Staphylococcus aureus crescita con emoglobina umana come fonte di ferro

Riepilogo

Qui si descrive un saggio di crescita per Staphylococcus aureus Utilizzando l'emoglobina come unica fonte di nutrienti disponibili ferro. Questo saggio stabilisce il ruolo dei fattori batterici coinvolti nella emoglobina derivata acquisizione ferro.

Abstract

S. aureus è un batterio patogeno che richiede ferro a svolgere funzioni vitali metaboliche e causare la malattia. Il serbatoio più abbondante di ferro all'interno dell'ospite umano è eme, che è il cofattore di emoglobina. Per acquisire ferro da emoglobina, S. aureus utilizza un complesso sistema noto come il ferro regolato determinante superficie (Isd) sistema ^1. Componenti della Isd emoglobina legano primo sistema host, quindi estrarre e importare eme, e infine liberare ferro eme nel citoplasma batterico ^2,3. Questo percorso è stato sezionato attraverso numerosi studi in vitro ^4-9. Inoltre, il contributo del sistema Isd di infezione è stato ripetutamente dimostrato in modelli murini ^8,10-14. Stabilire il contributo del sistema Isd all'emoglobina derivato acquisizione di ferro e la crescita ha dimostrato di essere più impegnativo. Saggi di crescita che utilizzano l'emoglobina come fonte unica di ferro sono complicate by dell'instabilità dell'emoglobina commercialmente disponibile, contaminando ferro libero nel terreno di crescita, e la tossicità associata con chelanti del ferro. Qui vi presentiamo un metodo che supera queste limitazioni. Emoglobina alta qualità è preparato da sangue fresco e conservate in azoto liquido. Emoglobina purificata è integrato in ferro riducono medio mimando il ferro-poveri ambiente incontrate dagli agenti patogeni all'interno del ospite vertebrato. Di fame S. aureus di ferro libero e integrando con una forma minimamente manipolato dell'emoglobina ci indurre la crescita in un modo che è interamente dipendente dalla capacità di legare l'emoglobina, estrarre eme, eme passare attraverso la busta cellula batterica e degradare eme nel citoplasma. Questo test sarà utile per i ricercatori che cercano di chiarire i meccanismi di acquisizione ferro hemoglobin-/heme-derived in S. aureus ed eventualmente di altri batteri patogeni.

Protocollo

1. Purificazione di emoglobina da sangue fresco

1. Acquisire fresco sangue umano integrato con un anticoagulante. Mantenere il sangue sul ghiaccio oppure a 4 ° C per tutta la purificazione.
2. Centrifugare il sangue per 20 min a 1500 x g. I globuli rossi (RBC) sarà al fondo della provetta. Aspirare accuratamente il supernatante e risospendere il pellet delicatamente in gelata soluzione 0,9% (w / v) NaCl. Ripetere la centrifugazione e lavare 3 volte.
3. Risospendere il pellet in 1 volume di ghiaccio freddo 10 mM Tris-HCl (pH 8,0). Ciò induce lisi dei globuli rossi a causa della pressione osmotica. Aggiungi toluene a ~ 20% del volume finale.
4. Incubare a 4 ° C durante la notte su un girarrosto.
5. Centrifugare il lisato a 20.000 xg per 1 ora. Raccogliere la frazione centrale emolisato lasciando intatto il toluene (galleggiante in alto) e pellet. Utilizzare un lungo collo pipetta per raccogliere la frazione centrale.
6. Attraversare 0,44 micron filtro siringa. Se la soluzione contiene particellemateria e non può essere passato attraverso il filtro, ripetere il punto 1.5.
7. Purificare l'emoglobina (Hb) con una ad alte prestazioni cromatografia liquida (HPLC), colonna a scambio anionico (Varian, PL-SAX 1000 al 8 pm, 150 mm × 4,6 mm). La fase mobile A è 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) e la fase mobile B è 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) + 0,5 M NaCl. A 0% -100% di pendenza solvente B è gestito oltre 2 min a 2,0 ml / min di portata. L'eluizione viene controllata sulla base di assorbimento (λ: 410 nm e 280 nm). Raccogliere solo la frazione caratterizzato da un colore rosso brillante e un picco di assorbimento di primo piano (Figura 1).
8. Dializza l'eluizione contro tampone fosfato salino (PBS) per una notte e poi per qualche ora ancora. Sterilizzare passando attraverso un filtro 0,22 micron siringa.
9. Per misurare la concentrazione di Hb, preparare soluzioni standard di Hb di concentrazioni note in PBS. Determinare la concentrazione di Hb nel campione mescolando le soluzioni standard (vedere la tabella con reagenti noied) o la soluzione campione con il reagente di 2x Drabkin (preparato da polvere) con un rapporto 1:1. Per esempio, miscelare 100 ul di soluzione Hb con 100 pl di reagente 2x Drabkin in piastre da 96 pozzetti. Incubare per 15 min e l'assorbanza misura a 540 nm. Tracciare una curva standard e determinare la concentrazione di emoglobina nel campione. Da cinque a quindici mg / ml rendimenti sono tipici.
10. Eseguire 15-20 ug dell'emoglobina purificata su un 15% SDS-PAGE in duplicato. Macchia uno dei gel, trasferire le proteine ​​di un'altra gel su una membrana di nitrocellulosa e immunoblot per l'emoglobina (Figura 2).
11. Congelare e conservare aliquote da 1 ml di emoglobina in azoto liquido.

2. Preparazione di ferro riducono la crescita media

1. Preparare Roswell Park Memorial Institute (RPMI) brodo sciogliendo la polvere RPMI in acqua, aggiungere bicarbonato di sodio come raccomandato dal produttore e 1% di acidi cassamino (CA) (w / v). Sterilizzare passando attraverso un filtro 0,2 micron e conservare frigoriferorato.
2. Preparare metallo depleto RPMI (NRPMI) aggiungendo 7% (w / v) Chelex 100 e miscelazione notte su una piastra di agitazione. Rimuovere Chelex 100 passando attraverso un filtro 0,2 micron e conservare in frigorifero. Integrare mezzi essenziali con metalli non ferrosi: 25 ZnCl ₂ pM, 25 pM MnCl _2, 100 mM CaCl ₂ e 1 mM MgCl ₂ preparati in anticipo come soluzione sterile 1000 x. Utilizzare contenitori di plastica usa e getta per questo passo per evitare la contaminazione da ferro riutilizzabili forniture.

3. Staphylococcus aureus Crescita emoglobina utilizzando come fonte di ferro Sole

1. Streak S. aureus per l'isolamento in Tryptic Soy Agar (TSA) da uno stock congelato. Incubare a 37 ° C per 20-24 ore.
2. Risospendere etilendiammina-N, N'-bis (2-hydroxyphenylacetic acid) (EDDHA) in etanolo anidro a 100 mM. EDDHA non va in soluzione, ma è sterilizzato da etanolo.
3. Aggiungi EDDHA per RPMI ad una concentrazione finale di 0,5 mM. ConsentireEDDHA per dissolvere per almeno 30 minuti prima di procedere alla fase successiva. Causa lotto a lotto variazione, concentrazione finale EDDHA può essere necessario abbassare a 0,25 mm per consentire la crescita batterica.
4. Seminare singole colonie di S. aureus in 5 ml di RPMI contenente EDDHA in 15 ml con tappo a vite tubi conici. Incubare a 37 ° C con agitazione a 180 giri al minuto (rpm) per 16-20 ore.
5. Centrifugare le culture di notte per 5 min a 7500 xg e risospendere il pellet in NRPMI contenente 0,5 mM EDDHA. Normalizza OD ₆₀₀ a ~ 3.
6. Preparare NRPMI contenente 2,5 microgrammi per ml Hb e EDDHA 0,1-1,0 mM. A causa delle variazioni tra i lotti, la concentrazione necessaria per EDDHA chelare ferro libero in NRPMI possono variare.
7. Subculture 10 ml di sospensione batterica dal punto 3,5 in 1 ml NRPMI EDDHA + + Hb in un ml 15 con tappo a vite tubo conico.
8. Incubare le colture a 37 ° C per 48 ore con agitazione a 180 rpm o su un tamburo di laminazione.
9. Ogni 6-12 hr prendere OD ₆₀₀ letture rimuovendo 50 microlitri della cultura e mescolandolo con 150 microlitri di PBS in piastre da 96 pozzetti.

Risultati

Abbiamo purificato emoglobina umana da emolisato con HPLC (Protocollo passo 1.7). Figura 1 mostra registrato assorbanza dell'eluato a 280 e 410 nm lunghezza d'onda. Frazione 5 è stato raccolto e altre frazioni sono state scartate. I rendimenti di 5-15 milligrammi di emoglobina per millilitro di eluato sono in genere acquisiti. Emoglobina purificato è stato analizzato mediante SDS-PAGE in duplicato ed i gel sono stati colorati o per proteine ​​o trasferiti su nitrocellulosa e incubate (Prot...

Discussione

Il ferro è un nutriente essenziale necessario da parte di organismi di tutti i regni della vita ^15. Nei vertebrati, ferro viene sequestrato per evitare la tossicità causata da questo elemento. Questo sequestro nasconde anche ferro da microbi invasori in un processo noto come immunità nutrizionale ^16. In risposta, gli agenti patogeni hanno sviluppato strategie che eludono l'immunità nutrizionale. Un tale meccanismo si basa su emoglobina, che è la fonte più abbondante di ferro all'inter...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reagente / materiale	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
HPLC colonna di scambio anionico	Varian	PL1551-3802
Reagente Drabkin di	Sigma	D5941-6VL
Emoglobina normale	Pointe scientifico	H7506-STD
RPMI	HyClone	SH30011.02
Chelex 100 di sodio forma	Sigma	C7901
EDDHA	LGC Standards GmbH	ANC 001
Emoglobina un anticorpo	Santa Cruz Biotechnology, Inc	SC-21005
Tryptic Soy Agar	BD	236920