金黄色葡萄球菌生长使用人血红蛋白作为铁源

摘要

在这里，我们描述一个生长实验金黄色葡萄球菌

摘要

金黄色葡萄球菌是一种致病细菌，需要铁来进行重要的代谢功能，导致疾病的。储层人类宿主内的铁是最丰富的血红素，这是血红蛋白的辅因子。为了获得铁血红蛋白，S.金黄色葡萄球菌利用一个复杂的系统，被称为铁规管表面的行列式（ISD）系统^1。 ISD系统首次绑定主机血红蛋白的组成部分，然后提取并导入血红素，和，终于解放血红素铁在细菌胞浆^2,3。通过这条途径已解剖众多的体外研究^4-9。此外，ISD系统感染的贡献已被反复证明在小鼠模型中^8,10-14。建立血红蛋白衍生的铁收购和增长的贡献ISD系统已被证明是更具挑战性的。生长测定血红蛋白作为唯一的铁源是复杂的by是不稳定市售血红蛋白，在生长培养基中的游离铁污染，并与铁螯合剂毒性。在这里，我们提出了一种方法，该方法克服了这些限制。从新鲜血液中制备高品质的血红蛋白，并储存于液氮中。纯化血红蛋白补充铁消耗介质模仿铁所遇到的脊椎动物宿主病原体内的恶劣环境。饥饿S.黄色葡萄球菌的最小操纵形式的血红蛋白诱导生长的方式，结合血红蛋白，提取血红素，通过血红素通过细菌的细胞壁，并降低在细胞质中的血红素的能力完全依赖于铁和补充。此法将有助于研究人员寻找阐明机制的hemoglobin-/heme-derived铁收购S.金黄色葡萄球菌和其他可能的细菌病原体。

研究方案

1。从新鲜血液中的血红蛋白纯化

1. 收购辅以抗凝剂的人新鲜血液。血液在冰上或4℃下保持整个纯化过程。
2. 20分钟，于1500×g离心血液。的红血细胞（红细胞）将在试管底部。小心地吸出上清液，并轻轻将沉淀重悬于冰冷的0.9％（重量/体积）NaCl溶液。重复离心和洗涤3次。
3. 在1倍体积的冰冷却的10mM Tris-HCl（pH值8.0）中重悬沉淀。这将诱导的红细胞由于渗透压的裂解。添加甲苯〜20％的最终体积。
4. 在烤肉在4°C孵育过夜。
5. 离心裂解液以20,000 xg离心1小时。收集的中间溶血离开甲苯（浮在上面）和颗粒不变的部分。用长脖子吸管收集中间馏分。
6. 通过0.44微米针头式过滤器。如果溶液含有颗粒物质和不能可以通过过滤器，重复步骤1.5。
7. 纯化血红蛋白（Hb）与一个高性能的液相色谱法（HPLC）的阴离子交换柱（Varian，PL-SAX 1,000埃8μm的，150毫米×4.6毫米）。流动相A为10 mM Tris-盐酸（pH8.0）和流动相B是10 mM Tris-盐酸（pH值8.0）+ 0.5 M氯化钠。 A 0％-100％的溶剂B的梯度运行在2.0毫升/分钟的流量超过2分钟。监测洗脱基于吸收（λ：410 nm和280 nm）。仅收集部分，特点是明亮的红色和显着的吸收峰（ 图1）。
8. 透析洗脱对磷酸盐缓冲盐水（PBS）过夜，然后再次在几个小时。通过0.22μm的注射器过滤器灭菌。
9. 为了测量血红蛋白浓度，准备的标准血红蛋白解决方案的已知浓度的PBS。确定样品中的血红蛋白浓度的混合标准溶液（请参阅下表我们与试剂编辑）或的样品溶液与2倍德拉布坎的试剂（从粉末制备）按1:1的比例。例如，与100μl的2×德拉布坎的试剂在96孔板中混合100μl的血红蛋白溶液。孵育15分钟，并测量在540nm处的吸光度。绘制标准曲线，确定试样中的Hb浓度。五至15毫克/毫升的产量是典型的。
10. 运行15〜20μg纯化血红蛋白在15％SDS-PAGE，一式两份。染色凝胶之一;从另一个凝胶中的蛋白质转移到硝酸纤维素膜和免疫印迹血红蛋白（ 图2）。
11. 冻结和储存在液氮中的血红蛋白的1ml等分。

2。铁消耗培养基

1. 准备罗斯威尔公园Memorial研究所（RPMI）肉汤通过溶解的RPMI粉末在水中，由生产商和1％cassamino酸（CA）（重量/体积）的建议，添加碳酸氢钠。通过0.2μm的过滤器和存储冷柜灭菌纳入样本内。
2. 准备金属贫的RPMI（NRPMI）的通过添加7％（w / v的）Chelex 100上的搅拌板和混合过夜。通过0.2μm的过滤器和存储冷藏删除Chelex 100。与基本的非铁金属：25μM的ZnCl _2，25μM的MnCl _2，100mM的CaCl ₂和1mM MgCl ₂预先准备的作为无菌1,000×溶液补编媒体。使用一次性的塑料容器中，此步骤可重复使用的用品，以避免铁污染。

3， 金黄色葡萄球菌生长血红蛋白作为唯一的铁源

1. 数S.金黄色葡萄球菌隔离胰蛋白酶大豆琼脂（TSA）从冻结的股票。在37°C培养20〜24小时。
2. 重悬的乙二胺-N，N'-双（2 - 羟基苯基乙酸）（EDDHA）在无水乙醇至100mM。 EDDHA不进入的解决方案，但乙醇灭菌。
3. 加入EDDHA的RPMI至终浓度为0.5mM。让EDDHA溶解至少30分钟，然后再进行下一个步骤。由于批与批之间的变化，最终的EDDHA浓度可能需要降低至0.25 mM的允许细菌生长。
4. ，接种单菌落S.分为5毫升的RPMI含有EDDHA带螺旋帽的在15毫升锥形管中的金黄色葡萄球菌 。在37℃下孵育16-20小时，在180转每分钟（rpm）振荡。
5. 7500 XG 5分钟离心过夜培养和悬浮颗粒在NRPMI含有0.5mM EDDHA。规格化OD _600〜3。
6. 准备NRPMI含2.5微克每毫升HB和0.1-1.0毫米EDDHA。由于各批次之间的变化，的EDDHA浓度螯合铁在NRPMI的可能会有所不同。
7. 继代培养10微升的步骤3.51毫升NRPMI + EDDHA + Hb在15毫升螺旋盖的锥形管的菌悬液。
8. 孵育在37℃下培养至48小时，在180 rpm或轧制鼓上摇动。
每6-12小时采取的OD ₆₀₀读数通过去除培养的50微升，在96 -孔板中，用150μl的PBS混合。

结果

我们人体血红蛋白溶血纯化与HPLC（协议1.7步）。 图1显示了记录洗脱液在280和410 nm波长的吸光度。收集的级分5，以及其它馏分被丢弃。五到十五毫克每毫升洗脱液血红蛋白，产量的影响通常是获得。纯化血红蛋白，一式两份，并通过SDS-PAGE分析，凝胶或蛋白质的染色，或转移到硝酸纤维素和免疫印迹（议定书步骤1.10， 图2）。

我们已评估纯化的人血?...

讨论

铁是人体必需的营养物质，生物王国的寿命^15。在脊椎动物中，铁被隔离，以避免造成此元素的毒性。封存也掩盖铁入侵的微生物的过程被称为营养免疫^16。对此，病原体已经发展策略，规避营养的免疫力。一种这样的机制依赖于血红蛋白，这是最丰富的铁源内的主机^17。血红蛋白被包含在红血细胞。血红蛋白受损的红血细胞释放的约束的主机结合珠蛋白，这标志着快速去?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
的试剂/材料名称	公司	目录编号	评论
高效液相色谱法的阴离子交换柱	瓦里安	PL1551-3802
德拉布坎试剂	西格玛	D5941-6VL
血红蛋白标准	足尖科学	H7506-STD
RPMI	胎牛血清	SH30011.02
Chelex 100钠型	西格玛	C7901
EDDHA	LGC标准公司	ANC 001
血红蛋白A抗体	圣克鲁斯生物技术公司	SC-21005
胰蛋白酶大豆琼脂	BD	236920