A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
يصف هذا البروتوكول على تطوير وتوسيع والتصوير في الجسم الحي من خلايا NK المستمدة من hESCs وiPSCs.
فإننا نقدم وسيلة لاشتقاق الخلايا القاتلة الطبيعية (NK) من hESCs غير متمايزة وiPSCs باستخدام نهج خالية من وحدة التغذية. هذا الأسلوب يؤدي إلى مستويات عالية من الخلايا القاتلة الطبيعية بعد 4 أسابيع والثقافة، ويمكن أن تخضع لمزيد من التوسع 2 سجل مع الخلايا الاصطناعية تقديم المستضد. HESC والتوجيهية المشتقة من خلايا NK المتقدمة في هذا النظام يكون النمط الظاهري ناضجة وظيفة. إنتاج أعداد كبيرة من الخلايا وراثيا تعديل NK ينطبق على كل من الآلية الأساسية فضلا عن دراسات المضادة للورم. التعبير عن luciferase يراعة في الخلايا القاتلة الطبيعية المستمدة من HESC يسمح نهجا غير الغازية لمتابعة engraftment NK الخلية، والتوزيع، وظيفة. نحن أيضا وصف نظام ثنائي التصوير الذي يسمح رصد منفصلة من اثنين من السكان مختلفة من الخلايا لتوصيف بوضوح اكثر تفاعلاتها في الجسم الحي. هذا الأسلوب من الاشتقاق، والتوسع، ومزدوج في الجسم الحي التصوير يوفر نهجا يمكن الاعتماد عليها لإنتاج الخلايا القاتلة الطبيعية وتقييم واحدة منأوجه وهو أمر ضروري لتحسين العلاجات الحالية الخلية NK بالتبني.
الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) والتي يسببها الخلايا الجذعية المحفزة (iPSCs) هي غير متمايزة، والخلايا المحفزة قادرة على التجديد الذاتي غير محدود ومتعدد النسب التمايز. وقد تم التفريق hESCs بنجاح إلى مجموعات فرعية ناضجة وظيفية من كل طبقة الجرثومية، بما في ذلك خلايا الجهاز المكونة للدم 1-3. الخلايا القاتلة الطبيعية (NK) هي الخلايا الليمفاوية من نظام المناعة الفطرية التي يمكن استخلاصها من hESCs عن طريق تشكيل هيئات مضغي الشكل (EBS) 4،5 أو الثقافة المشتركة مع خطوط الخلايا اللحمية 1،2،6-8. خلايا NK يمتلك امكانات المضادة للفيروسات والمضادة للورم ولها القدرة على أن تكون فعالة ضد طائفة واسعة من الأورام الخبيثة، كما أنها لا تتطلب التحفيز مستضد قبل أداء مهامهم المستجيب. وهكذا، وخلايا NK HESC المشتقة هي مصدر جاذبية للخلايا لعلاج مناعي. بالإضافة إلى ذلك، اشتقاق خلايا NK من hESCs يوفر نظام قابلة راثيا لدراسة التطور الطبيعي في المختبر.
لأنها توفر نظام لين العريكة وراثيا، وخلايا NK HESC المشتقة يمكن تعديل تجريبيا للتعبير عن صحفيين الفلورسنت وإضاءة الحيوية تقديم النموذج الأمثل لدراسة وظائف الخلية NK المستجيب في المختبر والمجراة. الخلايا القاتلة الطبيعية المستمدة HESC تمتلك النشاط ضد مجموعة من الأهداف بما في ذلك فيروس نقص المناعة البشرية 9، وسرطان الدم (K562) وأنواع السرطان الأخرى 7،8. ومع ذلك، فإن القدرة على استخلاص ما يكفي من خلايا NK بكفاءة قادرة على علاج المرضى لا يزال يشكل عائقا هاما للترجمة السريرية و، وبدرجة أقل، وجود قيود واسعة النطاق لما قبل السريرية في الدراسات المجراة من تطوير خلايا NK وظائف مضادة للسرطان. هنا، ونحن نستخدم منهج EB تدور لاشتقاق الأسلاف المكونة للدم من hESCs 4،5،10. بعد 11 يوما يتم نقل تدور EBS لزراعة الخلايا NK مع أو بدون مغذيات لمدة 28 يوما. بعد 4 أسابيع في NK الخلية مستنبت، وخلايا NK هي ترانsferred إلى الثقافة المشتركة مع K562 الخلايا المعدلة للتعبير عن غشاء محدد انترلوكين 21 (IL-21)، والتي تكون بمثابة خلايا اصطناعية تقديم المستضد (aAPCs). التكيف بروتوكول للتوسع الخلايا القاتلة الطبيعية في الدم الطرفية باستخدام هذه ناقلات الجنود المدرعة الاصطناعي 11،12، ونحن قادرون على توسيع خلايا NK-2 سجلات مع الحفاظ على النمط الظاهري ناضجة وقدرات السامة للخلايا.
هذه العملية من تطوير وتوسيع يوفر ما يكفي من خلايا NK HESC المشتقة لواسعة في توصيف الجسم الحي. لفي الدراسات المجراة، ونحن قادرون على مراقبة غير جراحية engraftment المدى الطويل وحركية حقن luciferase يراعة التعبير (Fluc +)، وخلايا NK HESC المشتقة باستخدام التصوير تلألؤ بيولوجي. وعلاوة على ذلك، نحن قادرون على متابعة التفاعلات الخلية NK مع الخلايا السرطانية باستخدام ونظام التصوير إضاءة الحيوية أو الفلورسنت المزدوج. تستخدم دراسة سابقة من قبل مجموعتنا التصوير تلألؤ بيولوجي في نموذج المضادة للورم لمتابعة تطور الورم وCLEarance من Fluc + K562 الخلايا في الجسم الحي 7. الآن، عن طريق الهندسة hESCs لدينا للتعبير عن luciferase يراعة 13،14 يمكننا اتباع biodistribution والاتجار بها خلايا NK إلى K562 الخلايا السرطانية التي تعبر عن بروتين فلوري تتميز مؤخرا، turboFP650 15. لقد اخترنا هذا النظام مراسل المزدوج من أجل متابعة في وقت واحد السكان الخلية اثنين في الجسم الحي (الشكل 1). وكانت نماذج التصوير المزدوج معظم أنظمة ثنائي وسيفيراز، ولكن هذه النظم يمكن أن يكون تحديا تقنيا نظرا لمتطلبات التسليم من coelenterazine، الركيزة اللازمة للتعبير عن معظم Renilla وGaussia صحفيين وسيفيراز 16-18. وقد سمح للصحفيين الفلورسنت رصد سهل من العديد من خطوط الخلايا ويبني في المختبر، ولكن تمت زيارتها النجاح المحدود لفي الجسم الحي التصوير بسبب التداخل بين الأنسجة والفراء تألق ذاتي وأطياف انبعاث العديد من المشاركينتستخدم mmonly صحفيين الفلورسنت بما في ذلك GFP، DsRed، وTdTomato 15،19. وقد شجع هذا الاهتمام في تطوير البروتينات الفلورية بعيدة الحمراء، والتي تسمح للأفضل انتفاذ الأنسجة وإشارة محددة أعلى بالمقارنة مع 15،19 الخلفية. TurboFP650، وبروتين فلوري هو مبين في هذا النظام، يتم إزاحة بعيدة الحمراء ويتغلب على العديد من القضايا المطروحة مع التصوير البروتينات الفلورية في الحيوانات الحية.
وقد أتاح هذا الأسلوب لتطوير وتوسيع الخلايا القاتلة الطبيعية المستمدة من hESCs لنا لمزيد من تميز الخلايا القاتلة الطبيعية HESC المشتقة في التجارب المختبرية والحية، وهو أمر ضروري من أجل فهم أفضل وظيفة خلايا NK وهامة سريريا لتحسين العلاجات الحالية الخلية NK بالتبني. بل هو أيضا قابلة للاشتقاق والتوسع في الخلايا القاتلة الطبيعية التوجيهية المشتقة. نظام التصوير الفلورسنت وإضاءة الحيوية المزدوج ينطبق على نطاق واسع لأنظمة أخرى من طراز المضادة للورم أظهرنا هنا.
1. التكيف hESCs أو iPSCs في TrypLE للثقافات EB سبين
2. إعداد الحلول الأسهم لإقامة الثقافات EB سبين
3. جمعية BPEL وسائل الاعلام (ل~ 200 مل إجمالي الحجم)
4. إنشاء خلايا ES-TrypLE passaged في المرحلة الأولى تدور EBS
استخدام ES / IPS الخلايا التي تم تكييفها لTrypLE مرور على انخفاض الكثافة MEFs (أي ES / IPS الخلايا التي تم passaged مع TrypLE على الأقل 5-7 مرات). إذا يمكن أن تنتقل خلايا في ~ 01:03 وتصبح 70-80٪ متكدسة في 3-4 أيام، وينبغي أن الخلايا تكون جيدة للاستخدام.
5. نأينا المرحلة الأولى EBS لنظام مراقبة الأصول الميدانية تحليل
جمع EB-36 around18 تدور لتحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية. إذا تحليل الخلايا قبل يوم 6، وهناك حاجة إلى المزيد من الآبار للحصول على أرقام الخلية كافية.
6. التنمية، والتوسع، وتوصيف الخلايا القاتلة الطبيعية من الخلايا الاصلية hPSC المشتقة
لأن تدور EBS تحتوي على نسبة عالية من الخلايا الاصلية المكونة للدم، ويمكن نقلها مباشرة إلى زراعة الخلايا NK في يوم 11. لا يجوز نقل تدور EBS إلى 24 لوحات جيدة مع أو بدون مغذيات. لقد أظهرنا أي اختلاف في النمط الظاهري أو وظيفة بين الخلايا القاتلة الطبيعية المستمدة في كل حالة. ولذلك، فإننا نقل عموما على الثقافات دون مغذيات أن يكون لها نظام محدد تماما لتطوير خلايا NK. إذا باستخدام خط HESC / اللجنة التوجيهية المكونة للدم مع تمايز دون المستوى الأمثل من المستحسن استخدام طبقات المغذية 7،8.
7. في الجسم الحي التصوير ونيون إضاءة الحيوية لرصد HESC المستمدة من الخلايا القاتلة الطبيعية والخلايا السرطانية في الفئران العوز المناعي
نحن نستخدم السكري nonobese / عوز المناعة المختلطة الشديد مع خروج المغلوب غاما سلسلة (NOD / SCID / γC - / -) الفئران التي هي 6-8 أسابيع من العمر في جميع تجاربنا. نحن نستخدم نموذج التصوير المزدوج في وقت واحد لتتبع تطور الورم (turboFP650 مراسل) وHESC-NK خلايا حركية (مراسل Fluc أعرب في خلايا ES الأصل) في الجسم الحي. مخطط التصوير وينطبق هذا على نطاق واسع لأنظمة أخرى من طراز المضادة للورم هو موضح هنا. الطيف IVIS (الفرجار علوم الحياة) هو الأمثل للوقت واحد التصوير الفلورسنت وإضاءة الحيوية في الجسم الحي.
جيل من الخلايا الاصلية المكونة للدم باستخدام نهج EB تدور يسمح الأمثل تطوير خلايا NK من hESCs وiPSCs. كما هو موضح في الشكل 2، يوم 11 تدور EBS تحتوي على نسب عالية من الخلايا الاصلية التعبير عن CD34، CD45، CD43، CD31 و. مستويات عالية من CD34 CD45 ويسمح النقل المباشر لظروف NK دون الحاجة ل...
hESCs هي منصة مثالية لدراسة أنواع الخلايا المتنوعة وعقد المحتملة ملحوظا للترجمة السريرية. ونحن نستخدم، وتدور نهج EB تعريف للتمييز HESC / iPSCs إلى الخلايا الاصلية المكونة للدم. وقد أسفرت النهج EB تدور اشتقاق ثابت من الخلايا الاصلية المكونة للدم والتمايز إلى خلايا NK، ومع ذلك، ...
فإن الكتاب أود أن أشكر ميليندا Hexum إلى الشروع في تنفيذ بروتوكول EB تدور داخل مختبرنا. ونود أن نشكر أعضاء آخرين في المختبر، بما في ذلك لورا E. Bendzick، مايكل Lepley، وجينيا ني للحصول على المساعدة الفنية مع هذا العمل. فإن الكتاب أود أيضا أن أشكر براد تايلور في علوم الحياة الفرجار لله المشورة الفنية للخبراء.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments |
Materials | |||
Media | |||
BPEL media for Spin EB generation | |||
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Fisher Scientific | SH3022801 | |
F-12 Nutrient Mixture w/ Glutamax I | Invitrogen | 31765035 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3311 | Commercially available BSA can be cytotoxic to ES cells. Deionizing the solution can reduce the potential for cytotoxicity. |
Poly(vinyl alcohol) | Sigma-Aldrich | P8136 | |
Linoleic Acid | Sigma-Aldrich | L1012 | |
Linolenic Acid | Sigma-Aldrich | L2376 | |
Synthechol 500X solution | Sigma-Aldrich | S5442 | |
a-monothioglycerol (a-MTG) | Sigma-Aldrich | S5442 | |
Protein-free hybridoma mix II | Invitrogen | 12040077 | |
Ascorbic Acid 2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960 | |
Glutamax I | Invitrogen | 35050061 | |
Insulin, Transferrin, Selenium 100X solution (ITS) | Invitrogen | 41400-045 | |
Pen-Strep | Invitrogen | 15140122 | |
NK Differentiation Media | |||
Dubecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 11965-118 | |
F-12 Media | Invitrogen | CX30315 | |
15% Human AB serum | Valley Biomed | HP1022HI | |
5 ng/ml Sodium Selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | |
50 uM ethanolamine | Sigma-Aldrich | E9508 | |
20 ng/ml ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A8960 | |
25 uM 2-mercaptoethanol (BME) | Gibco | 21985 | |
2 mM L-glutamine | Gibco | CX30310 | |
1% Pen-Strep | Invitrogen | 15140122 | |
Cytokines | |||
(all cytokines used fresh from frozen aliquots) | |||
SCF | PeproTech, Inc. | 300-07 | 40 ng/ml in BPEL media; 20 ng/ml in NK medium). As noted by the Elefanty protocol, and as we discovered with a bad lot of BMP4, there can be lot differences with cytokines in regards to hematopoietic differentiation.Especially if buying cytokines in bulk, obtain a sample of the lot to test prior to purchase. Compare head-to-head with old lot. |
rhBMP-4 | R &D Systems | 314-BP | 20 ng/ml in BPEL media |
rhVEGF | R&D Systems | 293-VE | 20 ng/ml in BPEL media |
IL-2 | PeproTech, Inc. | 200-02 | 1 x 105 U/ml given to mice after NK cell injection; 50 U/ml used in NK cell expansion protocol |
IL-15 | PeproTech, Inc. | 200-15 | 10 ng/ml given to mice after NK cell injection (first 7 days only) |
IL-3 | PeproTech, Inc. | 200-03 | 5 ng/ml in NK media |
IL-7 | PeproTech, Inc. | 200-07 | 20 ng/ml in NK media |
Flt-3-Ligand | PeproTech, Inc. | 300-19 | 10 ng/ml in NK media |
In vivo Imaging | |||
D-Luciferin Sodium Salt | Gold BioTechnology | Lucna-500 | |
TurboFP650 plasmid | Evrogen, Moscow, Russia | FP731 | Subcloned into a Sleeping Beauty transposon based plasmid driven by the mCAGs promoter. Cells were then sorted on their expression of turboFP650 by FACS. Cells and plasmids can be obtained from our lab. |
Equipment | |||
IVIS Spectrum Imaging System | Caliper Life Sciences | ||
Cells | |||
Membrane bound IL-21 expressing artificial antigen presenting cells | MD Anderson, Houston, TX | contact: Dean A. Lee. http://www.jove.com/video/2540/expansion-purification-functional-assessment-human-peripheral-blood | |
Firefly luciferase expressing hESCs | University of Minnesota, Minneapolis, MN | contact: Dan S. Kaufman . H9 cells modified with a Sleeping Beauty transposon based method (references 13 and 14). Expression of firefly luciferase is driven by the mCAGGS promoter. Following the firefly luciferase gene is an IRES element at the 5' end of a GFP:zeocin fusion construct. | |
TurboFP650 expressing K562 cells | University of Minnesota, Minneapolis, MN | contact: Dan S. Kaufman. Description under plasmid comments section |
Materials Table.
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved