A الفحص المرئي لمراقبة T6SS بوساطة المسابقة الجرثومي

Summary

نحن تصف مقايسة لمراقبة النوعية البكتيرية المنافسة بوساطة الزائفة الزنجارية إفراز VI نظام نوع (T6SS). الفحص يعتمد على بقاء / قتل الخلايا القولونية القولونية الهدف يحمل lacZ مراسل-. هذه التقنية هو قابل للتعديل لتقييم نشاط مبيد للجراثيم / الجراثيم من T6SS-يتقن الكائنات الحية الدقيقة.

Abstract

نظم إفراز نوع السادس (T6SSs) هي هذه التقنية الجزيئية تسمح الجراثيم سلبية الغرام لنقل وحقن البروتينات إلى مجموعة واسعة من ^1،2 الخلايا المستهدفة. ويتألف من المكونات الأساسية T6SS 13 و يعرض أوجه التشابه الهيكلي مع أنبوب الذيل من البكتيريا ^3. فإن الفيروس يستخدم أنبوب وجهاز ثقب لاختراق الغلاف خلية من البكتيريا المستهدفة وحقن الحمض النووي. يقترح أن T6SS هو جهاز عاثية مقلوب خلق مسار معين في المغلف الخلية البكتيرية لدفع المستجيبات والسموم إلى السطح. يمكن أن تؤخذ في عملية أخرى، ويمكن الجهاز T6SS خرم الخلايا الأخرى التي البكتيريا على اتصال، وبالتالي ضخ والمستجيبات في هذه الأهداف. يتم إجراء أنبوب الذيل وأجزاء الجهاز تعطيب من T6SS مع المندوبية والبروتينات VgrG، على التوالي ^4،5.

وقد أظهرت براعة من خلال ليالي T6SStudies باستخدام مسببات الأمراض البكتيرية المختلفة. يمكن للالكوليرا الضمة T6SS يعيد الهيكل الخلوي للخلايا حقيقية النواة المضيف عن طريق حقن و"تطورت" VgrG يحمل الأكتين C-محطة عبر ربط المجال ^6،7. وقد تم توثيق مؤخرا ضرب مثالا آخر باستخدام الزائفة الزنجارية التي هي قادرة على استهداف وقتل البكتيريا بطريقة T6SS التي تعتمد على، وتعزيز ذلك بإنشاء البكتيريا في بيئات محددة والميكروبية بيئة تنافسية ^8،9،10.

في الحالة الأخيرة، تم تحديد ثلاث T6SS-يفرز البروتينات، وهي Tse1، وTse2 Tse3 والسموم حقن البكتيريا في الهدف (الشكل 1). محمي الخلية المانحة من تأثير ضار من هذه المستجيبات عبر آلية مكافحة السم، بوساطة بروتينات المناعة Tsi1، وTsi2 Tsi3 ^8،9،10. ويمكن رصد هذا النشاط البكتيري عند T6SS-يتقن البكتيريا شارك في زراعتها على قشهيد السطوح في منافسة مع الأنواع البكتيرية الأخرى أو مع T6SS خاملا البكتيريا من نفس النوع ^{8،11،12،13.}

وأكد أن البيانات المتاحة نهج العددية للفحص الجرثومي المنافسة، بما في ذلك عد CFU تستغرق وقتا طويلا أن تعتمد إلى حد كبير على واضعي المضادات الحيوية. في حالة السلالات المقاومة للمضادات الحيوية مثل P. الزنجارية، يمكن لهذه الأساليب أن يكون غير لائق. وعلاوة على ذلك، مع تحديد مواضع مختلفة نحو 200 T6SS في أكثر من 100 الجينوم البكتيري ^14، أداة فحص ملاءمة هو مرغوب فيه للغاية. وضعنا مقايسة التي هي سهلة الاستخدام ويتطلب معيار المواد المختبرية والكواشف. الأسلوب يوفر تقنية سريعة ونوعية لمراقبة نشاط T6SS التي تعتمد على جراثيم / الجراثيم باستخدام سلالة مراسل بوصفه ضحية (في هذه الحالة كولاي DH5α) السماح لتكامل-lacZ من الجين. وعموما، هذا الأسلوب هو العنبالتحالف الدولي للموئل ويسمح التحديد السريع للT6SS الظواهر ذات الصلة على لوحات أجار. يمكن تكييفها هذا البروتوكول التجريبي لسلالات أخرى أو الأنواع البكتيرية مع مراعاة الظروف الخاصة مثل وسائط النمو، درجة الحرارة أو وقت الاتصال.

Protocol

1. سلالات بكتيرية والثقافات

1. مهندس المتلقي كولاي الخلية (بري، P) عن طريق تحويل (باستخدام معيار CaCl ₂ العلاج أو الصعق الكهربائي) ¹⁵ E. القولونية الخلايا DH5α مع البلازميد السماح للتكامل A-من الجين lacZ (الجدول 1). لوحة الخلايا على لوحات أجار تحولت لوريا Bertani-(LBA، أجار 1.5٪) تحتوي على 5-برومو-4-كلورو indolyl-β-D-galactopyranoside (X-GAL) في 40 ملغ / مل تركيز النهائي والمضادات الحيوية المناسبة. احتضان عند 37 درجة مئوية خلال الليل وصباح اليوم التالي لتحديد transformants الأزرق (انظر § 1.3).
2. تنمو الخلايا المتبرع الزنجارية الزائفة التي هي T6SS النشطة (D ⁺⁾ أو غير نشط T6SS-(D-) (الجدول 1) على LBA بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. في المثال المقدمة هنا استخدمنا P. تكنولوجيات الطاقة المتجددة الزنجارية توتر امتلاكوH1-T6SS بالموقع جوهري ^ل16 و متحولة إسوية الجينات مع حذف الكتلة الجينات H1-T6SS (الجدول 1).
3. في اليوم التالي، وإعداد ثقافة السائل في قارورة بين عشية وضحاها الغازية، فحقن استنساخ مشرق الزرقاء بين E. transformants القولونية (P) من لوحة وصفها في § 1.1، في 5 مل من مرق الصويا تريبسيني (TSB) تستكمل مع المضادات الحيوية المناسبة. تنمو تحت التحريض في 37 ° C. المضي قدما على قدم المساواة مع واحد من مستعمرة (D ⁺⁾ من و(D ^-) من لوحة وصفها في § 1.2.

2. المنافسة الفحص

1. إعداد لوحات LBA للتجربة اليوم التالي. تأكد من يتم تجفيفها بشكل صحيح هذه اللوحات (إما بالقرب من الموقد بنسن أو في مجلس الوزراء تدفق الصفحي). إعداد "الفحص المدخلات" (A-الإدخال) لوحة لسلالات (D ^+)، (D _-)، و (P ). يعد "مصلحة دمغ المصوغات والمخرجات" (A-الإخراج) لوحة لسلالات (D ^- + P) و (D ⁺ + P). تقسيم وتسمية لوحات وفقا لذلك.
2. بعد النمو بين عشية وضحاها (انظر § 1.3)، قياس الكثافة الضوئية (OD _600nm) من مدخلات ثقافة البكتيرية (D ^-، D ⁺ P و) وحساب حجم المطلوبة للحصول على ما يعادل كثافة الخلية إلى 1 وحدة OD _600Nm من كل سلالة . كل ثقافة "الإدخال" خلية (D ^-، D ⁺ P و) في البداية يتم جمع 1،5 العقيمة في أنابيب إيبندورف مل.
3. أجهزة الطرد المركزي العينات البكتيرية في 13000 دورة في الدقيقة خلال 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وتجاهل طاف.
4. إعادة تعليق الكريات من D ^-، D ^+، وP الثقافات، في 100 ميكرولتر من TSB جديدة من خلال طيف وpipetting تطعيم 10 مل من كل تقابلsponding سلالة كبقعة واحدة على لوحة "A-المدخلات" (أعد § 2.1).
5. تطعيم في "A-الإخراج" لوحة (أعد § 2.1). على نحو أدق، مزيج بلطف 30 ميكرولتر من ⁽⁺ D) مع 30 ميكرولتر (P) و 30 ميكرولتر من ^- مع 30 مل (P) في اثنين من أنابيب إيبندورف منفصلة (لاحظ أن الثقافات المستخدمة هي تلك التي وصفها في § 2.4) (D) . تطعيم 20 ميكرولتر من مزيج (D ⁺ / P) و (D ^- / P). كبقع الفردية على لوحة "A-الإخراج" السماح للبقع لتجف في مكان قريب ناسخ بنسن ووضع لوحة في حاضنة في C ° 37 لفترة مناسبة من الوقت خلالها قتل البكتيريا يحدث. في حالة P. الزنجارية، لوحظ حدوث قتل البكتيريا كفاءة الموارد البشرية بعد مرور فترة الحضانة 5 عند المقارنة بين T6SS نشطة مع سلالة معيبة T6SS.

3. مراقبة نوعية رانه قتل البكتيريا

1. إعداد لوحات LBA يحتوي على 40 ميكروغرام / مل X-غال لقراءات من الفحص. وسوف يطلق على لوحات "إدخال قراءات" أو "R-المدخلات" على الفور البكتيريا المعزولة أو "قراءات الناتج" أو "R-الإخراج" على الفور الثقافات البكتيرية المختلطة وبالتالي قراءة أداء القتل. هذه اللوحات تحتاج أيضا إلى أن تجفف بشكل صحيح. تقسيم لوحة في أربعة أجزاء متساوية على ظهرها والحواشي هذه الأجزاء 0، 10 ^-1، و10 ^-2 10 ^-3، ووصف التخفيفات للثقافة البكتيرية على الفور على لوحات أجار (انظر § 3.3). وسوف تسمح التخفيف تقييم شبه الكمي للنسبة البكتيريا الزرقاء / أبيض داخل نفس المكان.
2. جمع مع حلقة عقيمة البقع البكتيرية الفردية من لوحة "A المدخلات و" (انظر § 2.4) و "A-الإخراج" لوحة (انظر § 2.5) و resuspend كل بقعة في أنابيب إيبندورف متميزة 1،5 مل يحتوي على 1 مل من TSB. ضع في مبنى شاكر إيبندورف خلال 30 دقيقة ل resuspend بكفاءةالبكتيريا.
3. إعداد سلسلة من 5 مرات أنابيب إيبندورف 3 تحتوي على 900 ميكرولتر من TSB والمضي قدما لكل بقعة معلق على التخفيفات مسلسل 10 أضعاف ما يصل الى 10 ^-3. تأكد من تغيير ماصة نصائح ودوامة 5 ثوان بين كل خطوة التخفيف.
4. انتقل إلى اكتشاف من التخفيفات الخاص البكتيرية أعد § 3.3 على لوحات LBA جيدا المجففة يحتوي على 40 ميكروغرام / مل X-غال من خلال البدء مع المخفف أكثر إلى تعليق غير مخفف، مما يجعل هذه و"R-المدخلات" لوحات لA "في المدخلات "النقاط و" R-الإخراج "لوحات" النقاط "A-الإخراج (الشكل 2). دوامة لفترة وجيزة كل أنبوب قبل الانتقال إلى اكتشاف للحفاظ على التعليق متجانسة البكتيرية. لاستنساخ النتائج، سبوت 20 ميكرولتر من ثلاث نسخ ضمن رباعي (الشكل 2). جفاف النسبي لوحة الخاص بك هو المهم في هذه المرحلة منذ البقع تحتاج للبقاء فصل على حدة على لوحة وليس الانزلاق نحو بعضها البعض.
   تقدير كمي للمقايسة المنافسة الممكن أيضا في هذه المرحلة من التجربة. بعد الخطوة 3.3، نشر 100 ميكرولتر من 10 ^-3 التخفيف على لوحات LBA يحتوي على 40 ميكروغرام / مل X-غال. لاستنساخ النتائج، بإجراء الطلاء في ثلاث نسخ لكل بقعة من لوحة "A-الإخراج". وضع لوحات في التخفيف 37 ° C حاضنة ليلة وضحاها (الموافق الحضانة ساعة 16). انتقل إلى عد المستعمرات الزرقاء (P الخلايا التي بقيت على قيد الحياة). وتظهر النتائج التي تم الحصول عليها نموذجية بعد 5 ساعة من المنافسة في الشكل 3.
5. ترك مفتوحا لوحة (لا غطاء) داخل منطقة معقمة للسماح للامتصاص فائض السائل في داخل كل بقعة.
6. وضع لوحة في الحاضنة 37 درجة ° يلة وضحاها. وخلال هذا الوقت الحضانة، وقتل ما زالت تحدث في مزيج (D ⁺ / P) لأن كلا السلالات لا تزال على اتصال.
7. التقاط صورةأو مسح لوحات الخاص لتحليل الإخراج (الشكل 2). حيث لا تزال بقع زرقاء إلى حد كبير إلى أن E. لم القولونية قتل على يد P. الزنجارية. هذا هو الحال عندما E. يتم خلط القولونية مع P. T6SS-معيبة سلالة الزنجارية (D) (الشكل 2، لوحة في أسفل اليمين).

النتائج

وتظهر نتائج نموذجية في الشكل 1 مع سلالات والكواشف وصفها في الجدول 1. وتفحص لوحات معروضة في هذا الرقم بعد الحضانة بين عشية وضحاها. و"قراءات المدخلات" لوحات تبين وجود نمط التخفيف المتسلسل للسلالات المستخدمة في هذا الاختبار. كما هو متوقع، وE. القولونية فريسة البقع (P) overexpressing الجين الأزرق lacZ تظهر على وسائل الإعلام تستكمل مع X-غال، في حين أن الجهات المانحة P. سلالات الزنجارية (D ^+، T6SS بالموقع) و (D ^-، غير نشط T6SS) لا تزال بيضاء. و"قراءات والمخرجات" لوحات التي تم رصدها المزيج بين الفريسة وسلالة T6SS النشطة (D ⁺ / P) تظهر اختفاء الزرقاء فريسة مما يشير إلى أنه قد قتل. هذا يدل على قدرة المانحين لتكومبيتي الفريسة. استمرار اللون الأزرق على (D ^- / P) لوحة يدل على عدم قدرة متبرع T6SS غير نشط لقتل الفريسة الأزرق.

الشكل 1. قتل E. القولونية من T6SS-يتقن P. الزنجارية. P. الزنجارية يضخ السموم في E. القولونية الخلية المستهدفة بطريقة T6SS التي تعتمد على (كما هو موضح بواسطة السهم الأبيض). يتم حقن السموم اثنين Tse1 وTse3 (البرتقال والدوائر الحمراء) في E. الجبلة المحيطية القولونية وتدهور ببتيدوغليكان ^9. يتم حقن السم Tse2 (دائرة صفراء) في E. القولونية السيتوبلازم ولها نشاط جراثيم ^8،10. العمل المشترك من السموم يقتل الخلايا المستهدفة (ميض البرق والجمجمة). ويمكن الكشف عن بقاء الخلايا المستهدفة من خلال مراقبة نشاط غالاكتوزيداز β-المنتجة (انظر أيضا الشكل 2). P. لمحمي ضد النشاط eruginosa من السموم من البروتينات الحصانة Tsi1، وTsi2 Tsi3 (البرتقال والساحات الصفراء والحمراء على التوالي) ^8،9،10.

الشكل 2. أجار مقايسة لوحة لرصد T6SS التي تعتمد على قتل البكتيريا في هذا الرقم وتظهر على الجزء العلوي من "قراءات المدخلات" لوحات تتكون من التخفيفات التسلسلي للD ^-، D ^+، P المدخلات والخلايا. إدخال الخلايا P زرقاء نظرا لتكامل-α من الجين lacZ والمنتجة على هذا النحو β-غالاكتوزيداز أن يشق X-غال. في الجزء السفلي يظهر "قراءات والمخرجات" لوحات تتكون من التخفيفات المسلسل من مزيج بين البكتيريا النشطة (P ⁺ / D) ، أو غير نشطة (D ^- / P)، T6SS المانحة P. سلالة الزنجارية مع E. القولونية الفريسة. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .

الشكل 3. القياس الكمي لقتل E. القولونية بواسطة P. الزنجارية بعد مرور فترة الحضانة ساعة 5. يعرض الرسم البياني عد من CFU E. وصف القولونية في الخطوة 3.4. عرض النتائج هنا تظهر الفرق 3-أضعاف بين T6SS + وT6SS سلالات، مما يشير إلى أن معظم جرائم القتل يجري خلال 5 ساعات الأولي من الاتصال.

Discussion

الأسلوب في هذه المقالة يسمح الملاحظة البصرية للنشاط جراثيم T6SS بوساطة / الجراثيم. يتم تنفيذ الفحص على سطح لوحة أجار. ولقد ثبت في وقت سابق ان T6SS التي تعتمد على فحص أداء قتل مع مختلطة ثقافة البكتيرية السائلة ليست فعالة، من المحتمل بسبب عدم وجود اتصال مستمر بين البكتيريا السابقتين ^8. ويعتقد أن T6SS للعمل مع آلية شبيهة لتلك المستخدمة من قبل البكتيريا لحقن الحمض النووي في الخلايا المستهدفة ^17. في الثقافة السائلة، وهيكل أنبوب يشبه من T6SS قد كسر بسهولة أكبر، ويمكن أن تضيع بين البكتيرية الاتصال، لا يتم تسليم والسموم بكفاءة.

من حيث أوقات الحضانة، و5 ساعات الأولي من الاتصال التي وصفنا بين سلالة المانحة والقتيل كافية لمراقبة قتل البكتيريا P. بين الزنجارية وE. القولونية، كما هو موضح في الشكل (3) . ومع ذلك، فإنه من المستحسن لضبط الوقت عن طريق إجراء الحضانة الحركية من أجل تحسين الظروف التجريبية.

منذ هذا الأسلوب هو أسلوب يستند إلى لون ويمكن أن تتضرر النتائج التي خرج تصبغ في سلالة المانحة. على سبيل المثال، في حالة P. الزنجارية، وبعض سلالات إنتاج مستويات عالية من المواد الملونة الملونة مثل بايوسيانين وpyoverdine، والتي يمكن أن تتداخل مع قراءات الفحص، مما يجعل تمييز من الصعب نسبيا فريسة. ويمكن استخدام مولد اللون β-الأخرى غالاكتوزيداز ركائز، مثل غال غال أرجواني أو أحمر، بدلا من X-غال (الجدول 1).

يمكن للفحص المنافسة الاستفادة من الجينات الأخرى لمراسل قراءات. على سبيل المثال، كما تم فحص مماثلة أجريت باستخدام الفلورية الخضراء البروتين المسمى يفترس ^12.

مقايسة لدينا، في حين لا الكمية، ويعطي مؤشرا جيداالنشاط T6SS لأنها مبنية على بقاء أو قتل فريسة مراسل. يقدم هذه التقنية ميزة كونها سهلة ومريحة لتقييم نشاط مبيد للجراثيم / الجراثيم من T6SSs من أي نوع من الأنواع البكتيرية. وقد أبلغ حتى الآن، وقد تبين أن نشاط T6SS ضد البكتيريا سالبة الجرام وليس مثال واضح على البكتيريا إيجابية الجرام T6SS حساسة ¹² حتى الان. ومن الواضح أيضا أن عدم التوافق في الثقافة من الأنواع البكتيرية المختلفة لاختبار (مثل النمو درجة الحرارة، والأوكسجين، وسائط معين) هو أخذها بعين الاعتبار.

ويمكن أيضا أن تستخدم لدينا فحص لتقييم أي من مكونات ضرورية للغاية T6SS منذ آثار مادة سامة حتى يفرز قد تكون كافية لقتل الفريسة. يمكن أن النشاط حتى ضعف واضح T6SS ثم يمكن الكشف عنها بواسطة الفحص لدينا بالمقارنة مع مستوى إفراز الإجراء T6SS التي تعتمد على استخدام اختبار لطخة الثقافة طاف والغربيةالتحليل. ومع ذلك، لا تزال هناك حاجة لتشكيل مستعمرة السليم حدة (CFU) عد لالكمي الدقيق لهذا النشاط T6SS.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم الكاشف / المواد	شركة	كتالوج رقم	تعليقات
P. الزنجارية PAKΔ تكنولوجيات الطاقة المتجددة (D +) (T6SS بالموقع)	مختبر سلالة		وصف مرجع في 16
P. الزنجارية PAKΔ تكنولوجيات الطاقة المتجددة Δ H1-T6SS (D -) (T6SS غير نشط)	هذه الدراسة		تم حذف الكتلة H1-T6SS (تشمل الجينات PA0070 PA0095 ل) عن طريق تبادل أليلية بعد الإجراء الموضح في المرجع 18. تم إنشاء جزء mutator مع المجموعة التالية من الاشعال: الاشعال وحتى جزء: 5'-ATGGTCAACGACATGGAGCTGGAG-3 "، و 5'CGAGGCCGATCAGGCCTTCAGAACTGA-3 ". الاشعال جزء أسفل: 5'-TCAGGCCTTCAGAACTGAAGCGGCGCA-3 '، 5'-GGTGGCGTTCAACAGTTCCATGTC-3 '
القولونية DH5α	إينفيتروجن	18258-012	F-φ80 أمريكا اللاتينية والكاريبي ZΔM15 Δ (LAC-ARG ZYA F) U169 نهاية A1 A1 تفصيل HSD R17 (ص ك -، م ك +) A بو سوب E44-λ ثي -1 جير A96 الرطوبة A1
pBluescript II SK (+)	اجيلنت	212205	هذا المتجه يعبر عن الببتيد α β-غالاكتوزيداز من استخدامها لتكامل-α.
X-غال	إينفيتروجن	15520-018	استخدام في 40 ميكروغرام / مل
لوريا Bertani أجار	ميرك المواد الكيميائية	1.10283.0500
TSB (الكازين مرق فول الصويا)	OXOID	CM109
دوامة شاكر عبقرية 3	IKA	3340000
الماسح الضوئي	EPSON	V700
الطيف	WPA Biowave	CO8000 متر خلية الكثافة
أرجواني غال	Bioworld	30350001-1 (715241)
الحمراء غال	البحث العضوية	1364c
			الجدول 1. الإجهاد، البلازميد والمادية وكاشف المستخدمة.