La congélation des cellules ES humaines

Résumé

Ici, nous montrons comment notre laboratoire gèle HUES humaine lignes de cellules souches embryonnaires.

Résumé

Ici, nous montrons comment notre laboratoire gèle HUES humaine lignes de cellules souches embryonnaires. Une culture saine expansion exponentielle est lavé avec du PBS pour éliminer les médias résiduels qui pourraient autrement arrêter la réaction trypsine. Réchauffé 0,05% de trypsine-EDTA est ensuite ajouté pour couvrir les cellules, et la plaque à incuber pendant 5 minutes à température ambiante. Pendant ce temps, les cellules peuvent être observées arrondissement, et des colonies soulevant la surface de la plaque. Douceur de pipetage répété va éliminer les cellules et les colonies de la surface de la plaque. Cellules trypsinisées sont placés dans un tube conique contenant la norme pré-chauffé médias cellules hES pour étancher la trypsine restants, puis filé. Les cellules sont remises en suspension des milieux de croissance à une concentration d'environ un million de cellules dans un ml de médias, une concentration telle que une aliquote congelé est suffisante pour ressusciter une culture sur une plaque de 10cm. Après les cellules sont remises en suspension de manière adéquate, les médias de glace glacial est ajouté à volume égal. Les suspensions cellulaires sont bien mélangés, aliquotés dans des flacons de gel, et a permis de lentement de froid-80C pendant 24 heures. Cellules congelées peuvent ensuite passés à la phase vapeur d'azote liquide pour le stockage à long terme, ou de rester à -80 pendant environ six mois.

Protocole

1. Une culture saine expansion exponentielle est lavé avec du PBS pour éliminer les médias résiduels qui pourraient autrement arrêter la réaction trypsine.
2. Réchauffé 0,05% de trypsine-EDTA est ensuite ajouté pour couvrir les cellules, et la plaque à incuber pendant 5 minutes à température ambiante. Pendant ce temps, les cellules peuvent être observées arrondissement, et des colonies soulevant la surface de la plaque.
3. Douceur de pipetage répété va éliminer les cellules et les colonies de la surface de la plaque.
4. Cellules trypsinisées sont placés dans un tube conique contenant la norme pré-chauffé médias cellules hES pour étancher la trypsine restants, puis filé.
5. Les cellules sont remises en suspension des milieux de croissance à une concentration d'environ un million de cellules dans un ml de médias.
6. Après les cellules sont remises en suspension de manière adéquate, les médias de la glace de congélation froide est ajoutée à volume égal.
7. Les suspensions cellulaires sont bien mélangés, aliquotés dans des flacons de gel, et a permis de lentement de froid-80C pendant 24 heures.
8. Cellules congelées peuvent ensuite passés à la phase vapeur d'azote liquide pour le stockage à long terme, ou de rester à -80 pendant environ six mois.

Remarque: une telle partie aliquote congelé à une concentration de 106 cellules / ml est suffisante pour ressusciter une culture sur une plaque de 10cm.

Discussion

La technique que nous décrivons pour la congélation HUES lignées cellulaires fonctionne bien pour stocker efficacement et en ressuscitant des lignes HUES cellule et aussi toute cellule de mammifère d'intérêt. Gel d'une petite proportion de cellules à chaque passage est une considération importante quand on travaille avec des lignées de cellules hES, des anomalies du caryotype peuvent survenir et les cellules anormales peuvent rapidement prendre le relais de la ligne. Ainsi, après avoir congelé divise à chaque passage, en...

matériels

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
HuES Medium	medium			For aq total of 651.5 ml, add: 500 ml KO-DMEM + 6.5 ml PenStrep + 6.5 ml L- Glut + 6.5 ml NEAA 6.5 ml + beta-mercaptoethanol 0.6ul (14.3 M stock) + 65 ml Serum Replacement + 65 ml Plasmanate + 0.65 ml bFGF2 (~10 ng/mL final)
Freezing Medium	medium			80% FCS (fetal calf serum) + 20% DMSO (dimethyl sulphoxide). Stored at 4C.