Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Protocol
  • Discussion
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نحن هنا لشرح كيفية مختبرنا يتجمد الأشكال الجذعية الجنينية خطوط الخلايا البشرية.

Abstract

نحن هنا لشرح كيفية مختبرنا يتجمد الأشكال الجذعية الجنينية خطوط الخلايا البشرية. يتم غسلها وصحية ، والثقافة ، بشكل كبير ، مع التوسع في برنامج تلفزيوني لإزالة بقايا وسائل الاعلام التي يمكن أن يشفي إلا رد فعل التربسين. ثم يتم إضافة تحسنت 0.05 ٪ التربسين - EDTA لتغطية الخلايا ، وسمح لوحة لاحتضان لمدة تصل إلى 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ويمكن خلال هذا الوقت لوحظ أن الخلايا التقريب ، ومستعمرات رفع قبالة سطح اللوحة. وسوف تتكرر لطيف pipetting إزالة الخلايا والمستعمرات من سطح اللوحة. وتوضع الخلايا في Trypsinized أنبوب مخروطي القياسية التي تتضمن وسائل الاعلام قبل تحسنت الخلية HES لإرواء التربسين المتبقية ، ونسج ذلك الحين. معلق الخلايا هي وسائط النمو في تركيز حوالي مليون الخلايا في واحد مل من وسائل الإعلام ، والتركيز مثل أن أحد قسامة المجمدة تكفي لإحياء ثقافة على طبق من 10cm. بعد بشكل كاف معلق الخلايا ، يتم إضافة وسائل الاعلام الجليد تجميد الباردة في حجم متساوية. تختلط الايقاف الخلية بدقة ، aliquoted الى تجميد قارورة ، وسمح لتجميد ببطء إلى 80C على مدى 24 ساعة. يمكن تجميد الخلايا ثم انتقلت إلى مرحلة بخار النيتروجين السائل للتخزين على المدى الطويل ، أو البقاء في -80 لنحو ستة أشهر.

Protocol

  1. يتم غسلها وصحية ، والثقافة ، بشكل كبير ، مع التوسع في برنامج تلفزيوني لإزالة بقايا وسائل الاعلام التي يمكن أن يشفي إلا رد فعل التربسين.
  2. ثم يتم إضافة تحسنت 0.05 ٪ التربسين - EDTA لتغطية الخلايا ، وسمح لوحة لاحتضان لمدة تصل إلى 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ويمكن خلال هذا الوقت لوحظ أن الخلايا التقريب ، ومستعمرات رفع قبالة سطح اللوحة.
  3. وسوف تتكرر لطيف pipetting إزالة الخلايا والمستعمرات من سطح اللوحة.
  4. وتوضع الخلايا في Trypsinized أنبوب مخروطي القياسية التي تتضمن وسائل الاعلام قبل تحسنت الخلية HES لإرواء التربسين المتبقية ، ونسج ذلك الحين.
  5. معلق الخلايا هي وسائط النمو في تركيز حوالي مليون الخلايا في واحد مل من وسائل الإعلام.
  6. بعد بشكل كاف معلق الخلايا ، يتم إضافة وسائل الإعلام تجمد الجليد الباردة في حجم متساوية.
  7. تختلط الايقاف الخلية بدقة ، aliquoted الى تجميد قارورة ، وسمح لتجميد ببطء إلى 80C على مدى 24 ساعة.
  8. يمكن تجميد الخلايا ثم انتقلت إلى مرحلة بخار النيتروجين السائل للتخزين على المدى الطويل ، أو البقاء في -80 لنحو ستة أشهر.

ملاحظة : هذه قسامة المجمدة عند تركيز من 106 خلية / مل يكفي لإحياء ثقافة على طبق من 10cm.

Discussion

تقنية وصفنا لتجميد خطوط الخلايا الأشكال يعمل بشكل جيد لتخزين بكفاءة وإحياء خطوط الخلايا الأشكال وأيضا أي خلايا الثدييات في المصالح. تجميد نسبة صغيرة من الخلايا في كل مرور اعتبار مهم عند العمل مع خطوط الخلايا HES ، وشذوذ النمط النووي يمكن أن تنشأ خلايا غير طبيعية ويمكن أن تتخذ بسر...

Materials

Material NameTypeCompanyCatalogue NumberComment
NameCompanyCatalog NumberComments
HuES Mediummedium  For aq total of 651.5 ml, add: 500 ml KO-DMEM + 6.5 ml PenStrep + 6.5 ml L- Glut + 6.5 ml NEAA 6.5 ml + beta-mercaptoethanol 0.6ul (14.3 M stock) + 65 ml Serum Replacement + 65 ml Plasmanate + 0.65 ml bFGF2 (~10 ng/mL final)
Freezing Mediummedium  80% FCS (fetal calf serum) + 20% DMSO (dimethyl sulphoxide). Stored at 4C.

References

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

1 ES

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved