Einfrieren menschlicher ES-Zellen

Zusammenfassung

Hier zeigen wir, wie unser Labor FARBEN humanen embryonalen Stammzelllinien gefriert.

Zusammenfassung

Hier zeigen wir, wie unser Labor FARBEN humanen embryonalen Stammzelllinien gefriert. Eine gesunde, exponentiell wachsenden Kultur wird mit PBS gewaschen, um restliches Medien, die sonst stillen konnte die Trypsin-Reaktion zu entfernen. Erwärmt 0,05% Trypsin-EDTA zugegeben, um die Zellen bedecken, und die Platte für bis zu 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Während dieser Zeit-Zellen können Rundungsdifferenzen beobachtet werden, und Kolonien Abheben der Plattenoberfläche. Sanfte wiederholtes Pipettieren löscht Zellen und Kolonien von der Plattenoberfläche. Trypsiniert Zellen sind in einem Standard-konische Röhre mit vorgewärmten hES-Zell-Medien, um die verbleibenden Trypsin stillen gelegt und dann gesponnen. Die Zellen sind Nährmedien bei einer Konzentration von etwa einer Million Zellen resuspendiert in einem mL der Medien, eine Konzentration, so dass eine gefrorene Aliquot ausreichen, um eine Kultur, die auf eine 10 cm Platte wieder auferstehen wird. Nachdem die Zellen ausreichend resuspendiert, ist eiskalt Einfrieren Medien bei gleichem Volumen aufgenommen. Zellsuspensionen werden gründlich gemischt aliquotiert in Einfrierröhrchen, und langsam eingefroren, um-80C über 24 Stunden. Gefrorene Zellen können dann in die Dampfphase von flüssigem Stickstoff für die langfristige Lagerung verschoben oder bleiben bei -80 für ca. 6 Monate.

Protokoll

1. Eine gesunde, exponentiell wachsenden Kultur wird mit PBS gewaschen, um restliches Medien, die sonst stillen konnte die Trypsin-Reaktion zu entfernen.
2. Erwärmt 0,05% Trypsin-EDTA zugegeben, um die Zellen bedecken, und die Platte für bis zu 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Während dieser Zeit-Zellen können Rundungsdifferenzen beobachtet werden, und Kolonien Abheben der Plattenoberfläche.
3. Sanfte wiederholtes Pipettieren löscht Zellen und Kolonien von der Plattenoberfläche.
4. Trypsiniert Zellen sind in einem Standard-konische Röhre mit vorgewärmten hES-Zell-Medien, um die verbleibenden Trypsin stillen gelegt und dann gesponnen.
5. Die Zellen sind Nährmedien bei einer Konzentration von etwa einer Million Zellen resuspendiert in einem mL der Medien.
6. Nachdem die Zellen ausreichend resuspendiert, ist eiskalt Freezing Media bei gleichem Volumen aufgenommen.
7. Zellsuspensionen werden gründlich gemischt aliquotiert in Einfrierröhrchen, und langsam eingefroren, um-80C über 24 Stunden.
8. Gefrorene Zellen können dann in die Dampfphase von flüssigem Stickstoff für die langfristige Lagerung verschoben oder bleiben bei -80 für ca. 6 Monate.

Hinweis: wie eine gefrorene Aliquot bei einer Konzentration von 106 Zellen / ml ist ausreichend, um eine Kultur auf einer 10cm Platte wieder zu beleben.

Diskussion

Die Technik, die wir beschreiben, für das Einfrieren FARBEN Zelllinien funktioniert gut für die effiziente Speicherung und Wiederbelebung FARBEN Zell-Linien und auch keine Säugetierzellen von Interesse. Freezing ein kleiner Teil der Zellen bei jeder Passage ist ein wichtiger Aspekt bei der Arbeit mit hES-Zelllinien, als Karyotyp Anomalien auftreten können und abnormale Zellen kann schnell über die Linie. So ist mit gefrorenen spaltet bei jedem Durchgang neben großen Banken an bestimmten Stellen sehr wünschenswert.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
HuES Medium	medium			For a total of 651.5 mL, add: 500 mL KO-DMEM + 6.5 mL PenStrep + 6.5 mL L-Glut + 6.5 mL NEAA 6.5 mL + beta-mercapt–thanol 0.6 µL (14.3 M stock) + 65 mL Serum Replacement + 65 mL Plasmanate + 0.65 mL bFGF2 (~10 ng/mL final)
Freezing Medium	medium			80% FCS (fetal calf serum) + 20% DMSO (dimethyl sulfoxide). Stored at 4 °C.