모기 내장 Metagenomic RNA-seq에 대한 Ribosomal RNA의 고갈

요약

ribosomal RNA (rRNA) 고갈 프로토콜은 모기 내장 metatranscriptome의 RNA-seq를위한 메신저 RNA를 (mRNA) 풍부하게하기 위해 개발되었습니다. 뺄셈을 통해 rRNA를 제거하는 데 사용 된 샘플 특정 rRNA 프로브은, 모기와 내장 미생물에서 만들어졌습니다. 프로토콜의 성능은 rRNA의 약 90~99%의 삭제 될 수 있습니다.

초록

모기 직감은 곤충의 생활주기의 다른 단계에 걸쳐 동적 미생물 커뮤니티를 수용 할 수 있습니다. 내장 커뮤니티의 유전 용량과 기능의 특성은 모기 삶의 특성에 내장 microbiota의 효과에 대한 통찰력을 제공 할 것입니다. Metagenomic RNA - Seq는 미생물 지역 사회에 존재하는 다양한 미생물에서 transcriptomes을 분석 할 수있는 중요한 도구가되었습니다. rRNA는 약 90 %를 구성하는 동안 메신저 RNA는 일반적으로, 총 RNA의 1-3 위에 만 %를 포함한다. 대부분의 prokaryotic mRNA 종은 안정 폴리 (A) 꼬리 부족 때문에 metagenomic 미생물 RNA 샘플에서 메신저 RNA를 풍부하게 도전하고 있습니다. 이 oligo D (T) 매개의 mRNA 절연을 방지합니다. 여기, 우리는 rRNA가 metagenomic 총 RNA 샘플에서 rRNA를 제거하는 프로브를 캡처 파생 샘플을 사용 프로토콜을 설명합니다. 시작하려면, 모기와 미생물의 크고 작은 subunit의 rRNA 조각 모두 metagenomic 지역 사회의 DNA 샘플에서 증폭됩니다. 그런 다음, community 특정 biotinylated 안티센스 RNA ribosomal 프로브는 T7 RNA 중합 효소의를 사용하여 체외에서 합성되어 있습니다. biotinylated rRNA 프로브는 총 RNA에 hybridized 있습니다. 하이브리드는 streptavidin - 코팅 구슬에 의해 캡처 된 총 RNA에서 제거됩니다. 이 빼기 기반 프로토콜을 효율적으로 전체 RNA 샘플에서 모기와 미생물 rRNA를 모두 제거합니다. mRNA 농축 샘플은 또한 RNA의 증폭 및 RNA-Seq에 처리됩니다.

서문

차세대 시퀀싱 기술은 크게 분류 학적 조성과 미생물 조립의 유전자 기능을 평가 할 수 있도록하여 metagenomics 연구를 전진했다. RNA-시퀀싱 (RNA-Seq) ^{1 서로} 다른 상황 ^2-5에서 미생물 metatranscriptomes를 조사 문화 기반 방법을 무시할 수 있습니다. prokaryotic mRNA 종은 안정적으로 polyadenylated되지 않으므로 미생물 RNA-seq에 대한 주요 장애물은 mRNA을 풍요롭게에 어려움이 있습니다. 따라서, oligo D (T) 매개 메신저 농축이 적용되지 않습니다. 풍부한 rRNA의 제거는 mRNA을 풍부하게 할 수있는 대안 방법입니다. 이러한 Microexpress 박테리아 mRNA 농축 키트 (Ambion), RiboMinus Transcriptome 절연 키트 (박테리아) (생명 기술), 그리고 우선적으로 exonuclease와 rRNA을 방해 mRNA-ONLY Prokaryotic mRNA 절연 키트 (Epicentre)와 같은 상업 rRNA 고갈 키트는 사용되었다 rRNA ^6-8를 제거하십시오. Microexpress에서 그러나, 캡처 프로브또는 RiboMinus은 (제조업체의 사양을 참조) 전형적인 그람 양성과 그람 음성 세균에서 알려진 rRNA를 제거에 좋은,하지만 알 수없는 미생물의 rRNA와 덜 호환됩니다. 따라서, 제거 metagenomic 샘플 ^8-10에 덜 효율적으로 할 수 있습니다. exonuclease 치료가 ^11을 적용했을 때 또, mRNA의 풍부한의 충실도 의심했다. 전반적으로, 뺄셈 기반 rRNA 고갈 적은 편견과 metagenomic 설정 ^10-13의 mRNA 농축에 더 효과적이었습니다.

모기 창자는 역동적 미생물 커뮤니티 ¹⁴ 숙박이 가능합니다. 우리는 RNA-Seq을 사용하여 모기 내장 microbiome의 기능을 특성화에 관심이 있습니다. 모기 내장 격리 RNA 샘플에서 모두 모기와 미생물의 RNA가 존재한다. 여기, 우리는 효율적으로 subtractive 하이브리드에 의해 모기와 미생물 rRNA를 고갈 지역 사회 특정 rRNA 프로브를 사용하는 수정 된 프로토콜을 설명합니다. 결과 mRNA농축 샘플 RNA-Seq에 적합합니다. 전체 흐름은 그림 1에 묘사되어 있습니다.

프로토콜

순서

1. 모기 양육

1. 27.5에서 insectary의 후면 모기 아노펠레스 gambiae G3 변형 ° C 어두운 / 빛의 80 % 습도와 12시 12분 시간주기에.
2. 비율 1시 1분에서 맥주의 효모와 지상 고양이 먹이와 애벌레 먹이를.
3. 3 일 계란 생산을위한 사후 출현에서 마우스의 피를 성인 모기를 먹이.

2. 모기 내장 해부

1. 압력솥 분해 도구 (슬라이드와 집게).
2. 흡인기를 사용하여 50 모기를 수집하고 CO ₂ 흐름 침대 (궁극적 Flypad)에 올려 놓습니다. 모기 몸 표면을 청소 70 % 에탄올을 포함하는 세 배양 접시에 순차적으로 모기 표본을 씻어.
3. stereomicroscopy 아래에 유리 슬라이드 표본을 놓으십시오. 내장을 제거합니다.
4. metagenomic DNA 절연을위한 조건 당 50 배짱를 수집합니다. metagenomic RNA 격리에 대한 조건 당 50 배짱를 수집합니다.

3. Metagenomic DNA 절연

참고 : Metagenomic의 DNA는 아래에 설명 된 수정과 메타 - G-노움 DNA 절연 키트 (Epicentre의 Biotechnologies)를 사용하여 절연되어 있습니다.

1. 300 μl TE에서 50 모기 용기를 놓습니다. 얼음에 속도 2,000 rpm으로 바이오 세대 PRO200 균질 (PRO 과학 Inc의, USA)를 사용하여 1 분 그들에게 균질화.
2. 바로 Lyse 라이소자임 솔루션 2 μl와 RNase 세포 현탁액에 1 μl를 추가합니다. 30 분에 37 ° C에서 vortexing하고 배양하여 섞는다.
3. 메타 용해 용액 (2X)와 튜브에 Proteinase K 1 μl 300 μl를 추가합니다. vortexing으로 섞는다. 간단히 솔루션의 모든 튜브의 바닥에있는 것을 보장하기 위해 튜브를 펄스 원심 분리기, 3 ~ 5 분을위한 얼음 후 실온에 시원한 15 분, 장소를 65 ° C에서 알을 품다.
4. 10 초에 힘차게 vortexing하여 관과 믹스에 MPC의 단백질 침전 시약의 350 μl를 추가합니다.
5. 펠릿 t4에 그는 12,000 XG에서 10 분을위한 원심 분리에 의한 파편 ° C.
6. 깨끗한 2 ML 튜브에 표면에 뜨는을 전송하고, 펠릿 폐기합니다.
7. 표면에 뜨는에 이소프로판올의 570 μl를 추가합니다. 반전 튜브를 여러 번에 섞는다.
8. 펠렛 4에 12,000 XG에서 10 분을위한 원심 분리하여 DNA ° C. DNA 펠렛을 dislodging없이 이소프로판올을 제거합니다.
9. 펠렛을 씻으 75 % 에탄올 500 μl를 추가합니다. 4 ° C.에서 12,000 XG에서 5 분 동안 원심 분리기 DNA 펠렛을 방해하지 않으면 서 에탄올을 제거합니다. 2 분 동안 실온에서 펠렛을 공기 건조. 참고 : DNA 펠렛 이상 건조하지 마십시오.
10. TE 버퍼 50 μl의 DNA 펠렛을 Resuspend.
11. 1 % 아가로 오스 겔의 겔 전기 영동을 통해 키트에서 제공하며 Fosmid 제어 DNA (100 NG / μl 40킬로바이트)에 비교하여 절연 DNA의 크기를 확인합니다.

4. 총 RNA 절연

참고 : 작업 영역을 청소RNase 오염을 최소화하기 RNaseZap을 갖추고 있습니다. Metagenomic RNA는 사소한 수정으로 TriPure 절연 시약 (로슈)를 사용하여 모기 내장 표본으로부터 격리되었다.

1. 500 μl TriPure 절연 시약과 2 ML 튜브에 50 모기 용기를 놔. 균질를 사용하여 얼음에 속도 2,000 rpm에서 1 분 동안 균질화. 핵 단백질 단지의 분리를 허용하도록 5 분에 RT에 앉아 보자.
2. 12 초 100 μl 클로로포름과 소용돌이를 추가하고 2 분에 RT에 앉아 보자.
3. 10 분 10,000 XG에 원심 분리기. 조심스럽게 불쾌감을 분리 단계없이 튜브를 꺼내.
4. 새로운 튜브에 수성 단계를 전송, 250 μl 이소프로판올을 추가 잘 혼합하고, 20 분에 -20 ° C에 넣어.
5. 4에 10 분에 12,000 XG에 원심 분리기 ° C 석출물 RNA합니다.
6. 펠렛을 dislodging하지 않고 표면에 뜨는 폐기하십시오. 750 μl 75 % 에탄올로 펠렛을 씻으십시오.
7. 펠렛을 방해하지 않고 표면에 뜨는을 피펫.IR은 2 분의 튜브를 건조.
8. 30 μl nuclease 무료 물로 RNA를 Resuspend.
9. 20 분에 37 ° C에서 DNase와 총 RNA를 처리 한 후 75 잠복기에 의해 DNase를 비활성화 15 분에 ° C. 30 μl nuclease 무료 물에 에탄올과 resuspend RNA와 석출물 RNA.
10. NanoDrop를 사용하여 총 RNA의 양을 결정합니다.

5. Ribosomal RNA 고갈

참고 :이 프로토콜은 이전에 설명한 방법 ^12,13,15에 따라 개발되었습니다.

1. ribosomal RNA 유전자 조각의 PCR 증폭
   이 단계는 전체 RNA 샘플에서 rRNA 할 무료입니다 안티 - 감각 ribosomal RNA (arRNA) 프로브를 생산하는 체외 스크립트에 대한 템플릿으로 사용됩니다 샘플 별 rRNA 풀을 만듭니다.
   1. rRNA 조각 PCR (표 1)에 대한 프라이머 세트를 디자인하고 합성.
   2. (50)에서 PCR을 실행50 NG DNA 템플릿, 1 개 PCR 버퍼, 1.5mM MG ₂ DNA 형성 촉매의 DNA 중합 효소 (Qiagen)를 사용하여 μl 반응 망할 CIA, 94에서 denaturing의 35주기와 0.2 μM 프리 머 ° C 10 초에 40에서 15 초 어닐링 ° C에 박테리아 23S amplicon, 50 ° C, 다른 amplicons, 72의 확장을위한 1 분 (72시 최종 확장 ° C 5 분)을위한 ° C.
   3. 1퍼센트 아가로 오스 겔에 PCR 제품을 볼 수 있습니다.
   4. 50 μl 용출 버퍼에 용출과 QIAquick PCR 정화 키트를 사용하여 PCR 제품을 정화. NanoDrop를 사용하여 농도를 정량화.
2. 비오틴 - 표시 안티 센스 rRNA 프로브 (arRNA)의 체외 스크립트합니다. 참고 :이 단계에서, 다양한 rRNA의 amplicons에서 샘플 특정 프로브는 MEGAscript T7 키트를 사용하여 합성합니다.
   1. 아래의 재료 (표 2) 혼합하여 각 샘플 특정 rRNA의 amplicon을위한 20 μl 반응을 설정합니다. 37 박 품다 ° C. 참고 : 일반적으로 반응 수율> 50 μg의 RNA.
   2. DNA 템플릿을 제거 할 20 분에 37 ° C에서 반응과 배양에 1 μl DNase I을 (키트에 포함)를 추가합니다.
   3. 4에 10 분에 12,000 XG에서 반응 100 μl 100 % 에탄올, 원심 분리기를 추가 ° C arRNA을 합성 침전 할 수 있습니다. 표면에 뜨는 무시하고 750 μl 75 % 에탄올로 펠릿을 씻는다. 50 μl nuclease 무료 물에 Resuspend RNA 프로브.
   4. NanoDrop를 사용하여 RNA 농도를 정량화. -80에서 저장 프로브 ° C.
3. biotinylated arRNA과 rRNA 빼기. 참고 :이 단계는 전체 RNA 샘플에서 rRNA에 잡종을 만들다 할 수있는 biotinylated arRNA을 사용합니다. rRNA-arRNA의 하이브리드는 streptavidin - 코팅 자성 구슬에 의해 캡처됩니다. 절차는 약간의 수정을 참조 13에 설명 된 프로토콜을 기반으로합니다.
   1. 시약
      1. 0.1 N NaOH, 20X 나트륨 chlor 준비IDE - 시트르산 (SSC)와 20 %의 포름 아미드 1 X SSC.
   2. 이종 교잡
      1. 세균 16와 23S 프로브 (0.75 μg 각), 모기 18S와 28S 프로브 (0.75 μg 각) 1 개 μg 총 RNA를 섞어, 1 μl RNase 억제제, 2.5 μl 20X SSC 버퍼 200 μl PCR 튜브에 10 μl 100 % 포름 아미드 50 μl에 추가 nuclease - 무료 물.
      2. 70에서 열 자전거 타는 사람 및 배양에 반응 튜브를 놓습니다 ° C 5 분 거리에 보조 구조를 열고 25 다운 방면 진입로에 대한 ° C rRNA와 arRNA 프로브의 하이브리드를 허용하도록 1 분마다 °의 C에 5 ° C 단위를 사용합니다.
   3. rRNA의 제거
      1. 1.7 ML 튜브에 300 μl streptavidin 코팅 구슬을 전송합니다. 구슬을 고정 할 수있는 자기 분리 랙에 튜브를 놓습니다. 표면에 뜨는 제거합니다. 0.1N NaOH와 미 300 μl의 구슬을 Resuspend잘 X. 자기 랙에 다시 튜브를 삽입하고 표면에 뜨는을 피펫. 잘 혼합, 1X SSC 300 μl의 구슬을 Resuspend, 구슬을 고정하고 표면에 뜨는을 피펫. 1X SSC 한 번 더 300 μl로 세탁을 반복합니다.
      2. 구슬 3 aliquots, 100 μl 각각 1.7 ML 튜브의하십시오. 자기 랙에 튜브를 삽입하고, pipetting하여 표면에 뜨는을 제거합니다. 참고 : 구슬의 aliquots는 biotinylated rRNA-arRNA의 하이브리드를 캡처하는 3 라운드에 사용됩니다.
      3. 50 μl 하이브 리다이 제이션 반응에 20 % 포름 아미드와 50 μl 1X SSC를 추가합니다. 첫 번째 구슬 나누어지는 관에 반응을 전송하고, 잘 섞는다. biotinylated 프로브-rRNA의 하이브리드는 streptavidin 구슬에 의해 캡처 할 수 있도록하기 위해 10 분 동안 RT에서 알을 품다. 관에게 부화하는 동안 혼합 할 때마다 2 분 영화.
      4. 구슬을 고정하기 위해 자기 랙에 튜브를 놓고, 두 번째 aliq로 표면에 뜨는 전송비즈 uot는 잘 혼합 위 품다. 구슬의 세 번째 관으로 표면에 뜨는을 전송하여 세 번째 캡처를 실시하고 있습니다. 믹스 앤 품다.
      5. 제조업체의 설명서에 따라 포름 아미드를 제거하는 RNeasy MinElute 키트를 사용하여 새 튜브 및 행동 정화에 비 rRNA 표면에 뜨는을 전송합니다.
      6. Bioanalyzer (그림 4)에 애질런트 RNA 6000 피코 칩 키트를 사용하여 rRNA 고갈 효율을 확인합니다.

참고 : rRNA 소모 RNA 샘플은 ⁸ 필요한 경우 증폭을 mRNA 될 수 있습니다.

결과

(2) 샘플 특정 캡처 rRNA 프로브를 생성, rRNA (3) 고갈 subtractive 하이브리드의 총 RNA의 rRNA PCR을위한 metagenomic DNA 템플릿 (1) 준비 : 프로토콜은 세 부분이 포함되어 있습니다. 고품질 metagenomic DNA와 RNA의 분리는 전체 프로세스에 필수적입니다. 수정 메타 G-노움 DNA 격리 프로토콜은 그림 2에 표시된 모기 내장에서 높은 품질의 metagenomic DNA를 산출. 그것은 모기 내장에서 높은 품질의 총 RNA를 ?...

토론

복잡한 미생물 커뮤니티는 모기 내장 생태계 ^14,16,17에 있습니다. Metatranscriptomic 시퀀싱 (RNA-seq)는 전체 미생물의 transcriptome ^{4,18을 조사하여} 상황에 따라 기능 정보를 공개 할 수 있습니다. 기술적으로는, prokaryotic mRNA의 oligo-D (T) 매개 농축 인해 안정적인 폴리 메신저의 (A) 꼬리의 부재에 적용되지 않습니다. 또한, rRNA의 고갈은 mRNA 농축에 사용되었습니다. 여기, 우리는 모기 내장 미?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent/Material
Meta-G-Nome DNA isolation kit	Epicentre	MGN0910	Metagenomic DNA isolation
TriPure	Roche	11667165001	Mdetagenomic RNA isolation
MEGAscript T7 kit	Ambion	AM1334	In vitro synthesis of RNA probes
RNaseZap	Ambion	AM9780	RNase free working area
Biotin-16-UTP	Roche	11388908910	In vitro synthesis of RNA
Biotin-11-CTP	Roche	4739205001	In vitro synthesis of RNA
Streptavidin magnetic beads	NEB	S1420S	Capture of rRNA hybrids
Magnetic separation rack	NEB	S1506S	Capture of rRNA hybrids
RNeasy mini kit	QIAGEN	74104	Purification of subtracted RNA
RNase-Free DNase Set	QIAGEN	79254	Removal DNA contamination
Agilent RNA 6000 Pico Kit	Agilent Technologies Inc.	5067-1513	Electropherogram of RNA
Equipment
Bio-Gen PRO200 Homogenizer	PRO Scientific	01-01200	Mosquito gut tissue homogenization
NanoDrop 1000 Spectrophotometer	Thermo Scientific		DNA & RNA quantitation
2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies Inc.	G2940CA	Electropherogram of RNA