Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

وتم وضع بروتوكول نضوب RNA الريباسي (الرنا الريباسي) لتخصيب رسول الحمض النووي الريبي (مرنا) لRNA-يليها من metatranscriptome الأمعاء البعوض. تم إنشاء نموذج الرنا الريباسي تحقيقات محددة، والتي كانت تستخدم لإزالة الرنا الريباسي عبر الطرح، من البعوض والميكروبات الوتر. يمكن أداء بروتوكول يؤدي إلى إزالة ما يقرب من 90-99٪ من الرنا الريباسي.

Abstract

القناة الهضمية البعوض يستوعب المجتمعات الميكروبية الحيوية عبر مراحل مختلفة من دورة حياة الحشرة. وتوصيف الوظائف والقدرات الوراثية للمجتمع الأمعاء توفير نظرة ثاقبة على آثار مجهريات البقعة الأمعاء على الصفات الحياة البعوض. Metagenomic أصبح RNA-تسلسل أداة مهمة لتحليل transcriptomes من الميكروبات المختلفة موجودة في المجتمع الميكروبي. RNA الرسول يتألف عادة٪ فقط 1-3 من الحمض النووي الريبي مجموع، بينما الرنا الريباسي يشكل حوالي 90٪. أنه يمثل تحديا لتخصيب رسول RNA من عينة الحمض النووي الريبي metagenomic الميكروبية لأن معظم الأنواع مرنا بروكاريوتيك تفتقر مستقرة بولي (A) ذيول. هذا يمنع بنسبة ضئيلة د مرنا بوساطة (T) العزلة. هنا، نحن تصف البروتوكول الذي يستخدم عينة مشتقة الرنا الريباسي التقاط تحقيقات لإزالة الرنا الريباسي من عينة الحمض النووي الريبي مجموع metagenomic. لتبدأ، وتتضخم كل من البعوض والجراثيم الرنا الريباسي الوحيدات شظايا صغيرة وكبيرة من عينة DNA metagenomic المجتمع. ثم، وcommuوقد تم تجميع بيئتهم الخاصة العقاقير المعقدة البيروكسيديز الريباسي تحقيقات RNA T7 في المختبر باستخدام الحمض النووي الريبي بوليميراز. والمهجنة للتحقيقات المعقدة البيروكسيديز الرنا الريباسي الحمض النووي الريبي مجموع ل. يتم التقاط الهجينة من streptavidin المغلفة الخرز وإزالتها من الحمض النووي الريبي مجموع. هذا البروتوكول على أساس الطرح يزيل بكفاءة كل من البعوض والجراثيم الرنا الريباسي من العينة RNA الكلي. تتم معالجة مزيد من العينة المخصب مرنا لتضخيم الحمض النووي الريبي RNA وتسلسل.

Introduction

وقد تقدمت الجيل المقبل من تكنولوجيا التسلسل إلى حد كبير من خلال السماح metagenomics دراسة لتقييم التكوين التصنيفي وظائف الجيني للتجمع الجراثيم. يمكن RNA في رسم التسلسل (RNA-تسلسل) 1 تجاوز الثقافة القائمة على أساليب التحقيق metatranscriptomes الميكروبية في 2-5 سياقات مختلفة. عقبة رئيسية أمام الميكروبية RNA-يليها هو صعوبة في إثراء مرنا، لأنها لا الأنواع مرنا بروكاريوتيك مذيل بعديد الأدينيلات ثابت. ولذلك، بنسبة ضئيلة د رسول بوساطة (T) لا ينطبق تخصيب. إزالة الرنا الريباسي وفيرة، وهو نهج بديل لتخصيب مرنا. وقد استخدمت التجارية مجموعات استنفاد الرنا الريباسي، مثل Microexpress الجرثومي مرنا عدة التخصيب (Ambion)، RiboMinus Transcriptome كيت عزل (بكتيريا) (لايف تكنولوجيز)، ومرنا-ONLY عزل مرنا بروكاريوتيك مجموعة (EPICENTRE) التي تحط تفضيلي الرنا الريباسي مع نوكلياز خارجية، لإزالة الرنا الريباسي 6-8. ومع ذلك، فإن تحقيقات في التقاط Microexpressأو RiboMinus جيدة لإزالة الرنا الريباسي المعروفة من نموذجي الجراثيم إيجابية وسلبية الغرام (انظر مواصفات الصانعين)، ولكن أقل متوافقة مع الرنا الريباسي من الميكروبات غير معروف. ونتيجة لذلك، قد تكون إزالة أقل كفاءة لمدة 8-10 عينات metagenomic. الى جانب ذلك، كان الإخلاص وفرة مرنا مشكوك عندما تم تطبيق العلاج نوكلياز خارجية 11. وعموما، كان الطرح القائم على استنزاف الرنا الريباسي أقل انحيازا وأكثر فعالية في تخصيب مرنا في إعدادات metagenomic 10-13.

القناة الهضمية البعوض تستوعب المجتمع الميكروبية الحيوية 14. ونحن مهتمون في وصف وظيفة القناة الهضمية microbiome البعوض باستخدام RNA-SEQ. في عينة الحمض النووي الريبي معزولة عن الشجاعة البعوض، سواء RNA البعوض والجراثيم موجودة. هنا، نحن تصف بروتوكول تعديل لاستخدام الرنا الريباسي المجتمع تحقيقات محددة في استنزاف بكفاءة الرنا الريباسي البعوض والجراثيم عن طريق التهجين مطروح. ومرنا الناتجةعينات المخصب المناسبة لRNA-SEQ. ويصور سير العمل الكلي في الشكل 1.

Protocol

إجراء

1. البعوض تربية

  1. الخلفية البعوض الأنوفيلة الغامبية سلالة G3 في insectary 27.5 ° C في ذات الرطوبة 80٪ و12:12 دورة ساعة من الضوء / الظلام.
  2. تتغذى اليرقات مع القط الغذاء الأرضي مع الخميرة في نسبة 1:1.
  3. تغذية البعوض البالغ على دم الفئران لمدة 3 أيام في آخر ظهور لإنتاج البيض.

2. البعوض الوتر تشريح

  1. أدوات تشريح الأوتوكلاف (الشرائح وملقط).
  2. جمع 50 البعوض باستخدام الشافطة ووضعها على السرير CO تدفق 2 (في نهاية المطاف Flypad). شطف عينة البعوض بشكل تسلسلي في أطباق بتري تحتوي على 3 الإيثانول 70٪ لتنظيف سطح الجسم البعوض.
  3. وضع العينة على شريحة زجاجية تحت stereomicroscopy. إزالة الأمعاء.
  4. جمع 50 الشجاعة في حالة لعزل الحمض النووي metagenomic. جمع 50 الشجاعة في حالة عزلة عن RNA metagenomic.

3. Metagenomic DNA عزل

ملاحظة: يتم عزل DNA Metagenomic باستخدام ميتا-G-DNA نومي عزل كيت (التكنولوجيات الحيوية EPICENTRE) مع التعديل هو موضح أدناه.

  1. وضع 50 في 300 الشجاعة البعوض TE ميكرولتر. التجانس لهم لمدة 1 دقيقة باستخدام بيو جنرال PRO200 الخالط (PRO العلمي المؤتمر الوطني العراقي، الولايات المتحدة الأمريكية) في 2،000 دورة في الدقيقة السرعة على الجليد.
  2. إضافة 2 ميكرولتر من محلول الليزوزيم جاهزة وليز و 1 ميكرولتر من ريبونوكلياز A إلى تعليق الخلية. مزيج من vortexing واحتضان في C ° 37 لمدة 30 دقيقة.
  3. إضافة 300 ميكرولتر من التلوي يزيس محلول (2X) و 1 ميكرولتر من K بروتين إلى الأنبوب. مزيج من vortexing. لفترة وجيزة نبض أجهزة الطرد المركزي في أنبوب للتأكد من أن جميع من الحل هو في الجزء السفلي من الأنبوب، واحتضان في 65 ل° C 15 دقيقة، باردة لدرجة حرارة الغرفة، ثم مكان على الجليد لمدة 3-5 دقيقة.
  4. إضافة 350 ميكرولتر من البروتين MPC الكاشف الأمطار إلى أنبوب ومزيج من vortexing بقوة لمدة 10 ثانية.
  5. بيليه رانه الحطام بواسطة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 12000 XG في 4 درجات مئوية.
  6. نقل طاف لأنبوب مل 2-نظيفة، وتجاهل بيليه.
  7. إضافة 570 ميكرولتر من الأيزوبروبانول لطاف. مزيج من الأنبوب مرات عدة قلب.
  8. بيليه الحمض النووي بواسطة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 12000 XG في 4 درجات مئوية. إزالة الأيزوبروبانول دون طرد بيليه DNA.
  9. إضافة 500 ميكرولتر من الايثانول 75٪ لغسل بيليه. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 12000 XG في C. ° 4 إزالة الإيثانول من دون إزعاج بيليه DNA. الهواء تجفيف بيليه في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة. ملاحظة: لا الإفراط في تجفيف بيليه DNA.
  10. إعادة تعليق بيليه DNA في 50 ميكرولتر من العازلة TE.
  11. تحقق من صحة حجم DNA المعزولة من خلال المقارنة مع الحمض النووي تحكم Fosmid (40 KB و 100 نانوغرام / ميكرولتر) الواردة في هذه المجموعة، عن طريق الكهربائي للهلام هلام الاغاروز على 1٪.

4. مجموع RNA العزلة

ملاحظة: تنظيف منطقة العملمع RNaseZap للحد من التلوث ريبونوكلياز. تم عزل الحمض النووي الريبي Metagenomic من عينات الأمعاء البعوض باستخدام الكاشف عزل TriPure (روش) مع تعديل طفيف.

  1. وضع 50 الشجاعة البعوض في أنبوب مل 2-مع 500 ميكرولتر TriPure الكاشف عزل. التجانس لمدة 1 دقيقة في 2،000 دورة في الدقيقة السرعة على الجليد باستخدام الخالط. اسمحوا الجلوس في RT لمدة 5 دقائق للسماح للتفكك المجمعات البروتين النووي.
  2. إضافة 100 ميكرولتر الكلوروفورم ودوامة لمدة 12 ثانية، وترك الجلوس في RT لمدة 2 دقيقة.
  3. الطرد المركزي في 10000 XG لمدة 10 دقيقة. تأخذ بعناية الأنبوب من دون إزعاج مراحل فصل.
  4. نقل المرحلة المائية إلى أنبوب جديد، إضافة 250 ميكرولتر الأيزوبروبانول، تخلط جيدا، ووضع في -20 ° C لمدة 20 دقيقة.
  5. الطرد المركزي في 12000 XG لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية لRNA راسب.
  6. تجاهل طاف دون طرد بيليه. غسل بيليه مع الايثانول 75٪ 750 ميكرولتر.
  7. ماصة قبالة طاف دون الإخلال بيليه. Aالأشعة تحت الحمراء أنبوب تجفيف لمدة 2 دقيقة.
  8. إعادة تعليق على RNA مع 30 ميكرولتر المياه مجانا نوكلياز.
  9. علاج مع الحمض النووي الريبي مجموع الدناز في C ° 37 لمدة 20 دقيقة، ثم تعطيل والدناز من احتضان عند 75 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. RNA راسب مع الإيثانول وRNA resuspend في 30 ميكرولتر المياه مجانا نوكلياز.
  10. تحديد كمية الحمض النووي الريبي مجموع باستخدام NanoDrop.

5. الريباسي RNA استنفاد

ملاحظة: تم وضع بروتوكول يعتمد على الأساليب المذكورة سابقا 12،13،15.

  1. PCR التضخيم من الجينات الريباسي شظايا الحمض النووي الريبي
    هذه الخطوة بإنشاء حمامات عينة محددة الرنا الريباسي، التي سيتم استخدامها كقوالب لفي النسخ المختبر لإنتاج مضاد للاحساس الريباسي الحمض النووي الريبي (arRNA) تحقيقات التي هي مجانية لالرنا الريباسي في العينة RNA الكلي.
    1. تصميم وتركيب مجموعات التمهيدي لالرنا الريباسي جزء PCR (الجدول 1).
    2. تشغيل PCR في 50ميكرولتر رد فعل البلمرة DNA باستخدام طق (QIAGEN) مع 50 نانوغرام قالب DNA، 1 × PCR العازلة، المغنيسيوم 1.5mM 2 الكلورين، 0.2 ميكرومتر الاشعال مع 35 دورات يبدل طبيعة في 94 درجة مئوية لمدة 10 ثانية، 15 ثانية الصلب عند 40 درجة مئوية لمدة AMPLICON 23S البكتيرية، و 50 ° C للamplicons أخرى، وتمتد في 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة (التمديد النهائي في 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق).
    3. عرض المنتجات PCR على 1٪ الاغاروز هلام.
    4. تنقية المنتجات PCR PCR باستخدام تنقية QIAquick عدة مع شطف العازلة في 50 ميكرولتر شطف. قياس تركيز باستخدام NanoDrop.
  2. في النسخ المختبر من البيوتين التي تحمل علامات تحقيقات الرنا الريباسي المضادة للإحساس (arRNA). ملاحظة: في هذه الخطوة، وقد تم تجميع عينة محددة من تحقيقات amplicons الرنا الريباسي مختلف باستخدام T7 MEGAscript عدة.
    1. إعداد رد فعل 20 ميكرولتر لكل عينة محددة الرنا الريباسي AMPLICON عن طريق خلط المكونات أدناه (الجدول 2). احتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. ملاحظة: عادة غلة رد فعل> RNA ميكروغرام 50.
    2. إضافة 1 ميكرولتر الدناز I (المدرجة في المجموعة) إلى رد فعل واحتضان في C ° 37 لمدة 20 دقيقة لإزالة قالب DNA.
    3. إضافة 100 ميكرولتر الإيثانول بنسبة 100٪ إلى رد فعل، الطرد المركزي في 12000 XG لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية ليعجل توليفها arRNA. تجاهل طاف وغسل بيليه مع الايثانول 75٪ 750 ميكرولتر. إعادة تعليق تحقيقات RNA في 50 ميكرولتر المياه مجانا نوكلياز.
    4. تحديد تركيز الحمض النووي الريبي باستخدام NanoDrop. تحقيقات المحل في -80 درجة مئوية.
  3. الرنا الريباسي الطرح مع arRNA المعقدة البيروكسيديز. ملاحظة: هذه الخطوة توظف arRNA المعقدة البيروكسيديز لهجن لالرنا الريباسي في العينة RNA الكلي. يتم التقاط الهجينة الرنا الريباسي-arRNA من streptavidin المغلفة الخرز المغناطيسي. ويستند هذا الإجراء على بروتوكول الموصوفة في المرجع 13 مع تعديلات طفيفة.
    1. الكواشف
      1. إعداد 0،1 N هيدروكسيد الصوديوم، الصوديوم الكلور 20XIDE-سترات (SSC) و 1 X SSC مع الفورماميد 20٪.
    2. تهجين
      1. مزيج RNA ميكروغرام 1 المجموع مع 16S 23S البكتيرية وتحقيقات (0.75 ميكروغرام لكل منهما)، 18S 28S البعوض وتحقيقات (0.75 ميكروغرام لكل منهما)، 1 ميكرولتر ريبونوكلياز المانع، 2.5 ميكرولتر 20X العازلة SSC، 10 ميكرولتر الفورماميد 100٪ في أنبوب PCR ميكرولتر 200 ، إضافة نوكلياز خالية المياه إلى 50 ميكرولتر.
      2. وضع أنبوب التفاعل في cycler الحرارية واحتضان عند 70 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لفتح هيكل الثانوي والطريق المنحدر إلى أسفل إلى 25 ° C باستخدام 5 ° C الزيادات لمدة 1 دقيقة لكل ° C للسماح للتهجين من تحقيقات والرنا الريباسي arRNA.
    3. إزالة الرنا الريباسي
      1. نقل 300 ميكرولتر الخرز المغلفة streptavidin في أنبوب مل 1.7. وضع أنبوب على رف الفصل المغناطيسي لشل الخرز. إزالة طاف. إعادة تعليق الخرز في 300 ميكرولتر من هيدروكسيد الصوديوم و0.1N ميلX أيضا. وضع أنبوب عودة إلى رف المغناطيسي وماصة قبالة طاف. إعادة تعليق الخرز في 300 ميكرولتر من 1X SSC، تخلط جيدا، والخرز شل ماصة قبالة طاف. تكرار غسل مع 300 ميكرولتر من 1X وقت واحد أكثر SSC.
      2. تقديم 3 مأخوذة من الخرز، 100 ميكرولتر لكل منهما، في أنابيب مل 1.7. وضع أنبوب على الرف المغناطيسي، وإزالة طاف بواسطة pipetting. ملاحظة: يتم استخدام مأخوذة من الخرز لمدة 3 جولات من التقاط المعقدة البيروكسيديز الرنا الريباسي-arRNA الهجينة.
      3. إضافة 50 ميكرولتر 1X SSC مع الفورماميد 20٪ في رد فعل 50 ميكرولتر التهجين. نقل رد الفعل في أنبوب قسامة حبة الأول، وتخلط جيدا. احتضان RT في لمدة 10 دقيقة للسماح استولت على التحقيق المعقدة البيروكسيديز-الرنا الريباسي الهجينة من الخرز streptavidin. نفض الغبار الأنبوب كل دقيقة 2 إلى مزيج أثناء الحضانة.
      4. وضع أنبوب على الرف المغناطيسي لشل الخرز، ونقل إلى طاف عليق 2عشق من الخرز، تخلط جيدا واحتضان على النحو الوارد أعلاه. إجراء القبض الثالثة نقل طاف في أنبوب الثالث من الخرز. خلط واحتضان.
      5. نقل غير الرنا الريباسي طاف في أنبوب جديد وتنقية السلوك باستخدام مجموعة MinElute RNeasy لإزالة الفورماميد بعد دليل الشركة المصنعة.
      6. التحقق من كفاءة استنفاد الرنا الريباسي باستخدام RNA 6000 اجيلنت بيكو عدة شرائح على Bioanalyzer (الشكل 4).

ملاحظة: إن المنضب الرنا الريباسي عينات الحمض النووي الريبي تتعرض لمرنا التضخيم إذا لزم الأمر 8.

النتائج

أن البروتوكول تضمن ثلاثة أقسام: (1) إعداد قوالب DNA PCR metagenomic لالرنا الريباسي، (2) إنشاء عينة محددة تحقيقات الرنا الريباسي القبض، (3) استنزاف الرنا الريباسي من الحمض النووي الريبي مجموع بواسطة التهجين مطروح. عزل جودة عالية DNA RNA metagenomic وضروري في العملية برمتها. وتعديل عزل ال...

Discussion

A المجتمع الميكروبية المعقدة تكمن في النظام البيئي الأمعاء البعوض 14،16،17. يمكن Metatranscriptomic التسلسل (RNA-يليها) تكشف عن المعلومات الفنية التي تعتمد السياق استجواب من قبل الجراثيم كامل transcriptome 4،18. من الناحية الفنية، بنسبة ضئيلة من د (T) تخصيب بوساطة من بروكاريوت?...

Disclosures

الكتاب تعلن أنه ليس لديهم المصالح المتنافسة المالية.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح 1SC2GM092789-01A1، وكان MS باحث هيوز الطبي NMSU هوارد برامج مؤسسة بحوث الجامعية. كان موجها الفيديو والتي تنتجها لاناسا ايمي وبتنسيق من الدكتور فيليب لويس مع معهد الإعلام الإبداعي في NMSU.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Reagent/Material
Meta-G-Nome DNA isolation kitEpicentreMGN0910Metagenomic DNA isolation
TriPure Roche11667165001Mdetagenomic RNA isolation
MEGAscript T7 kitAmbionAM1334In vitro synthesis of RNA probes
RNaseZapAmbionAM9780RNase free working area
Biotin-16-UTPRoche11388908910In vitro synthesis of RNA
Biotin-11-CTPRoche4739205001In vitro synthesis of RNA
Streptavidin magnetic beadsNEBS1420SCapture of rRNA hybrids
Magnetic separation rackNEBS1506SCapture of rRNA hybrids
RNeasy mini kitQIAGEN74104Purification of subtracted RNA
RNase-Free DNase SetQIAGEN79254Removal DNA contamination
Agilent RNA 6000 Pico KitAgilent Technologies Inc.5067-1513Electropherogram of RNA
Equipment
Bio-Gen PRO200 HomogenizerPRO Scientific01-01200Mosquito gut tissue homogenization
NanoDrop 1000 SpectrophotometerThermo ScientificDNA & RNA quantitation
2100 BioanalyzerAgilent Technologies Inc.G2940CAElectropherogram of RNA

References

  1. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat. Rev. Genet. 10, 57-63 (2009).
  2. Xie, W., et al. Pyrosequencing the Bemisia tabaci Transcriptome Reveals a Highly Diverse Bacterial Community and a Robust System for Insecticide Resistance. PLoS One. 7, e35181 (2012).
  3. Xie, L., et al. Profiling the metatranscriptome of the protistan community in Coptotermes formosanus with emphasis on the lignocellulolytic system. Genomics. 99, 246-255 (2012).
  4. Gosalbes, M. J., et al. Metatranscriptomic approach to analyze the functional human gut microbiota. PLoS One. 6, e17447 (2011).
  5. Urich, T., et al. Simultaneous assessment of soil microbial community structure and function through analysis of the meta-transcriptome. PLoS One. 3, e2527 (2008).
  6. Gilbert, J. A., et al. Detection of large numbers of novel sequences in the metatranscriptomes of complex marine microbial communities. PLoS One. 3, e3042 (2008).
  7. Gifford, S. M., Sharma, S., Rinta-Kanto, J. M., Moran, M. A. Quantitative analysis of a deeply sequenced marine microbial metatranscriptome. ISME J. 5, 461-472 (2011).
  8. Poretsky, R. S., et al. Comparative day/night metatranscriptomic analysis of microbial communities in the North Pacific subtropical gyre. Environmental microbiology. 11, 1358-1375 (2009).
  9. Shrestha, P. M., Kube, M., Reinhardt, R., Liesack, W. Transcriptional activity of paddy soil bacterial communities. Environmental Microbiology. 11, 960-970 (2009).
  10. Mettel, C., Kim, Y., Shrestha, P. M., Liesack, W. Extraction of mRNA from soil. Applied and Environmental Microbiology. 76, 5995-6000 (2010).
  11. He, S., et al. Validation of two ribosomal RNA removal methods for microbial metatranscriptomics. Nat. Meth. 7, 807-812 (2010).
  12. Pang, X., et al. Bacterial mRNA purification by magnetic capture-hybridization method. Microbiol. Immunol. 48, 91-96 (2004).
  13. Stewart, F. J., Ottesen, E. A., DeLong, E. F. Development and quantitative analyses of a universal rRNA-subtraction protocol for microbial metatranscriptomics. ISME J. 4, 896-907 (2010).
  14. Wang, Y., Gilbreath, T. M., Kukutla, P., Yan, G., Xu, J. Dynamic gut microbiome across life history of the malaria mosquito Anopheles gambiae in Kenya. PLoS One. 6, e24767 (2011).
  15. Su, C., Sordillo, L. M. A simple method to enrich mRNA from total prokaryotic RNA. Mol. Biotechnol. 10, 83-85 (1998).
  16. Gusmao, D. S., et al. Culture-dependent and culture-independent characterization of microorganisms associated with Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) (L.) and dynamics of bacterial colonization in the midgut. Acta Trop. 115, 275-281 (2010).
  17. Lindh, J. M., Terenius, O., Faye, I. 16S rRNA gene-based identification of midgut bacteria from field-caught Anopheles gambiae sensu lato and A. funestus mosquitoes reveals new species related to known insect symbionts. Appl. Environ. Microbiol. 71, 7217-7223 (2005).
  18. Simon, C., Daniel, R. Metagenomic analyses: past and future trends. Appl. Environ. Microbiol. 77, 1153-1161 (2011).
  19. Wang, Y., Qian, P. Y. Conservative fragments in bacterial 16S rRNA genes and primer design for 16S ribosomal DNA amplicons in metagenomic studies. PLoS One. 4, e7401 (2009).
  20. Hunt, D. E., et al. Evaluation of 23S rRNA PCR primers for use in phylogenetic studies of bacterial diversity. Appl. Environ. Microbiol. 72, 2221-2225 (2006).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

74 Eukaryota metagenomics metatranscriptome RNA microbiome RNA DNA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved