JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نحن هنا وصف لفحص النمو المكورات العنقودية الذهبية باستخدام الهيموجلوبين كمصدر وحيد للحديد المغذيات المتاحة. هذا الاختبار يحدد دور العوامل البكتيرية المشاركة في الهيموغلوبين المستمدة من اكتساب الحديد.

Abstract

S. المذهبة هي نوع من البكتيريا المسببة للأمراض التي تتطلب الحديد لتنفيذ وظائف الأيض الحيوية وتسبب المرض. الخزان الأكثر وفرة من الحديد داخل الإنسان هو المضيف الهيم، والذي هو العامل المساعد من الهيموغلوبين. للحصول على الحديد من الهيموجلوبين، S. المكورات يستخدم نظام محكم المعروفة باسم المحدد سطح الحديد التنظيم (ISD) نظام 1. مكونات أول نظام ISD ربط الهيموغلوبين المضيف، ثم استخراج واستيراد الهيم، وأخيرا تحرير الحديد من الهيم في السيتوبلازم البكتيري 2،3. وقد تم تشريح هذا المسار من خلال العديد من الدراسات في المختبر 4-9. علاوة على ذلك، كانت مساهمة نظام ISD للإصابة أظهرت مرارا وتكرارا في نماذج الماوس 8،10-14. إنشاء مساهمة منظومة ISD إلى الهيموغلوبين المستمدة من اقتناء الحديد والنمو وقد ثبت أن تكون أكثر تحديا. معقدة المقايسات النمو باستخدام الهيموجلوبين كمصدر وحيد الحديد بY عدم استقرار الهيموجلوبين المتاحة تجاريا، وتلوث الحديد حرة في المتوسط ​​النمو، وسمية المرتبطة chelators الحديد. هنا نقدم طريقة التي يتغلب هذه القيود. مستعدة عالية الجودة من الهيموغلوبين في الدم الطازجة ويتم تخزينها في النيتروجين السائل. وتستكمل الهيموغلوبين في تنقية الحديد تستنفد المتوسطة محاكاة البيئة الحديد للفقراء التي تواجهها مسببات الأمراض داخل المضيف الفقاريات. عن طريق تجويع S. المكورات من الحديد حرة والمكمل مع نموذج التلاعب الحد الأدنى من الهيموغلوبين نحن لحث على النمو بطريقة تعتمد اعتمادا كليا على القدرة على ربط الهيموغلوبين، واستخراج الهيم، من خلال تمرير الهيم المغلف الخلية البكتيرية وتتحلل الهيم في السيتوبلازم. وسوف يكون هذا الاختبار مفيدا للباحثين تسعى إلى إلقاء الضوء على آليات اكتساب الحديد في hemoglobin-/heme-derived S. المكورات وربما غيرها من مسببات الأمراض البكتيرية.

Protocol

1. تنقية الهيموجلوبين من الدم الطازج

  1. الحصول على الدم البشري الطازج تستكمل مع مضاد للتخثر. إبقاء الدم على الجليد أو عند 4 ° C خلال تنقية.
  2. أجهزة الطرد المركزي في الدم لمدة 20 دقيقة في ز X 1،500. وخلايا الدم الحمراء (كرات الدم الحمراء) تكون في الجزء السفلي من الأنبوب. نضح بعناية طاف و resuspend بيليه بلطف في الجليد الباردة محلول كلوريد الصوديوم 0.9٪ (W / V). تكرار الطرد المركزي ويغسل 3 مرات.
  3. إعادة تعليق بيليه في 1 حجم الجليد الباردة ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك 10 (الرقم الهيدروجيني 8.0). وهذا حمل تحلل كرات الدم الحمراء من المقرر أن الضغط التناضحي. إضافة إلى حجم التولوين ~ النهائي 20٪.
  4. احتضان في C ° 4 على المشواة ليلة وضحاها.
  5. أجهزة الطرد المركزي في 20000 XG المحللة في ل1 ساعة. جمع الكسر حلالة دموية الأوسط مغادرة يمسها التولوين (العائمة في الأعلى) وبيليه. استخدام ماصة طويلة الرقبة لجمع الكسر الأوسط.
  6. تمر عبر فلتر 0،44 ميكرون حقنة. إذا الحل يحتوي على جسيماتلا يمكن أن تنتقل المسألة وعبر المرشح، كرر الخطوة 1.5.
  7. تنقية الهيموجلوبين (خضاب الدم) مع اللوني السائل عالي الأداء (HPLC) العمود تبادل أنيون (فاريان، PL-1000 SAX A 8 ميكرومتر، 150 مم × 4.6 ملم). الطور المتحرك (أ) هو 10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (درجة الحموضة 8.0) والمتنقلة B المرحلة هو 10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (درجة الحموضة 8.0) + 0.5 M كلوريد الصوديوم. يتم تشغيل A٪ -100 0٪ من الانحدار B المذيبات أكثر من 2 دقيقة بمعدل 2،0 تدفق مل / دقيقة. يتم مراقبة شطف يعتمد على امتصاص (λ: 410 نانومتر نانومتر و280). جمع فقط جزء يتميز بلون أحمر فاتح وذروة امتصاص بارزة (الشكل 1).
  8. Dialyze وشطف ضد الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) بين عشية وضحاها ومن ثم لبضع ساعات مرة أخرى. تعقيم عن طريق تمرير من خلال مرشح ميكرون حقنة 0.22.
  9. لقياس الهيموغلوبين التركيز، وإعداد الحلول القياسية هب تركيزات معروفة في برنامج تلفزيوني. تحديد تركيز الهيموغلوبين من في العينة عن طريق خلط الحلول القياسية (انظر الجدول مع الكواشف لناإد) أو محلول العينة مع كاشف لل2X Drabkin (المحضرة من مسحوق) بنسبة 1:1. على سبيل المثال، مزيج 100 ميكرولتر حل هب مع 100 ميكرولتر كاشف 2X Drabkin في 96-وحات جيدة. احتضان لمدة 15 دقيقة وقياس الامتصاصية في 540 نيوتن متر. رسم منحنى القياسية وتحديد تركيز الهيموغلوبين في العينة. خمسة إلى خمسة عشر ملغ / مل غلة هي نموذجية.
  10. تشغيل ميكروغرام 15-20 تنقية الهيموجلوبين على صفحة SDS 15٪ من نسختين. وصمة عار واحدة من المواد الهلامية، ونقل البروتينات من الهلام إلى آخر غشاء النيتروسليلوز وطخة مناعية لخضاب الدم (الشكل 2).
  11. تجميد وتخزين مليلتر مأخوذة 1 من الهيموغلوبين في النيتروجين السائل.

2. وسائط النمو إعداد الحديد تستنفد

  1. إعداد معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI) مرق عن طريق إذابة مسحوق RPMI في الماء، إضافة بيكربونات الصوديوم على النحو الموصى به من قبل الشركة المصنعة و1٪ الأحماض cassamino (CA) (W / V). تعقيم عن طريق تمرير من خلال مرشح ميكرون 0.2 و refrig مخزنمتسارع.
  2. إعداد المعادن المنضب RPMI (NRPMI) وذلك بإضافة 7٪ (W / V) Chelex 100 و خلط بين عشية وضحاها على لوحة ضجة. إزالة Chelex 100 من يمر من خلال مرشح 0.2 ميكرومتر وتخزين مبردة. تكملة وسائل الاعلام مع المعادن غير الحديدية الأساسية: 25 ميكرومتر ZnCl 2 و 25 ميكرومتر MnCl 2، 100 ملم CaCl 2 و 1 مم MgCl 2 التي أعدت مسبقا ومحلول معقم X 1،000. استخدام الحاويات البلاستيكية لهذه الخطوة لتجنب تلوث الحديد من إعادة استخدامها الإمدادات.

3. النمو المكورات العنقودية الذهبية باستخدام الهيموجلوبين كمصدر وحيد للحديد

  1. خط S. لعزل المكورات على أجار الصويا تريبسيني (TSA) من الأسهم المجمدة. احتضان في C ° 37 للفترة 20-24 ساعة.
  2. إعادة تعليق الإيثيلنديامين-N، N'-مكررا (2-hydroxyphenylacetic حمض) (EDDHA) في الإيثانول اللامائي الى 100 ملم. EDDHA لا يذهب إلى حل ولكن يتم تعقيم بواسطة الايثانول.
  3. إضافة إلى EDDHA RPMI إلى تركيز النهائي من 0.5 مم. السماحEDDHA حل ما لا يقل عن 30 دقيقة قبل الانتقال إلى الخطوة التالية. بسبب دفعة إلى دفعة الاختلاف، قد النهائي EDDHA تحتاج إلى تركيز خفضت إلى 0.25 ملم للسماح نمو البكتيريا.
  4. تطعيم واحدة من المستعمرات S. المكورات في 5 مل من RPMI تحتوي على أنابيب EDDHA في 15 مل المسمار غطاء مخروطي. احتضان في C ° 37 مع اهتزاز عند 180 التناوب في الدقيقة (RPM) ل16-20 ساعة.
  5. أجهزة الطرد المركزي ليلة وضحاها الثقافات لمدة 5 دقائق في 7500 XG و resuspend بيليه في NRPMI المحتوي على 0.5 ملي EDDHA. تطبيع OD 600 إلى ~ 3.
  6. إعداد NRPMI تحتوي على 2.5 ميكروغرام لكل مل الهيموغلوبين و0،1-1،0 ملم EDDHA. بسبب الاختلاف بين دفعات، قد EDDHA تركيز الحديد المطلوب لكلاب الحرة في NRPMI تختلف.
  7. ثقافة فرعية 10 ميكرولتر من التعليق البكتيرية من الخطوة 3.5 في 1 مل + هب + NRPMI EDDHA في أنبوب 15 مل المسمار غطاء مخروطي.
  8. احتضان الثقافات في C ° 37 لمدة تصل إلى 48 ساعة مع اهتزاز عند 180 دورة في الدقيقة أو على طبلة المتداول.
    9. كل ساعة 6-12 اتخاذ OD 600 قراءات عن طريق إزالة 50 ميكرولتر من الثقافة وخلطها مع 150 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني في 96 لوحات جيدة.

النتائج

لدينا تنقية الهيموجلوبين الإنسان من حلالة دموية مع HPLC (البروتوكول خطوة 1.7). ويظهر الشكل 1 سجلت الامتصاصية من شطافة في موجات نانومتر 280 و 410. كان جزء 5 جمعها والتخلص منها وكسور أخرى. عادة يتم الحصول على غلة 5-15 ملليغرام من الهيموغلوبين في الملليمتر الواحد من شطافة...

Discussion

الحديد من المغذيات الأساسية اللازمة للكائنات من جميع ممالك الحياة 15. في الفقاريات، وعزلها الحديد لتجنب السمية الناجمة عن هذا العنصر. هذا تنحية يخفي أيضا من غزو الميكروبات الحديد في عملية تعرف باسم الحصانة الغذائية 16. وردا على ذلك تطورت مسببات الأمراض الا...

Disclosures

ليس لدينا شيء في الكشف عنها.

Acknowledgements

وأيد هذا البحث من قبل الولايات المتحدة المنح العامة للخدمات الصحية وAI69233 AI073843 من المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية. EPS هو زميل ويلكوم بوروز في التسبب في الأمراض المعدية. وقد تم تمويل KPH من قبل الأحياء الدقيقة الجزيئية الخلوية والتدريب منحة البرنامج 5 T32 A107611-10.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
اسم الكاشف / المواد شركة كتالوج رقم تعليقات
HPLC عمود أنيون تبادل فاريان PL1551-3802
Drabkin كاشف سيجما D5941-6VL
الهيموغلوبين القياسية بوانت العلمية H7506-STD
RPMI HyClone SH30011.02
Chelex شكل الصوديوم 100 سيجما C7901
EDDHA LGC معايير محدودة ANC 001
الهيموجلوبين الأجسام المضادة سانتا كروز التكنولوجيا الحيوية، وشركة SC-21005
تريبسيني الصويا أجار BD 236920

References

  1. Mazmanian, S., et al. Passage of heme-iron across the envelope of Staphylococcus aureus. Science. 299, 906-909 (2003).
  2. Pishchany, G., Skaar, E. P. Taste for blood: hemoglobin as a nutrient source for pathogens. PLOS Pathogens. 8, e1002535 (2012).
  3. Haley, K. P., Skaar, E. P. A battle for iron: host sequestration and Staphylococcus aureus acquisition. Microbes and infection. Institut Pasteur. 14, 217-227 (2012).
  4. Krishna Kumar, K., et al. Structural basis for hemoglobin capture by Staphylococcus aureus cell-surface protein. IsdH. The Journal of biological chemistry. 286, 38439-38447 (2011).
  5. Grigg, J. C., Mao, C. X., Murphy, M. E. Iron-coordinating tyrosine is a key determinant of NEAT domain heme transfer. Journal of Molecular Biology. 413, 684-698 (2011).
  6. Villareal, V. A., et al. Transient weak protein-protein complexes transfer heme across the cell wall of Staphylococcus aureus. Journal of the American Chemical Society. 133, 14176-14179 (2011).
  7. Muryoi, N., et al. Demonstration of the iron-regulated surface determinant (Isd) heme transfer pathway in Staphylococcus aureus. J. Biol. Chem. 283, 28125-28136 (2008).
  8. Reniere, M. L., Skaar, E. P. Staphylococcus aureus haem oxygenases are differentially regulated by iron and haem. Mol. Microbiol. 69, 1304-1315 (2008).
  9. Liu, M., et al. Direct hemin transfer from IsdA to IsdC in the iron-regulated surface determinant (Isd) heme acquisition system of Staphylococcus aureus. J. Biol. Chem. 283, 6668-6676 (2008).
  10. Pishchany, G., et al. Specificity for human hemoglobin enhances Staphylococcus aureus infection. Cell Host Microbe. 8, 544-550 (2010).
  11. Pishchany, G., Dickey, S. E., Skaar, E. P. Subcellular localization of the Staphylococcus aureus heme iron transport components IsdA and IsdB. Infect. Immun. 77, 2624-2634 (2009).
  12. Torres, V. J., Pishchany, G., Humayun, M., Schneewind, O., Skaar, E. P. Staphylococcus aureus IsdB is a hemoglobin receptor required for heme iron utilization. J. Bacteriol. 188, 8421-8429 (2006).
  13. Kim, H. K., et al. IsdA and IsdB antibodies protect mice against Staphylococcus aureus abscess formation and lethal challenge. Vaccine. 28, 6382-6392 (2010).
  14. Cheng, A. G., et al. Genetic requirements for Staphylococcus aureus abscess formation and persistence in host tissues. Faseb J. 23, 3393-3404 (2009).
  15. Andreini, C., Bertini, I., Cavallaro, G., Holliday, G. L., Thornton, J. M. Metal ions in biological catalysis: from enzyme databases to general principles. J. Biol. Inorg. Chem. 13, 1205-1218 (2008).
  16. Weinberg, E. D. Iron availability and infection. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1790, 600-605 (2009).
  17. Drabkin, D. Metabolism of the Hemin Chromoproteins. Physiological Reviews. 31, 345-431 (1951).
  18. Graversen, J. H., Madsen, M., Moestrup, S. K. CD163: a signal receptor scavenging haptoglobin-hemoglobin complexes from plasma. The international journal of biochemistry & cell biology. 34, 309-314 (2002).
  19. Torres, V. J., et al. Staphylococcus aureus Fur regulates the expression of virulence factors that contribute to the pathogenesis of pneumonia. Infect. Immun. 78, 1618-1628 (2010).
  20. Hammer, N. D., Skaar, E. P. Molecular Mechanisms of Staphylococcus aureus Iron Acquisition. Annu. Rev. Microbiol. , (2011).
  21. Hurd, A. F., et al. The iron-regulated surface proteins IsdA, IsdB, and IsdH are not required for heme iron utilization in Staphylococcus aureus. Fems. Microbiology Letters. 329, 93-100 (2012).
  22. Boys, B. L., Kuprowski, M. C., Konermann, L. Symmetric behavior of hemoglobin alpha- and beta- subunits during acid-induced denaturation observed by electrospray mass spectrometry. Biochemistry. 46, 10675-10684 (2007).
  23. Williams, R. C., Tsay, K. Y. A convenient chromatographic method for the preparation of human hemoglobin. Analytical Biochemistry. 54, 137-145 (1973).
  24. Shen, T. J., et al. Production of unmodified human adult hemoglobin in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 8108-8112 (1993).
  25. Manjula, B. N., Acharya, S. A. Purification and molecular analysis of hemoglobin by high-performance liquid chromatography. Methods Mol. Med. 82, 31-47 (2003).
  26. Neilands, J. B. Microbial envelope proteins related to iron. Annual review of microbiology. 36, 285-309 (1982).
  27. Chart, H., Buck, M., Stevenson, P., Griffiths, E. Iron regulated outer membrane proteins of Escherichia coli: variations in expression due to the chelator used to restrict the availability of iron. Journal of General Microbiology. 132, 1373-1378 (1986).
  28. Rogers, H. J. Iron-Binding Catechols and Virulence in Escherichia coli. Infection and Immunity. 7, 445-456 (1973).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

72

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved