Croissance Staphylococcus aureus en utilisant l'hémoglobine humaine comme source de fer

Résumé

Nous décrivons ici un test de croissance pour Staphylococcus aureus En utilisant l'hémoglobine comme la seule source de fer nutritif disponible. Ce test établit le rôle des facteurs bactériens impliqués dans l'hémoglobine dérivée de l'acquisition du fer.

Résumé

S. aureus est une bactérie pathogène qui nécessite de fer pour mener à bien les fonctions vitales du métabolisme et causer des maladies. Le réservoir le plus abondant de fer à l'intérieur de l'hôte humain est l'hème, qui est le cofacteur de l'hémoglobine. Pour acquérir le fer de l'hémoglobine, S. aureus utilise un système complexe connu sous le déterminant de surface régulée par le fer (Isd) système ^1. Composants du premier système d'hémoglobine Isd hôte bind, puis extraire et importer l'hème, et enfin libérer de fer de l'hème dans le cytoplasme bactérien ^2,3. Cette voie a été disséqué par de nombreuses études in vitro ^4-9. En outre, la contribution du système Isd à l'infection a été maintes fois démontrée dans des modèles de souris ^8,10-14. Instituant la contribution du système Isd à l'hémoglobine dérivée de l'acquisition du fer et de la croissance s'est avérée plus difficile. Essais de croissance en utilisant l'hémoglobine en tant que source de fer unique sont compliquées by l'instabilité de l'hémoglobine disponible dans le commerce, contaminant fer libre dans le milieu de croissance, et la toxicité associée à des chélateurs du fer. Nous présentons ici une méthode qui permet de surmonter ces limitations. D'hémoglobine de qualité est préparé à partir du sang frais et conservés dans l'azote liquide. L'hémoglobine purifiée est complétée en fer épuiser milieu simulant le milieu pauvre en fer rencontrées par les agents pathogènes à l'intérieur de l'hôte vertébré. En affamant S. aureus de fer libre et en complétant un formulaire de manipulation minimale de l'hémoglobine nous induire la croissance d'une manière qui dépend entièrement de la capacité de lier l'hémoglobine, d'extraire l'hème, l'hème passer à travers l'enveloppe cellulaire bactérienne et de dégrader l'hème dans le cytoplasme. Ce test sera utile pour les chercheurs qui cherchent à élucider les mécanismes de l'acquisition du fer hemoglobin-/heme-derived dans S. aureus et éventuellement d'autres agents pathogènes bactériens.

Protocole

1. Purification de l'hémoglobine à partir de sang frais

1. Acquérir le sang frais humain additionné d'un anticoagulant. Gardez le sang sur la glace ou à 4 ° C tout au long de la purification.
2. Centrifuger le sang pendant 20 min à 1500 x g. Les globules rouges (GR) est au fond du tube. Soigneusement aspirer le surnageant et remettre en suspension doucement le culot dans une solution glacée de NaCl 0,9% (p / v). Répétez la centrifugation et laver 3 fois.
3. Remettre en suspension le culot dans 1 volume de glace-froid 10 mM de Tris-HCl (pH 8,0). Cela induire la lyse des globules rouges en raison de la pression osmotique. Ajouter le toluène à ~ volume final de 20%.
4. Incuber à 4 ° C pendant la nuit sur une rôtissoire.
5. Centrifuger le lysat à 20.000 xg pendant 1 heure. Recueillir la fraction hémolysat milieu en laissant intacte l'toluène (flottant au-dessus) et le culot. Utiliser une pipette long cou pour recueillir la fraction intermédiaire.
6. Traverser 0,44 um filtre seringue. Si la solution contient des particulesla matière et ne peut pas être passé à travers le filtre, répéter l'étape 1,5.
7. Purifier l'hémoglobine (Hb) par chromatographie en phase liquide à haute performance (CLHP) colonne échangeuse d'anions (Varian, PL-SAX 1000 A 8 um, 150 mm x 4,6 mm). A la phase mobile est de 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) et la phase mobile B est 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) + 0,5 M NaCl. Un gradient de 0% -100% de solvant B est géré de plus de 2 minutes avec une fréquence du débit de 2,0 ml / min. L'élution est suivie basé sur l'absorption (λ: 410 nm et 280 nm). Recueillir la fraction seulement caractérisée par une couleur rouge vif et un pic d'absorption importante (figure 1).
8. Dialyser contre l'élution du tampon phosphate salin (PBS) pendant une nuit, puis pendant quelques heures encore. Stériliser par passage à travers un filtre de 0,22 um seringue.
9. Pour mesurer la concentration d'hémoglobine, de préparer des solutions étalons de concentrations connues d'hémoglobine dans du PBS. Déterminer la concentration de l'hémoglobine dans l'échantillon en mélangeant les solutions standard (voir la table avec des réactifs noused) ou la solution d'échantillon avec le réactif de Drabkin 2x (préparé à partir de poudre) dans un rapport 1:1. Par exemple, mélanger 100 ul de solution de réactif Hb 100 pi 2x Drabkin dans des plaques 96 puits. Incuber pendant 15 min et mesurer l'absorbance à 540 nm. Tracer une courbe d'étalonnage et déterminer la concentration d'hémoglobine dans l'échantillon. Cinq à quinze mg / ml rendements sont typiques.
10. Exécuter mg 15-20 hémoglobine purifiée sur un 15% SDS-PAGE en double exemplaire. Tacher une des gels; transférer les protéines d'une autre gel sur une membrane de nitrocellulose et immunoblot de l'hémoglobine (Figure 2).
11. Congeler et stocker des aliquotes de 1 ml d'hémoglobine dans l'azote liquide.

2. Médias de croissance Préparation de fer appauvrissent

1. Préparer Roswell Park Memorial Institute (RPMI) de bouillon en dissolvant la poudre dans de l'eau RPMI, ajouter du bicarbonate de sodium tel que recommandé par le fabricant et 1% d'acides cassamino (CA) (w / v). Stériliser par passage à travers un filtre de 0,2 um et stocker frigoaccélérées.
2. Préparer appauvri en métal RPMI (NRPMI) en ajoutant 7% (p / v) Chelex 100 et le mélange pendant une nuit sur une plaque d'agitation. Retirer Chelex 100 en passant à travers un filtre 0,2 um et stocker au réfrigérateur. Supplément médias essentiels métaux non ferreux: 25 uM ₂ ZnCl, 25 pM MnCl _2, 100 mM de CaCl ₂ et MgCl ₂ 1 mM préparé à l'avance comme un stérile 1000 x solution. Utilisez des contenants en plastique jetables pour cette étape pour éviter la contamination de fer de fournitures réutilisables.

3. Croissance Staphylococcus aureus en utilisant l'hémoglobine comme source de fer Sole

1. Série S. aureus pour l'isolement sur ​​gélose TSA (TSA) à partir d'un stock congelé. Incuber à 37 ° C pendant 20-24 heures.
2. Remettre en suspension l'acide éthylènediamine-N, N'-bis (2-hydroxyphénylacétique) (EDDHA) dans de l'éthanol anhydre à 100 mM. EDDHA ne pas en solution, mais est stérilisé par l'éthanol.
3. Ajouter EDDHA de RPMI à une concentration finale de 0,5 mM. PermettreEDDHA pour dissoudre au moins 30 min avant de procéder à l'étape suivante. En raison de lot à lot variation, concentration finale EDDHA peut-être besoin d'être abaissé à 0,25 mM pour permettre la croissance bactérienne.
4. Inoculer des colonies isolées de S. aureus dans 5 ml de RPMI contenant EDDHA dans 15 ml à bouchon à vis des tubes coniques. Incuber à 37 ° C sous agitation à 180 tours par minute (tpm) pendant 16-20 h.
5. Centrifuger les cultures d'une nuit pendant 5 min à 7500 xg et remettre en suspension le culot dans NRPMI contenant 0,5 mM EDDHA. Normaliser OD ₆₀₀ à ~ 3.
6. Préparer NRPMI contenant 2,5 ug par ml Hb et 0,1-1,0 mM EDDHA. Due à la variation entre les lots, la concentration EDDHA nécessaire pour chélater le fer libre dans NRPMI peuvent varier.
7. Subculture 10 ul de suspension bactérienne à partir de l'étape 3.5 dans 1 ml NRPMI + EDDHA + Hb dans un 15 ml à bouchon à vis tube conique.
8. Incuber les cultures à 37 ° C pendant 48 h pour en agitant à 180 tours par minute ou sur un tambour de roulage.
9. Chaque hr 6-12 prendre DO ₆₀₀ lectures en éliminant 50 pi de la culture et de la mélanger avec 150 pi de PBS dans des plaques 96 puits.

Résultats

Nous avons purifié l'hémoglobine humaine à partir hémolysat par HPLC (étape Protocole de 1,7). Figure 1 montre enregistrées absorbance de l'éluat à 280 nm et 410 longueurs d'onde. Fraction 5 a été recueilli et autres fractions ont été rejetées. Les rendements de cinq à quinze milligrammes d'hémoglobine par millilitre d'éluat sont généralement acquises. D'hémoglobine purifiée a été analysée par SDS-PAGE en double et les gels ont été soit colorés pour des ...

Discussion

Le fer est un nutriment essentiel requis par les organismes de tous les royaumes de la vie ^15. Chez les vertébrés, le fer est séquestré à éviter la toxicité provoquée par cet élément. Cette séquestration dissimule aussi le fer de microbes envahisseurs dans un processus connu sous le nom immunité nutritionnel ^16. En réponse, les agents pathogènes ont développé des stratégies permettant de contourner l'immunité nutritionnel. Un tel mécanisme repose sur l'hémoglobine, qui e...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom de réactif / Matériel	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Colonne HPLC d'échange d'anions	Varian	PL1551-3802
Réactif de Drabkin	Sigma	D5941-6VL
Norme hémoglobine	Pointe Scientific	H7506-STD
RPMI	HyClone	SH30011.02
Forme Chelex sodium 100	Sigma	C7901
EDDHA	Normes de LGC GmbH	ANC 001
Hémoglobine un anticorps	Santa Cruz Biotechnology, Inc	SC-21005
Gélose TSA	BD	236920