников различных органов и выявить пути развития, принятых их потомков в нормальный эмбрион, они не могут различать внутреннююи внешние воздействия на эти клетки. Они также не раскрывают полный потенциал развития клетки, чьи потомки дифференцироваться в комплексе сигнальную среду эмбриона. Два экспериментальных подходов можете проверить судьбу клетки определяется внутренним факторам или в дальнейшем под влиянием внешних факторов: 1) трансплантации клетки к новому расположению в зародыше, или 2) удаление клеток из эмбрионов последующей культуры в отсутствие экзогенных сигналов.

Оба экспериментальных подходов было возможно в Xenopus, потому что клетки являются достаточно большими, чтобы вручную разделить. Например, многочисленные исследования были удалены отдельные клетки из эмбрионов (для изменения межклеточных взаимодействий) или пересаженных клеток к новым мест в принимающих эмбрионы, чтобы проверить на судьбу изменения (обзор в ^{7, 8, 9).} Кроме того, второй подход культивирующий в искусственной среде небольшого числа клеток из различных регионов эмбриона яNto культуры выяснить индуктивных взаимодействий ткани в отсутствие внешних факторов, возможно потому, что клетки эмбрионов Xenopus заполнены внутриклеточных питательных магазине, желток тромбоцитов. Таким образом, они могут быть культивировали в течение нескольких дней в определенный солевой среде без питания или добавок фактор роста питательной среды. Мы использовали этот подход, чтобы показать, что спинной бластомеров животных имеют автономную способность производить нервные и спинного мезодермальных тканей из-за наследуется по материнской мРНК, ^{10, 11,} и другие показали, что мезодерма спецификации 32-клетки бластомеры зависит как от внутренней и внешней информации ¹² . Преимущество культивирования клеток в качестве эксплантов в том, что среда также может быть дополнен с определенными факторами сигнализации чтобы определить, какие клетки к клетке канал связи может повлиять на судьбу эксплантированных ячейки ^{12, 13, 14.} Кроме того, можно вводить бластомеров пр.IOR к культуре с мРНК более-экспресс ген, или с антисмысловые олигонуклеотиды, чтобы предотвратить перевод эндогенной мРНК. Эти, усиления и потерей функции анализа можно определить, какие молекулы, необходимые для автономного выразил судьба. Для анализа судьбы эксплантов, выявление специфических типов клеток может быть выполнена стандартная экспрессии генов (например, в гибридизация, RT-PCR) и иммуноцитохимических анализов. Этот протокол обеспечивает простой, но мощный, способ различать внутренние и внешние механизмы, которые регулируют как эмбриональная клетка развивается в определенных тканях.

протокол

1. Подготовка инструментов, культура, СМИ и посуда

1. Резкость четыре щипцы использованием глинозема абразивной пленкой. Делайте это под рассекает микроскопом, чтобы контролировать размер чаевых. Одна пара щипцов служит в качестве резервного в случае, если наконечник поврежден во время процедуры. Автоклав все четыре щипцы и хранить в стерильный контейнер.
2. Сделать 500 мл каждая из 0,1 X 1,0 X и культуральной среде (либо Марка изменения Ringers [MMR] или изменения Барта Saline [MBS]; рецептов в ¹⁵⁾ и фильтр стерилизуют. Мы регулярно использовать MBS (1X = 88 мм NaCl, 1 мМ KCl, 0,7 мМ CaCl _2, 1 мМ MgSO _4, 5 мМ HEPES [рН 7,8], 2,5 мМ NaHCO _3). Хранить при температуре 14-18 ° С в течение месяца.
3. Сделайте 2% агарозном решение в культуральной среде (2 г электрофореза в агарозном класса в 100 мл 1X культуральной среде в стеклянной бутылке колпачок). Автоклав для растворения агарозы. Это можно хранить при температуре 4 ° C в течение нескольких месяцев, и микроволновой печи для разжижения агарозы, когда она необходима следующая.
4. В то время как агарозы является жидкость, влить около 0,5 мл на дно каждой лунки стерильного 24-а культура пластины. Это позволит предотвратить эксплантов от прилипания к пластику.
5. В то время как агарозы является жидкость, влить около 2-3 мл на дно в два-три 60 мм чашки Петри, и вихрем осторожно, чтобы убедиться, что дно покрыто. Они будут служить рассечение блюд и агарозы предотвращает эмбрионов от прилипания к пластиковым раз их мембраны удаляются.
6. Когда агарозном остыл и затвердел, пламя кончиком 6 "пипетки Пастера, пока он тает в мяч, и слегка прикоснуться к ней на поверхность агарозы в каждую лунку культуры пластины. Это создаст небольшое углубление, в которое эксплантов будет размещен.
7. Заполните каждую лунку культуры пластина с 1X стерильную питательную среду.
8. Когда агарозном остыл и затвердел, заполните рассечение блюдо с разбавленным культуральной среде (0,1 X 0,1 X MMR или MBS), чтобы облегчить разделение бластомеров.

2. Отбор эмбрионов

1. Получить оплодотворенных яиц и удалить желе слоями в соответствии со стандартными протоколами ^15. Передача их 0.5X культуральной среде в 100 мм блюдо Петри.
2. Когда эмбрионы достигают 2-клеточной стадии, отсортировать те, в которых первая борозда дробления делит слегка пигментированные области, в животном полушария (рис. 1) в отдельную посуду. Это будут донорами для эксплантов. Храните оставшиеся 2-клетки эмбрионов в отдельном блюде рядом с донорами эмбрионов в течение всей процедуры, чтобы служить брата управления на сцену эксплантов.

3. Подготовка Экспланты

1. Поместите 5-10 эмбрионов в рассечение блюдо, но работают только на одного эмбриона за один раз.
2. Расположите первый эмбрион так прозрачная мембрана желточного видно, он отделен свободное пространство (перивителлиновое пространства) над поверхностью животных полюсе эмбриона. Использование заостренным силуPS В свое субдоминанты руки (левая рука, если он правша), возьмитесь за желточной мембраны выше перивителлинового пространства. Использование заостренные щипцы, с другой стороны, понять мембраны близка к первой кончик пинцетом и аккуратно потяните в разные стороны, чтобы очистить от мембраны. Сделать начальное понимание на расстоянии от ячейки, в которой должны быть расчленены, так что клетки-мишени не поврежден во время удаления мембраны. Можно сказать, что мембрана была удалена, потому что эмбрион будет сглаживаться.
3. Захватите одну соседнюю клетку с пинцетом в руке субдоминанты и использовать эту клетку в качестве "ручки", так что клетки должны быть расчлененным напрямую не коснулся. С щипцами, с другой стороны, осторожно потяните оставшиеся соседние клетки от желаемого бластомеров. Если средняя линия клеток, которая постигла та же участь, целенаправленны, они могут быть удалены вместе, как пара. И, наконец, рассекают от «ручки» клетки.
4. Возьмите бластомеров (или бластомеров пара), стерильной, Стекло пипетки Пастера, избегая пузырьков воздуха и чрезмерное всасывание. Пипетки может быть огневой полировкой для удаления острых краев, которые могут повредить клетки, но мы обычно не делаем этого. Поместите кончик пипетки Пастера под поверхностью культуральной среды в хорошо эксплантата блюдо культуры и аккуратно высылать бластомеров. Он должен скользить в небольшое углубление под действием силы тяжести. То же самое бластомеров из более чем одного эмбриона могут быть объединены в одну эксплантов.
5. Повторите эту процедуру с остальными эмбрионов в рассечение блюдо, один-на-один. После примерно 10 эмбрионов, рассечение блюдо будет наполнено сотовой мусора. Когда это произойдет, изменится к новому блюду рассечение.
6. После всех вскрытий сделано, проверьте эксплантов в неглубоких депрессиях. Если нет, то они могут быть слегка толкнул в депрессию с волосами цикла, который был стерилизован в 70% этанола и сушат на воздухе.
7. Примерно через час после последнего вскрытия, удаления мусора surrouнахождении исцелил эксплантов с стерильная, стекло пипетки Пастера.
8. Культура пластины эксплантов на 14-20 ° C, рядом с чашки Петри, содержащие брат, контрольных эмбрионов. Родного брата эмбрионов будет означать этап развития бластомеров эксплантов.

4. Уборочная эксплантов для анализа

1. Урожай эксплантов, когда братья и сестры достижения желаемой стадии развития. Эти эксплантов выжить очень хорошо, даже если некоторые клетки разрушаются. Поэтому, если есть облачно массы в культуре хорошо, исследовать его с петлей волос или щипцов для определения здорового эксплантов похоронен внутри.
2. Возьмите эксплантов в небольшом объеме культуры решением со стеклянной пипетки Пастера и аккуратно удалить их в фиксаторе или буфер для лизиса подходят для анализа, которые будут проводиться.

Результаты

Способность этого анализа, чтобы точно оценить потенциал развития клетки опирается на рассекающих из правильных бластомеров основан на судьбе ^{1 карт, 2, 3, 4, 5, 6.} Поэтому, очень важно выбрать эмбрионов с правильной картины пигментации на 2-клеточной стадии, как показано на рисун?...

Обсуждение

Наиболее важных шагов для успешного культивирования отдельных бластомеров являются: 1) правильность определения бластомеров интересов; 2) поддержание стерильной, здоровой культуры, 3) рассекает клеток при правильной частью клеточного цикла и 4) разработку необходимых руководства ловк?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер в каталоге	Комментарии (по желанию)
Alumina абразивных фильм	Томас Научные	# 6775E-38	Курс (12 мкм), на капитальный ремонт советы щипцы
Alumina абразивных фильм	Томас Научные	# 6775E-46	Средний (3 мкм), для тонкой заточки наконечников щипцов
Alumina абразивных фильм	Томас Научные	# 6775E-54	Изобразительное (0,3 мкм), для полировки наконечников щипцов
Пинцет: Дюмон, Dumoxel Biologie № 5	Средства изобразительных наук	# 11252-30	Они имеют тонкую советов, которые не требуют заточки, когда впервые купил. Коррозионной устойчивостью, чтобы они моглив автоклаве.
Гентамицин решения	Сигма	G1397	Добавить в среде на тот же день, как использование