Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Protocol
  • Discussion
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן אנו מדגימים כיצד במעבדה שלנו קופא גוונים האדם עובריים קווי גזע.

Abstract

כאן אנו מדגימים כיצד במעבדה שלנו קופא גוונים האדם עובריים קווי גזע. תרבות בריאה, אקספוננציאלית הרחבת נשטף עם PBS להסיר התקשורת שיורי שיכול אחרת להרוות את התגובה טריפסין. חימם 0.05% טריפסין-EDTA הוא הוסיף אז כדי לכסות את תאים, הצלחת מותר דגירה של עד 5 דקות בטמפרטורת החדר. במהלך הזמן הזה התאים ניתן לראות עיגול, ומושבות מרימים את פני הצלחת. Pipetting חזר עדין יסיר מושבות תאים מפני השטח צלחת. תאים Trypsinized ממוקמים צינור חרוטי סטנדרטי המכיל מראש חימם התקשורת הס תא להרוות טריפסין הנותרים, וסובב אז. תאים הם resuspended התקשורת צמיחה בריכוז של כמיליון תאים למ"ל אחד בתקשורת, ריכוז כזה שאף אחד aliquot קפוא מספיקה כדי להחיות תרבות על צלחת 10 ס"מ. אחרי התאים resuspended כראוי, קרים כקרח התקשורת מקפיא נוסף בהיקף זהה. המתלים Cell מעורבבים היטב, aliquoted לתוך צלוחיות מקפיא, ואיפשר לאט לקפוא-80C מעל 24 שעות. תאים קפואים יכול מכן מועבר בשלב אדים של חנקן נוזלי לצורך אחסון לטווח ארוך, או להישאר כ -80 שישה חודשים.

Protocol

  1. תרבות בריאה, אקספוננציאלית הרחבת נשטף עם PBS להסיר התקשורת שיורי שיכול אחרת להרוות את התגובה טריפסין.
  2. חימם 0.05% טריפסין-EDTA הוא הוסיף אז כדי לכסות את תאים, הצלחת מותר דגירה של עד 5 דקות בטמפרטורת החדר. במהלך הזמן הזה התאים ניתן לראות עיגול, ומושבות מרימים את פני הצלחת.
  3. Pipetting חזר עדין יסיר מושבות תאים מפני השטח צלחת.
  4. תאים Trypsinized ממוקמים צינור חרוטי סטנדרטי המכיל מראש חימם התקשורת הס תא להרוות טריפסין הנותרים, וסובב אז.
  5. תאים הם resuspended התקשורת צמיחה בריכוז של כמיליון תאים למ"ל אחד בתקשורת.
  6. אחרי התאים resuspended כראוי, קרים כקרח מדיה מקפיא נוסף בהיקף זהה.
  7. המתלים Cell מעורבבים היטב, aliquoted לתוך צלוחיות מקפיא, ואיפשר לאט לקפוא-80C מעל 24 שעות.
  8. תאים קפואים יכול מכן מועבר בשלב אדים של חנקן נוזלי לצורך אחסון לטווח ארוך, או להישאר כ -80 שישה חודשים.

הערה: כזה aliquot קפוא בריכוז של 106 תאים / מ"ל ​​מספיקה כדי להחיות תרבות על צלחת 10 ס"מ.

Discussion

הטכניקה אנו מתארים עבור קווי גוונים תא הקפאה עובד היטב עבור אחסון יעיל להחיות גוונים שורות תאים וכן כל תא יונקים של עניין. הקפאת חלק קטן של תאים במעבר זה הוא שיקול חשוב בעת עבודה עם שורות הס התא, כמו הפרעות קריוטיפ יכול להתעורר תאים חריגים יכולים במהירות להשתלט על הקו. לפיכך, לאחר...

Materials

Material NameTypeCompanyCatalogue NumberComment
NameCompanyCatalog NumberComments
HuES Mediummedium  For aq total of 651.5 ml, add: 500 ml KO-DMEM + 6.5 ml PenStrep + 6.5 ml L- Glut + 6.5 ml NEAA 6.5 ml + beta-mercaptoethanol 0.6ul (14.3 M stock) + 65 ml Serum Replacement + 65 ml Plasmanate + 0.65 ml bFGF2 (~10 ng/mL final)
Freezing Mediummedium  80% FCS (fetal calf serum) + 20% DMSO (dimethyl sulphoxide). Stored at 4C.

References

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

1ES

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved