核糖体RNA的蚊子肠道宏基因组RNA-seq的枯竭

摘要

核糖体RNA（rRNA）的消耗协议的开发是为了丰富信使RNA（mRNA），RNA-seq中蚊子的肠道metatranscriptome的。由蚊子和其肠道微生物样品的具体rRNA探针，用于去除rRNA基因通过减法，创建了。协议的性能的影响，可能会导致在约90-99％的rRNA基因的去除。

摘要

蚊子肠道适应动态的微生物群落昆虫的生命周期的不同阶段之间。表征的遗传能力和功能的肠道社区将提供洞察肠道菌群的影响蚊子的生命特质。宏基因组RNA序列分析转录从各种微生物，微生物群落，已经成为一个重要的工具。信使RNA通常仅包括1-3％的总RNA，而rRNA基因构成约90％。它是具有挑战性的丰富信使RNA从宏基因组微生物的RNA样品的原核表达，因为大多数物种缺乏稳定的poly（A）尾巴。这可以防止寡聚d（T）介导的mRNA隔离。在这里，我们描述了一个协议，采用衍生rRNA基因的捕获探针删除rRNA基因从宏基因组总RNA样品的样品。首先，蚊子和社区从宏基因组DNA样品的微生物和大亚基rRNA基因片段的扩增。然后，在交流了nity特定的生物素化的反义核糖体RNA的探针使用T7 RNA聚合酶在体外合成。的生物素化的rRNA基因探针杂交的总RNA。杂交捕获由链霉亲和素包被的磁珠，从总RNA中移除。基于此减法协议有效地消除蚊子和从总RNA样品中的微生物的rRNA。 mRNA的富集样品被进一步处理的RNA扩增和RNA序列。

引言

新一代测序技术已经极大地推进了宏基因组学研究评估的分类组成和遗传功能的微生物组合。 RNA测序（RNA-Seq的^）可以绕过文化为基础的方法，，调查微生物metatranscriptomes在不同的情况下^2-5。微生物的RNA-seq的一个主要障碍是丰富表达的困难，没有稳定的聚腺苷酸化的原核细胞的mRNA分子。因此，寡d（T）介导的信使富集是不适用的。删除丰富的rRNA基因是一种替代方法来丰富表达。耗竭商业rRNA基因包，如细菌的mRNA Microexpress富集试剂盒（Ambion），RiboMinus转录分离试剂盒（细菌）（Life Technologies公司），和的mRNA-ONLY原核mRNA分离试剂盒（震中）优先降解与核酸外切酶的rRNA基因，已经使用了除去rRNA的^6-8。然而，捕获探针Microexpress或RiboMinus用于除去已知的rRNA从典型的革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌（参见制造商的规格）是良好的，但不兼容从未知的微生物与rRNA。因此，去除效率可能较低宏基因组样品^8-10。此外，mRNA丰度的保真度是有问题的核酸外切酶处理时，适用^11。总体而言，基于减法rRNA基因消耗较少偏见的和更有效的宏基因组的基因富集设置^10-13。

蚊子肠道容纳一个充满活力的微生物群落^14。我们有兴趣在蚊子的肠道微生物利用RNA-Seq的功能特征。在一个分离的RNA样品由蚊子胆量，蚊子和微生物的RNA存在。在这里，我们描述了修改后的协议，使用社区的具体rRNA探针能够有效地消耗蚊子和微生物的rRNA基因消减杂交技术。所得mRNARNA-Seq的丰富的样本是适当的。在图1中示出的整体的工作流。

研究方案

程序

1。蚊子饲养

1. 后蚊子冈比亚按蚊 G3在养虫株为27.5°C，湿度80％，光/暗周期12:12小时。
2. 与啤酒酵母的比例为1:1与地面的猫粮喂养幼虫。
3. 对小鼠血后第3天出现产蛋饲料成蚊。

2。蚊子肠道解剖

1. 高压灭菌器的清扫工具（幻灯片和钳）。
2. 使用抽气收集50个蚊子，把它们放在CO ₂流床（终极Flypad）。冲洗顺序在3个培养皿中含有70％的酒精擦拭蚊子体表面的蚊子标本。
3. 放置下的立体显微镜载玻片上的检体。删除肠道。
4. 收集50个胆为条件宏基因组DNA的提取。收集50个胆量每宏基因组RNA的提取条件。

3。宏基因组DNA的提取

注意:宏基因组DNA中分离，与后述的变形例中使用的Meta-G-诺姆DNA提取试剂盒（震中Biotechnologies公司）。

1. 将50个蚊子胆300μLTE。匀化1分钟使用生物根PRO200匀浆器（PRO科学公司，美国）在转速2000rpm下在冰上。
2. 的准备裂解溶菌酶溶液中加入2μl和1μl核糖核酸酶A在细胞悬浮液。混合涡旋和孵化，在37°C 30分钟。
3. 加入300微升元裂解液（2X）和1μl蛋白酶K的管。预混液。简言之脉冲离心管，以确保所有的解决方案是在该管的底部，并在65℃孵育15分钟后，冷却至室温，然后放置在冰上3-5分钟。
4. 加入350微升的的MPC蛋白质沉淀试剂管和混合剧烈振荡，持续10秒。
5. 颗粒吨他碎片通过离心分离10分钟，以12,000 xg在4℃下
6. 将上清液转移到一个干净的2毫升管中，并弃去沉淀。
7. 向上清液中加入570微升异丙醇。混合通过反转管几次。
8. 通过以12,000 xg离心10分钟沉淀DNA在4℃下不松脱DNA沉淀的情况下，除去异丙醇。
9. 加入500微升的75％乙醇洗涤沉淀。在4℃下以12,000 xg离心5分钟除去乙醇，而不会干扰DNA沉淀。空气干燥的颗粒在室温下2分钟。注意:不要过度干燥DNA沉淀。
10. 在50μl的TE缓冲液中重悬DNA沉淀。
11. 验证的大小比较（40 kb的100纳克/微升），在试剂盒中提供的的F粘粒控制DNA的分离的DNA，通过凝胶电泳，在1％琼脂糖凝胶电泳。

4。总RNA提取

注意:清洁工作区域RNaseZap，以减少RNase污染。宏基因组RNA的提取使用TriPure隔离试剂（Roche）进行了小修改的蚊子肠道标本。

1. 把蚊子胆50 2毫升试管中用500μlTriPure的隔离试剂。均化1分钟，在转速2000rpm下使用均化器在冰上。静置5分钟，以允许在RT核蛋白复合物的离解。
2. 加入100μl氯仿和旋涡，持续12秒，2分钟，静置在RT。
3. 离心10,000 xg离心10分钟。管小心地取出，而不会干扰相分离。
4. 水相转移到新管中，加入250μl异丙醇，充分混匀，并在-20°C 20分钟。
5. 离心机在4℃下以12,000 xg离心10分钟以沉淀RNA。
6. 弃上清没有撞出颗粒。 750μL75％乙醇洗涤沉淀。
7. 用移液管除去上清液，而不会干扰沉淀。一红外干燥管，持续2分钟。
8. 重悬的RNA 30μL无核酸酶的水。
9. 治疗的总RNA用DNase在37℃下20分钟，然后灭活DNA酶孵育在75℃下持续15分钟。用乙醇和重悬在30μl无核酸酶的水的RNA沉淀RNA。
10. 总RNA，使用的NanoDrop的数量决定的。

5。核糖体RNA亏损

注:该协议的开发根据上述方法^12,13,15。

1. 核糖体RNA基因片段的PCR扩增
   此步骤创建特定样品的rRNA池，将被用作体外转录的模板，以产生反义核糖体RNA（arRNA）探针是免费的rRNA基因中的总RNA样品。
   1. 设计并合成引物组合rRNA基因片段PCR（ 表1）。
   2. 在50个运行PCRμl反应体系中使用Taq DNA聚合酶（Qiagen公司制）与50 ng模板DNA，1×PCR缓冲液，1.5MM的Mg ₂氯，0.2μM的引物，35个循环的变性在94℃下持续10秒，退火15秒，在40℃下进行细菌23S的扩增子，和50℃下进行其他的扩增子，和延伸在72℃下1分钟（在72℃下5分钟的最后延伸）。
   3. 查看PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳。
   4. 在50μl洗脱缓冲液洗脱使用QIAquick PCR纯化试剂盒纯化PCR产物。量化使用的NanoDrop的浓度。
2. 在生物素标记的反义的rRNA的探针（arRNA）的体外转录。注意:在此步骤中，样品从各种rRNA基因的扩增子的特异性探针使用MEGAscript T7试剂盒合成。
   1. 通过混合下面的成分（ 表2），设置了一个20μl反应对每个样品的特定rRNA基因的扩增子。孵育过夜，在37°C。 注:通常的反应产率> 50微克的RNA。
   2. 加入1μlDNA酶I（包括在试剂盒中）的反应，并在37℃下孵育20分钟，以除去DNA模板。
   3. 加入100μl100％乙醇中反应，离心机在4℃下以12,000 xg离心10分钟以沉淀，合成arRNA。弃去上清，并用750微升75％乙醇洗涤沉淀。在50μl无核酸酶的水重悬RNA探针。
   4. 量化使用的NanoDrop的RNA浓度。商店探针在-80℃下
3. rRNA基因减法与生物素arRNA。注意:此步骤采用生物素化的arRNA杂交rRNA基因中的总RNA样品。由链霉亲和素包被的磁珠的rRNA-arRNA的杂交被捕获。程序是基于参考文献13中描述的协议，与细微的修改。
   1. 试剂
      1. 准备0.1N氢氧化钠，20X钠氯碱的ide-柠檬酸钠（SSC）和1×SSC，20％甲酰胺。
   2. 杂交
      1. 与细菌16S和23S探针（0.75微克），蚊虫18S和28S探针（0.75微克），1微克的总RNA混合，加入1μlRNase抑制剂，2.5微升20X SSC缓冲液，10微升100％甲酰胺中的200微升PCR管，附加组件的无核酸酶的水至50μl。
      2. 反应管放置在热循环仪和孵育在70℃下5分钟，以打开二级结构和斜坡下降至25℃下，使用5℃的增量，每个℃下1分钟，以允许杂交rRNA和arRNA探头。
   3. 去除rRNA基因
      1. 成1.7 ml管，将300微升的链霉亲和素包被的磁珠。将管上的磁分离的机架固定的珠子。除去上清液。在300μl的0.1N NaOH和英里悬浮磁珠X井。管放置返回到磁性机架和移液除去上清液。悬浮磁珠在300μl的1×SSC，拌匀，固定的珠子和吸液管除去上清液。重复洗用300μl的1×SSC一个更多的时间。
      2. 3等分珠，每100μL，在1.7毫升管。管放置磁性机架上，并通过移液除去上清液。注:取珠用于3轮捕获生物素标记的rRNA的arRNA杂交。
      3. 加入50μl的1×SSC，用20％甲酰胺到50μl的杂交反应。转移反应到第一胎圈等分管的，拌匀。在RT下孵育10分钟，以允许由链霉抗生物素蛋白磁珠被捕获的生物素化的探针的rRNA杂种。滑动管在孵化混合，每2分钟。
      4. 管放置磁性机架上，以固定的珠子，将上清转移至所述第二aliqUOT珠，拌匀和孵化如上。进行第三次捕获通过转移到第三管珠上清液。混合和孵化。
      5. 非rRNA基因转移上清到一个新的管并进行净化，用RNeasy MinElute套件，除去甲酰胺制造商提供的使用手册。
      6. 请检查的rRNA基因消耗效率的使用Agilent RNA 6000的Pico芯片试剂盒在生物分析仪（ 图4）。

注:如有必要^，8 mRNA扩增的rRNA耗尽的RNA样品。

结果

该协议包括3个部分:（1）准备rRNA基因PCR宏基因组DNA模板（2）消减杂交技术创造特定的样品采集rRNA探针（3）消耗的rRNA总RNA。高品质的宏基因组DNA和RNA分离的整个过程是必不可少的。修改后的Meta-G-的诺姆DNA隔离协议产生高品质的宏基因组DNA从蚊子的胆量， 如图2所示。它可以是具有挑战性的蚊子胆中分离出高品质的总RNA。这可能是由于存在的各种酶，核糖核酸酶，在蚊子的胆量。我们...

讨论

一个复杂的微生物群落居住在蚊子的肠道生态系统的^14,16,17。 Metatranscriptomic测序（RNA-seq的）上下文相关的功能信息可以透露讯问的整个微生物的转录^4,18。从技术上讲，低聚的d（T）介导的富集的原核mRNA的是不适用的，由于缺乏稳定的聚（A）尾的使者。或者，rRNA的耗尽已用于mRNA的富集。在这里，我们开发了消耗rRNA基因rRNA基因探针，从自己在蚊子的肠道微生物群落宏基因组DNA一?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Reagent/Material
Meta-G-Nome DNA isolation kit	Epicentre	MGN0910	Metagenomic DNA isolation
TriPure	Roche	11667165001	Mdetagenomic RNA isolation
MEGAscript T7 kit	Ambion	AM1334	In vitro synthesis of RNA probes
RNaseZap	Ambion	AM9780	RNase free working area
Biotin-16-UTP	Roche	11388908910	In vitro synthesis of RNA
Biotin-11-CTP	Roche	4739205001	In vitro synthesis of RNA
Streptavidin magnetic beads	NEB	S1420S	Capture of rRNA hybrids
Magnetic separation rack	NEB	S1506S	Capture of rRNA hybrids
RNeasy mini kit	QIAGEN	74104	Purification of subtracted RNA
RNase-Free DNase Set	QIAGEN	79254	Removal DNA contamination
Agilent RNA 6000 Pico Kit	Agilent Technologies Inc.	5067-1513	Electropherogram of RNA
			Equipment
Bio-Gen PRO200 Homogenizer	PRO Scientific	01-01200	Mosquito gut tissue homogenization
NanoDrop 1000 Spectrophotometer	Thermo Scientific		DNA & RNA quantitation
2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies Inc.	G2940CA	Electropherogram of RNA