التنمية، والتوسع، و<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; رصد خلايا NK الإنسان من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) وافرة القوة والتي يسببها الخلايا الجذعية (iPSCs)

Summary

يصف هذا البروتوكول على تطوير وتوسيع والتصوير في الجسم الحي من خلايا NK المستمدة من hESCs وiPSCs.

Abstract

فإننا نقدم وسيلة لاشتقاق الخلايا القاتلة الطبيعية (NK) من hESCs غير متمايزة وiPSCs باستخدام نهج خالية من وحدة التغذية. هذا الأسلوب يؤدي إلى مستويات عالية من الخلايا القاتلة الطبيعية بعد 4 أسابيع والثقافة، ويمكن أن تخضع لمزيد من التوسع 2 سجل مع الخلايا الاصطناعية تقديم المستضد. HESC والتوجيهية المشتقة من خلايا NK المتقدمة في هذا النظام يكون النمط الظاهري ناضجة وظيفة. إنتاج أعداد كبيرة من الخلايا وراثيا تعديل NK ينطبق على كل من الآلية الأساسية فضلا عن دراسات المضادة للورم. التعبير عن luciferase يراعة في الخلايا القاتلة الطبيعية المستمدة من HESC يسمح نهجا غير الغازية لمتابعة engraftment NK الخلية، والتوزيع، وظيفة. نحن أيضا وصف نظام ثنائي التصوير الذي يسمح رصد منفصلة من اثنين من السكان مختلفة من الخلايا لتوصيف بوضوح اكثر تفاعلاتها في الجسم الحي. هذا الأسلوب من الاشتقاق، والتوسع، ومزدوج في الجسم الحي التصوير يوفر نهجا يمكن الاعتماد عليها لإنتاج الخلايا القاتلة الطبيعية وتقييم واحدة منأوجه وهو أمر ضروري لتحسين العلاجات الحالية الخلية NK بالتبني.

Introduction

الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) والتي يسببها الخلايا الجذعية المحفزة (iPSCs) هي غير متمايزة، والخلايا المحفزة قادرة على التجديد الذاتي غير محدود ومتعدد النسب التمايز. وقد تم التفريق hESCs بنجاح إلى مجموعات فرعية ناضجة وظيفية من كل طبقة الجرثومية، بما في ذلك خلايا الجهاز المكونة للدم ^1-3. الخلايا القاتلة الطبيعية (NK) هي الخلايا الليمفاوية من نظام المناعة الفطرية التي يمكن استخلاصها من hESCs عن طريق تشكيل هيئات مضغي الشكل (EBS) ^4،5 أو الثقافة المشتركة مع خطوط الخلايا اللحمية ^1،2،6-8. خلايا NK يمتلك امكانات المضادة للفيروسات والمضادة للورم ولها القدرة على أن تكون فعالة ضد طائفة واسعة من الأورام الخبيثة، كما أنها لا تتطلب التحفيز مستضد قبل أداء مهامهم المستجيب. وهكذا، وخلايا NK HESC المشتقة هي مصدر جاذبية للخلايا لعلاج مناعي. بالإضافة إلى ذلك، اشتقاق خلايا NK من hESCs يوفر نظام قابلة راثيا لدراسة التطور الطبيعي في المختبر.

لأنها توفر نظام لين العريكة وراثيا، وخلايا NK HESC المشتقة يمكن تعديل تجريبيا للتعبير عن صحفيين الفلورسنت وإضاءة الحيوية تقديم النموذج الأمثل لدراسة وظائف الخلية NK المستجيب في المختبر والمجراة. الخلايا القاتلة الطبيعية المستمدة HESC تمتلك النشاط ضد مجموعة من الأهداف بما في ذلك فيروس نقص المناعة البشرية ^9، وسرطان الدم (K562) وأنواع السرطان الأخرى ^7،8. ومع ذلك، فإن القدرة على استخلاص ما يكفي من خلايا NK بكفاءة قادرة على علاج المرضى لا يزال يشكل عائقا هاما للترجمة السريرية و، وبدرجة أقل، وجود قيود واسعة النطاق لما قبل السريرية في الدراسات المجراة من تطوير خلايا NK وظائف مضادة للسرطان. هنا، ونحن نستخدم منهج EB تدور لاشتقاق الأسلاف المكونة للدم من hESCs ^4،5،10. بعد 11 يوما يتم نقل تدور EBS لزراعة الخلايا NK مع أو بدون مغذيات لمدة 28 يوما. بعد 4 أسابيع في NK الخلية مستنبت، وخلايا NK هي ترانsferred إلى الثقافة المشتركة مع K562 الخلايا المعدلة للتعبير عن غشاء محدد انترلوكين 21 (IL-21)، والتي تكون بمثابة خلايا اصطناعية تقديم المستضد (aAPCs). التكيف بروتوكول للتوسع الخلايا القاتلة الطبيعية في الدم الطرفية باستخدام هذه ناقلات الجنود المدرعة الاصطناعي ^11،12، ونحن قادرون على توسيع خلايا NK-2 سجلات مع الحفاظ على النمط الظاهري ناضجة وقدرات السامة للخلايا.

هذه العملية من تطوير وتوسيع يوفر ما يكفي من خلايا NK HESC المشتقة لواسعة في توصيف الجسم الحي. لفي الدراسات المجراة، ونحن قادرون على مراقبة غير جراحية engraftment المدى الطويل وحركية حقن luciferase يراعة التعبير (Fluc ^+)، وخلايا NK HESC المشتقة باستخدام التصوير تلألؤ بيولوجي. وعلاوة على ذلك، نحن قادرون على متابعة التفاعلات الخلية NK مع الخلايا السرطانية باستخدام ونظام التصوير إضاءة الحيوية أو الفلورسنت المزدوج. تستخدم دراسة سابقة من قبل مجموعتنا التصوير تلألؤ بيولوجي في نموذج المضادة للورم لمتابعة تطور الورم وCLEarance من Fluc ⁺ K562 الخلايا في الجسم الحي ^7. الآن، عن طريق الهندسة hESCs لدينا للتعبير عن luciferase يراعة ^13،14 يمكننا اتباع biodistribution والاتجار بها خلايا NK إلى K562 الخلايا السرطانية التي تعبر عن بروتين فلوري تتميز مؤخرا، turboFP650 ^15. لقد اخترنا هذا النظام مراسل المزدوج من أجل متابعة في وقت واحد السكان الخلية اثنين في الجسم الحي (الشكل 1). وكانت نماذج التصوير المزدوج معظم أنظمة ثنائي وسيفيراز، ولكن هذه النظم يمكن أن يكون تحديا تقنيا نظرا لمتطلبات التسليم من coelenterazine، الركيزة اللازمة للتعبير عن معظم Renilla وGaussia صحفيين وسيفيراز ^16-18. وقد سمح للصحفيين الفلورسنت رصد سهل من العديد من خطوط الخلايا ويبني في المختبر، ولكن تمت زيارتها النجاح المحدود لفي الجسم الحي التصوير بسبب التداخل بين الأنسجة والفراء تألق ذاتي وأطياف انبعاث العديد من المشاركينتستخدم mmonly صحفيين الفلورسنت بما في ذلك GFP، DsRed، وTdTomato ^15،19. وقد شجع هذا الاهتمام في تطوير البروتينات الفلورية بعيدة الحمراء، والتي تسمح للأفضل انتفاذ الأنسجة وإشارة محددة أعلى بالمقارنة مع ^15،19 الخلفية. TurboFP650، وبروتين فلوري هو مبين في هذا النظام، يتم إزاحة بعيدة الحمراء ويتغلب على العديد من القضايا المطروحة مع التصوير البروتينات الفلورية في الحيوانات الحية.

وقد أتاح هذا الأسلوب لتطوير وتوسيع الخلايا القاتلة الطبيعية المستمدة من hESCs لنا لمزيد من تميز الخلايا القاتلة الطبيعية HESC المشتقة في التجارب المختبرية والحية، وهو أمر ضروري من أجل فهم أفضل وظيفة خلايا NK وهامة سريريا لتحسين العلاجات الحالية الخلية NK بالتبني. بل هو أيضا قابلة للاشتقاق والتوسع في الخلايا القاتلة الطبيعية التوجيهية المشتقة. نظام التصوير الفلورسنت وإضاءة الحيوية المزدوج ينطبق على نطاق واسع لأنظمة أخرى من طراز المضادة للورم أظهرنا هنا.

Protocol

1. التكيف hESCs أو iPSCs في TrypLE للثقافات EB سبين

1. التفكك الأولي مع TrypLE يعمل بشكل أفضل إذا كان ES / IPS المستعمرات من الثقافات كولاجيناز-passaged صغيرة نسبيا. مرت ES بدء / IPS السكان يجب أن تكون الخلايا لا تزيد عن 4-5 أيام السابقة. 4-5 أيام قبل بدء مرور TrypLE، تمر الخلايا ES في مناطق ذات كثافة من شأنها أن تسمح للخلايا أن تكون ~ 70٪ متموجة في 4 أيام مرة. استخدام وسائل الإعلام ES العادية للثقافة من الخلايا ES-TrypLE passaged. هنا، نحن نستخدم hESCs تعديل ثابت مع بناء مراسل luciferase (الجدول مواد). يعمل البروتوكول أيضا مع iPSCs، وذلك باستخدام iPSCs معدلة للمقارنة بين الخلية المكونة للدم السلف والتنمية الخلية NK.
2. قبل الشروع في مرور TrypLE أربعة أيام، تمر خلايا ES / IPS مع كولاجيناز الرابع، بعد بروتوكول مرور طبيعية. نحن عادة تمرير 1:1 في المقطع الاول مع TrypLE. توسيع خلايا ES / IPS وفقا لذلك مسبقا.
3. يوم واحد قبل بدء مرور TrypLE، لوحة MEFs في 6 لوحات جيدا في 0،9-1 × 10 ⁵ خلايا / جيد. تمرير 1:01 (أو 02:01 ليصعب التكيف مع خطوط الخلايا أو للثقافات أقل كثافة) في المقطع الاول مع TrypLE. لذلك، وإعداد 1 لوحة MEF لكل لوحة ES / IPS كنت تخطط لوضع في الثقافة TrypLE.
4. اختيار بعناية قبالة المستعمرات متباينة (تلك التي تفتقر إلى الحدود مقيدة أو لها خصائص ليفية / الظهارية) قبل الشروع في TrypLE التفكك. الخلايا المتمايزة يمكن أن يستغرق أكثر ثقافة بسهولة نسبيا مع مرور TrypLE، ولذلك فمن المهم للتأكد من سكان البداية نظيفة جدا.
5. نضح وسائل الإعلام من الآبار وإضافة 1.0 مل TrypLE قبل تحسنت حدد لكل بئر.
6. احتضان ES / IPS الخلايا في TrypLE لمدة 5 دقائق في الحاضنة 37 درجة مئوية. بعد 5 دقائق، بلطف خلايا ES ماصة قبالة الجزء السفلي من البئر.
7. جمع تعليق خلية TrypLE من الآبار ونقل إلى أنبوب مخروطي الشكل. ماصة صعودا وهبوطا جنرال الكتريكntly 2-3 مرات لتشجيع أكبر كتل أن تتفكك. تمييع TrypLE مع 1 على الأقل على قدم المساواة وسائل الإعلام ES حجم و1 يساوي حجم DPBS. لا تطفأ TrypLE من قبل وسائل الإعلام والثقافة، ولذلك فمن المهم لتخفيف TrypLE مع وسائل الإعلام وDPBS بعد إزالة الخلايا من لوحة. نحن نستخدم DPBS + وسائل الإعلام لغسيل لتوفير وسائل الإعلام ES.
8. تدور باستمرار خلايا في 1،500 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق في أجهزة الطرد المركزي المبردة (8 ° C).
9. نضح قبالة أكبر قدر من طاف وقت ممكن لإزالة TrypLE.
10. Resuspend الخلايا في وسائل الإعلام ES 4 مل بالإضافة إلى 4 مل DPBS وكرر تدور للتخلص من آثار المتبقية من TrypLE.
11. نضح قبالة طاف و resuspend في وسائل الإعلام ES حجم مناسب للتصفيح.
12. خلايا ES لوحة 1:01 (2:01 أو إذا لزم الأمر) على MEFs منخفض الكثافة في وسائل الإعلام ES.
13. بعد 24 ساعة، وإطعام الخلايا مع وسائل الاعلام ES الطازجة. من المرجح أن يكون هناك العديد من الخلايا واحد التي لم نعلق. تغذية خلايا ES اليومية مع وسائل الاعلام ES.
14. تمر مع TrypLE على الطازجة MEFs (0،9-1 × 10 ^{5 خلايا / جيد) كل 3-4 أيام (على سبيل المثال الثلاثاء والجمعة)، باستخدام نفس الإجراء الأساسي على النحو الوارد أعلاه. عادة، يجب أن لا يكون لديك لاختيار الخلايا مرت مع TrypLE.}
15. لأول عدة مقاطع (حتى مرور 5-10)، فإن الخلايا يتطلب المرور في 1:1. وهذا يجعل من الصعب التوسع في الخلايا. في تجربتنا، والطلاء كفاءة خلايا ES يسقط بشكل كبير حول الممرات 4-5 ثم يعود في غضون بضعة فقرات. بعد الممرات 5-7، قد تكون قادرا على البدء في تمرير الخلايا في 1:2، وفي نهاية المطاف، 1:03. ما بعد مرور 20، قد تحتاج لبدء تمرير الخلايا في 1:05 أو 1:06. تأكد من أن لوحة الخلايا ES في مناطق ذات كثافة عالية أول 5-10 الممرات. تحصل مرة واحدة إلى نقطة حيث لوحة الخلايا أسفل بكفاءة بما فيه الكفاية أنها يمكن أن تصل إلى 70٪ ~ التقاء في غضون يومين بعد مرور، يمكنك محاولة لبدء يمر في 1:2، وفي النهاية يجب أن تكون قادرة على تمرير في 01:03 أو 01:04. iPSCs، على وجه الخصوص، إن لم يكن passaged كثيفة بما فيه الكفاية قبل بالكاملdapted، وتميل إلى التفريق.

2. إعداد الحلول الأسهم لإقامة الثقافات EB سبين

1. 10٪ حل جيش صرب البوسنة في IMDM: إيقاف 4 غرام من BSA في 35 مل IMDM (في 50 مل المخروطية). يسمح حل للجلوس في درجة حرارة الغرفة لمدة 1-2 ساعة للسماح BSA إلى حل كامل. ضبط السعة الإجمالية إلى 40 مل مع IMDM للحصول على تركيز النهائي من 10٪. BSA المتاحة تجاريا يمكن أن تكون سامة للخلايا إلى خلايا ES. يمكن Deionizing الحل تقليل احتمالات السمية الخلوية. لdeionize، إضافة ~ 1.3 غرام الخرز الراتنج إلى 40 مل من حل جيش صرب البوسنة ويهز جيدا لخلط.
2. مكان حل BSA (مع الخرز الراتنج) في 4 درجات مئوية حتى الخرز تغيير اللون من الأزرق والأخضر إلى الأصفر (مشيرا إلى أن السعة التبادلية قد استنفدت).
3. يهز حل كل 20-30 دقيقة لتسهيل تبادل
4. كل الصرف قد يستغرق ما يصل الى 2 ساعة. عندما تبادل غير كاملة، وأجهزة الطرد المركزي الحل لمدة 2 دقيقة في 1،000 دورة في الدقيقة لحبات بيليه في الجزء السفلي من الأنبوب.
5. بذرةحل ETTE BSA إلى 50 مل الطازجة المخروطية، وترك الخرز ليتم التخلص منها.
6. كرر الخطوات من 2،2-2،5 مرتين على الأقل إضافية ليصبح المجموع ثلاثة أو أكثر من التبادلات. خلال تبادل الماضي، قدرة الخرز قد لا تكون استنفدت تماما حتى بعد اثنين الحضانة ساعة مع الخرز.
7. تصفية العقيمة الحل BSA وإزالة أي الخرز المتبقية.
8. ينبغي أن يكون الحل BSA مستقرة عند 4 درجة مئوية لمدة 2 أشهر على الأقل.
9. 5٪ محلول PVA: قياس 100 مل ميليبور H ₂ O إلى 125 زجاجة مل.
10. إضافة 5 ز PVA إلى الماء. فمن المهم لإضافة PVA إلى الماء بحيث PVA يحصل تماما "الرطب". إذا قمت بإضافة الماء إلى PVA، وسوف يستغرق وقتا طويلا جدا لPVA للذهاب الى حل.
11. سوف PVA لا تذوب على الفور. مكان PVA / الماء الحل في 4 درجات مئوية خلال الليل.
12. صباح اليوم التالي، مكان PVA / الماء حل في 37 ° C بالحمام المائي ل4-8 ساعة. PVA ينبغي أن يكون معظمها في حل بحلول نهايةالحضانة.
13. مكان زجاجة مرة أخرى في 4 درجة مئوية لمدة 24-48 ساعة على إضافية، أو حتى يذوب تماما. قد يكون الحل لزج قليلا.
14. ينبغي الحلول PVA تكون مستقرة عند 4 درجة مئوية لمدة 6 أسابيع على الأقل.
15. الأحماض اللينوليك واللينولينيك (10،000 حلول X): خفف إلى 1 ملغ / مل في الإيثانول 200 واقية. إضافة 10 مل زيت نقي إلى 10 مل ايثانول. قسامة وتخزينها في -20 درجة مئوية.
16. α-MTG محلول المخزون: تمييع 13 ميكرولتر α-MTG في 1 مل IMDM.
17. حمض الاسكوربيك الحل 2-الفوسفات (100X): إصنع 5 ملغ / مل حل. 250 ملغ حمض الاسكوربيك 2-الفوسفات في 50 مل العقيمة، الصف الأنسجة الثقافة H ₂ O. يذوب بسهولة.

3. جمعية BPEL وسائل الاعلام (ل~ 200 مل إجمالي الحجم)

1. جعل مزيج PVA-الدهون (هذه الخطوة يمنع من تشكيل قطرات غير قابلة للذوبان في المتوسطة التي من شأنها أن تحصل على تصفيته خارج PVA).
2. إضافة 20 مل IMDM و 20 مل خليط F-12 المغذيات إلى 50مل أنبوب مخروطي الشكل.
3. إضافة 10 مل من 5٪ PVA الأسهم، 0.4 مل synthechol، 20 ميكرولتر حمض اللينولينيك، وحمض اللينوليك 20 ميكرولتر ل200 مل سائل الإعلام BPEL. هز أنبوب جيدا لخلط. يوضع جانبا في حين يتم تجميع مكونات وسائل الإعلام الأخرى.
4. إضافة كافة المكونات المتبقية وسائل الإعلام إلى أعلى 250 مل وحدة الترشيح Stericup. إضافة رصيد IMDM المطلوبة وF-12 مجلدا (66 مل لكل منهما)، BSA، A-MTG، 100X ITS، Glutamax الأول، القلم / بكتيريا، خالية من بروتين ورم هجين خليط الثاني، وحمض الاسكوربيك. يضاف خليط PVA-الدهون من الخطوة 1 إلى الجزء العلوي من Stericup. تحديد المتوسط. يجب أن تكون متوسطة مستقرة عند 4 درجة مئوية لمدة 2 أسابيع على الأقل. استخدام متوسط ​​العمر للحصول على خطوات غسل.

4. إنشاء خلايا ES-TrypLE passaged في المرحلة الأولى تدور EBS

استخدام ES / IPS الخلايا التي تم تكييفها لTrypLE مرور على انخفاض الكثافة MEFs (أي ES / IPS الخلايا التي تم passaged مع TrypLE على الأقل 5-7 مرات). إذا يمكن أن تنتقل خلايا في ~ 01:03 وتصبح 70-80٪ متكدسة في 3-4 أيام، وينبغي أن الخلايا تكون جيدة للاستخدام.

1. قبل يومين من إقامة سبين تمايز EB (يوم -2): تمرير تكييفها TrypLE خلايا ES / IPS على MEFs جديدة في مناطق ذات كثافة مما يسمح لها أن تكون 70-80٪ متموجة في يوم الإعداد التمايز. نحن عادة تمر 48 ساعة قبل أن تدور الإعداد EB.
2. اليوم من إعداد EB سبين في المرحلة الأولى التمايز (يوم 0): للتحضير لسبين تصفيح EB، ماصة 150 ميكرولتر الماء المعقم في 36 بئرا الخارجي من كل لوحة 96 جيدا لتقليل التبخر. استخدام جولة القاع منخفض مرفق 96 لوحات، حسنا فقط.
3. نضح وسائل الإعلام ثقافة الخروج من الخلايا ES / IPS وإضافة 1.0 مل TrypLE قبل تحسنت اختار لكل بئر.
4. مكان لوحات في الحاضنة (37 درجة مئوية) لمدة 5 دقائق. ماصة بلطف خلايا الخروج من لوحة.
5. جمع الخلايا فصلها في أنبوب مخروطي وماصة صعودا وهبوطا لتحطيم كتل. تمييع TrypLE مع 1 تكافؤ وسائل الإعلام BPEL حجم و1 على الأقل على قدم المساواة DPBS حجم.
6. إزالة طاف و resuspendالخلايا في 5 مل سائل الإعلام BPEL بالإضافة إلى 5 مل DPBS. كرر زيادة ونقصان.
7. إزالة الخلايا وطاف resuspend في 5-10 مل سائل الإعلام BPEL، اعتمادا على عدد الخلايا المتوقعة. تمر الخلايا من خلال 70 مرشح ميكرومتر دينار بحريني (فالكون # 352350) في 50 مل الطازجة المخروطية من أجل إزالة كتل (والتي يمكن أن تتداخل مع تشكيل EB).
8. عد الخلايا التي تمت تصفيتها. قسامة الخلايا لاستخدامها في الطلاء إلى 50 مل المخروطية وزيادة ونقصان. لتصفيح: 3،000 خلايا ES / جيد، 60 بئرا / لوحة = 1.8x10 ⁵ خلايا ES / لوحة.
9. بعد الطرد المركزي، سوف تحتاج الخلايا إلى أن معلق إلى 3X10 ⁴ خلايا / مل (100 ميكرولتر حجم / جيد، 3،000 خلايا ES / جيد).
10. تحضير وحدة تخزين وسائل الإعلام BPEL + السيتوكينات كافية لإعادة التعليق على الخلايا (وهذا سوف يكون 6 مل / لوحة). للمرحلة الأولى التمايز، ونحن نستخدم SCF (40 نانوغرام / مل)، BMP4 (20 نانوغرام / مل)، وVEGF (20 نانوغرام / مل) لاشتقاق الخلايا الاصلية المكونة للدم.
11. لوحة 100 خلية ميكرولتر / جيد (= 3،000 خلايا / جيد) في كل من الداخلية 60 بئرا من preparإد لوحات 96 جيدا. هذا هو أسهل عند استخدام pipettor الأقنية وحوض العقيمة. ومن المؤكد أن مزج الخلايا من قبل pipetting قبل وضعه في الحوض الصغير والعمل بسرعة بحيث الخلايا لا تكون هناك فرصة لتسوية خارج.
12. تدور لوحات 96 بئر في أجهزة الطرد المركزي المبردة لمدة 4 دقائق في ~ 1،500 دورة في الدقيقة، 8 ° C.
13. نقل بعناية لوحات من أجهزة الطرد المركزي إلى 37 درجة مئوية الحاضنة. تجنب تعطيل لوحات قدر الإمكان. تحقق لوحات للتأكد من أن الخلايا شكلت الكريات موحدة في الجزء السفلي من الآبار.
14. المرحلة الأولى تدور EBS لا يجب أن تغذى أو خلاف ذلك بالانزعاج خلال أيام 3-4 التمايز حتى شكلت EBS طبقة الخارجي أكثر دواما. إذا كان سيتم ترك EBS في المرحلة الأولى إلى ما بعد 10-12 يوما، ونحن أحيانا إطعام EBS مع 50 ميكرولتر سائل الإعلام BPEL جديدة مع السيتوكينات إلى كل بئر (أخذ لأول مرة 50 ميكرولتر من وسائل الإعلام القديمة من كل بئر). في غضون 24 ساعة، وينبغي أن تبدأ الخلايا لتشكيل 3-D هيكل EB، وبعد يوم 3-5 ينبغي أن يكون لها طبقة خارجية متميزة، والبدء في ديفيالتخطي هياكل الكيسي.

5. نأينا المرحلة الأولى EBS لنظام مراقبة الأصول الميدانية تحليل

جمع EB-36 around18 تدور لتحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية. إذا تحليل الخلايا قبل يوم 6، وهناك حاجة إلى المزيد من الآبار للحصول على أرقام الخلية كافية.

1. إعداد حجم اللازمة من التربسين مع مصل الدجاج 2٪. المكان في 37 ° C بالحمام المائي حتى الاستخدام.
2. نقل تدور EBS وسائل الإعلام من لوحات 96-جيدا لأنابيب مخروطية 15 مل.
3. تسمح EBS لتستقر في أسفل أنابيب مخروطية. مع 5 مل ماصة، ماصة بعناية طاف ونقل إلى أنبوب منفصل (أنت يمكن أن تجمع كل من طاف في واحدة 15 مل أو 50 مل أنبوب مخروطي). كما تم بالفعل الإفراج عن بعض الخلايا المكونة للدم من EB تدور بين أيام 9 و 11، وفصل طاف تحتوي هذه الخلايا تمنع trypsinization المفرطة.
4. Resuspend EBS في التربسين + دجاج 2٪ مصل: 3-4 مل لكل أنبوب مخروطي 15 مل. وضع EBS مع التربسين في 37 ° C WATErbath لمدة 3-7 دقيقة. هزة أو دوامة بلطف كل دقيقة 1-2. في timepoints في وقت سابق (قبل يوم 8)، EBS سوف يتفكك بسهولة أكبر ويمكن أن يستغرق اقل من 3 دقائق. في timepoints في وقت لاحق (اليوم 8 +) وEBS قد يستغرق وقتا أطول للفصل. ونحن عادة لا تسمح لهم يعرض للتريبسين لأكثر من 5 دقائق عند 37 درجة مئوية. علما، هذه الأوقات هي دليل فقط. للحصول على أي خط خلية معينة أو تمايز EB، قد يستغرق أكثر أو أقل من الوقت لفصل وEBS. تراقب عن كثب التفكك. ومن المهم عدم ترك الخلايا في التربسين لفترة طويلة جدا. فمن الأفضل لوقف تفكك التربسين عندما يبقى سوى عدد قليل من كتل صغيرة مرئية بدلا من محاولة للقضاء على جميع كتل.
5. إخماد التربسين مع 1 على الأقل حجم مساو من وسائل الإعلام التي تحتوي على FBS. تدور باستمرار خلايا (1،500 دورة في الدقيقة، 5 دقائق، 8 ° C).
6. Resuspend الخلايا في حجم مناسب من وسائل الإعلام للعد (عادة 3-5 مل).
7. تصفية الخلايا من خلال مصفاة الخلية ميكرون 100. إزالة قسامة من الخلايا لفرزها. المضي قدما في الخلايالمعيار بروتوكولات FACS المختبر.

6. التنمية، والتوسع، وتوصيف الخلايا القاتلة الطبيعية من الخلايا الاصلية hPSC المشتقة

لأن تدور EBS تحتوي على نسبة عالية من الخلايا الاصلية المكونة للدم، ويمكن نقلها مباشرة إلى زراعة الخلايا NK في يوم 11. لا يجوز نقل تدور EBS إلى 24 لوحات جيدة مع أو بدون مغذيات. لقد أظهرنا أي اختلاف في النمط الظاهري أو وظيفة بين الخلايا القاتلة الطبيعية المستمدة في كل حالة. ولذلك، فإننا نقل عموما على الثقافات دون مغذيات أن يكون لها نظام محدد تماما لتطوير خلايا NK. إذا باستخدام خط HESC / اللجنة التوجيهية المكونة للدم مع تمايز دون المستوى الأمثل من المستحسن استخدام طبقات المغذية ^7،8.

1. باستخدام ماصة الأقنية لتعيين 100 ميكرولتر، ونقل 6 تدور EBS إلى كل بئر من 24 لوحة جيدا.
2. مع مغذيات: نقل تدور EBS إلى 24 لوحات جيدة تحتوي على 100،000 المشع (3،000 CGY) EL08-1D2 (أ embryoni الفئرانج خط خلية الكبد) خلايا لكل بئر. بدون مغذيات: نقل EBS مباشرة إلى غير المصقول، 24 لوحات جيدة.
3. إضافة 400 ميكرولتر سائل الإعلام التمايز NK تحتوي على السيتوكينات (IL-3، IL-15، IL-7، SCF، Flt3L، كل من Peprotech) وبالتالي فإن الحجم الإجمالي في كل بئر هو ~ 1 مل.
4. خلايا مكان في الحاضنة وإطعام كل 5-7 أيام مع وسائل الإعلام التمايز NK تحتوي على جميع السيتوكينات في الخطوة 6.3 باستثناء IL-3.
5. والخلايا القاتلة الطبيعية تعبير عن النمط الظاهري ناضجة في يوم 28 التالية نقل إلى NK خلية ثقافة التمايز (الشكل 2).
6. لاختبار السمية لخلايا NK، و4 ساعة الكروم الإفراج الفحص لا يمكن أن يؤديها ^8.
7. إذا كانت هناك حاجة أعداد كبيرة من الخلايا لفي الدراسات المجراة، أن الثقافة المشتركة مع الخلايا الاصطناعية تقديم المستضد (aAPCs) تسفر عن توسيع 2 سجل أو أكبر. لبروتوكول مفصلة، ​​زيارة http://www.jove.com/video/2540/expansion-purification-functional-assessment-human-peripheral-blood ^11،12.

7. في الجسم الحي التصوير ونيون إضاءة الحيوية لرصد HESC المستمدة من الخلايا القاتلة الطبيعية والخلايا السرطانية في الفئران العوز المناعي

نحن نستخدم السكري nonobese / عوز المناعة المختلطة الشديد مع خروج المغلوب غاما سلسلة (NOD / SCID / γC ^{- / -)} الفئران التي هي 6-8 أسابيع من العمر في جميع تجاربنا. نحن نستخدم نموذج التصوير المزدوج في وقت واحد لتتبع تطور الورم (turboFP650 مراسل) وHESC-NK خلايا حركية (مراسل Fluc أعرب في خلايا ES الأصل) في الجسم الحي. مخطط التصوير وينطبق هذا على نطاق واسع لأنظمة أخرى من طراز المضادة للورم هو موضح هنا. الطيف IVIS (الفرجار علوم الحياة) هو الأمثل للوقت واحد التصوير الفلورسنت وإضاءة الحيوية في الجسم الحي.

1. 24 ساعة قبل حقن الخلايا السرطانية، والفئران أشرق (225-250 CGY).
2. عدد Resuspend المرجوة منالخلايا السرطانية (ترد 1 × 10 ⁶ خلايا K562) في 200 ميكرولتر Iscove تعديل Dulbecco المتوسطة (IMDM) تستكمل مع FBS 20٪. يمكن أن تختلف جرعة الخلايا السرطانية اعتمادا على النموذج المستخدم. ويمكن أيضا أن يتم التعبير عن TurboFP650 في أنواع غير ورم. وأفضل تصوير مع الخلايا المترجمة إلى موقع تشريحي واحد.
3. حقن الخلايا السرطانية تحت الجلد في الصدر الأيسر العلوي من الفئران باستخدام إبرة قياس 27 أو 28 والسماح لتدبر لمدة 4 أيام. خلايا ينبغي أن تشكل فقاعة تحت الجلد من الفأرة. يمكن حلق الفئران في هذا الجزء من الجسم لتصور أفضل الحقن. وإنما يعرض أيضا منطقة للأفضل في مجال التصوير الفلورسنت الجسم الحي. تم استخدام حقن حول القفص الصدري من الفئران في هذا النموذج لأن الملكية الفكرية خلايا NK حقن هي أفضل تصور في حين أن الفأر هو مستلق. طرق بديلة للتسليم تحت الجلد، بما في ذلك الظهر أو الجناح، هي أقل إرهاقا للحيوان وينبغي النظر فيها.
4. Resuspend والعدد المرغوب فيه من HESC-درعيخلايا NK VED (ترد 10 × 10 ⁶ خلايا NK) في 300 ميكرولتر Iscove تعديل Dulbecco المتوسطة (IMDM) تستكمل مع FBS 20٪ دون المضادات الحيوية.
5. حقن المشتقة HESC الخلايا القاتلة الطبيعية في كل الغشاء البريتونى الماوس (IP) باستخدام إبرة قياس 27 أو 28. لجميع التجارب، تشمل الفئران التي لا تتلقى ضخ الخلايا السرطانية أو NK كعنصر تحكم سلبية.
6. للحفاظ على السكان الخلية NK في الجسم الحي، وإعطاء الفئران حقن 250 IP ميكرولتر من IL-2 (1X10 ⁴ U / الماوس) و IL-15 (10 نانوغرام / الماوس) في DPBS العقيمة كل يوم لمدة 7 أيام الأولى تليها IL- 2 كل 2 إلى 3 أيام فقط حتى وقت التضحية.
7. رصد engraftment من الخلايا القاتلة الطبيعية المستمدة من HESC عن طريق التصوير إضاءة الحيوية. حقن كل IP الفأر مع 120 ميكرولتر D-وسيفيرين (150 ملغ / كلغ). صورة الفئران 10 دقيقة بعد D-وسيفيرين الحقن.
8. تخدير الفئران باستخدام غرفة السماح بدخول isoflurane وداخل منطقة الجزاء في 0.8 لتر / دقيقة. تأكد من وجود أيضا تدفق الأكسجين في الغرفة.
9. وضع تخديرالفئران في IVIS الطيف والفئران آمنة على ظهورهم باستخدام الشريط أو الفيلكرو والسماح بدخول isoflurane وداخل منطقة الجزاء عند 0.5 لتر / دقيقة للحفاظ على التخدير.
10. ضبط آلة IVIS لتصحيح منصة التصوير (D لمدة 4-5 الفئران، C لمدة 3 أو أقل الفئران)، تعيين binning إلى متوسطة، و / وقف إلى 1 والحصول على صورة لمدة 1 دقيقة.
11. لأداء التصوير الفلورسنت للخلايا ⁺ turboFP650، استخدم معالج التصوير لانشاء مسح قياس الانبعاثات التحقيق من الفائدة وكذلك إشارة الخلفية. من قائمة تحقيقات اختيار إم الإدخال / EX، وأدخل في الإثارة الصحيح والانبعاثات. لturboFP650، استخدم 605 الإثارة وانبعاث 660-720 لقياس إشارة الورم و570 الإثارة وانبعاث 640-720 لقياس إشارة الخلفية. استخدام إعدادات التعرض للسيارات واختر منصة التصوير المطلوب. فإن تسلسل التصوير كامل يستغرق عادة 3-5 دقائق للحصول على.
12. تسمح الفئران ليتعافى تماما من التخدير قبل نقل من نظام التصوير. تحليل الصور باستخدام لىفينج صورة برنامج الإصدار 4.2 حزمة (الفرجار علوم الحياة).
13. تحديد إشارة إضاءة الحيوية باستخدام المنطقة ذات الاهتمام (ROI) لتعيين الجريان الإجمالي (الفوتونات / ثانية) أو متوسط ​​الاشعاع (الفوتونات / ثانية / سم ² / ريال سعودي) وتعيين كافة الصور إلى نفس النطاق (الشكل 3). هنا، يتم استخدام الصور ممثل لإظهار كل السكان الخلية في كل الماوس (الشكل 3). وقد أظهرت دراسات أخرى من مختبرنا colocalization باستخدام هذه التقنية ^20. سوف تحتاج توقيت Colocalization إلى أن يكون الأمثل استنادا إلى النموذج التجريبي المستخدمة.
14. لتحديد إشارة الفلورسنت من تسلسل المسح الانبعاثات استخدام "الطيفي Unmixing" الميزة في صورة حية. حدد الصور أن تدرج في تحليل ووضع قناع على المنطقة من الفأرة التي تحتوي على إشارة من الفائدة، في هذه الحالة، القفص الصدري العلوي. اختر autofluorescense الأنسجة والتحقيق غير معروفة لتكون غير مخلوطة. إذا أعطيت الفئران الغذائية التي تحتوي على البرسيم، ويمكن أيضا أن يكون إشارة الغذائية Unmixed من لجنة التحقيق من الفائدة وتألق ذاتي الأنسجة.
15. إذا كانت الصور الناتجة لا تظهر التوزيع حتى من تألق ذاتي الأنسجة (بما في ذلك المنطقة التي يقع فيها إشارة) القيود يمكن تعيين للحصول على توزيع متسقة والانفصال أفضل من مكونات يجري غير مخلوطة. هذا هو الوضع الطبيعي وغالبا ما يكون ضروريا للتحقيقات التي ليست في البرنامج وعند إشارة محددة منخفضة، أو على مقربة من إشارة الخلفية. تعيين عامل تصفية عالية تمر، وجدت تحت علامة التبويب التحديث، ل 640 نانومتر، والتي تتطابق مع الطرف الأدنى من منحنى الانبعاث لturboFP650. ويمكن أيضا أن يتم وضع ممر منخفض قيد التصفية، ولكن لم يكن من الضروري لتحليل التصوير هو موضح هنا.
16. تحديد إشارة الفلورسنت من الصورة غير مخلوطة باستخدام المنطقة ذات الاهتمام (ROI) لتعيين الكفاءة مشع (الفوتونات / ثانية / سم ² / SR) / μW) وتعيين كافة الصور إلى نفس النطاق (الشكل 3).
17. في نقطة الوقت المطلوب، والفئران يمكن التضحية وتحليلها لENgraftment من HESC المستمدة من الخلايا عن طريق التدفق الخلوي. لالغشاء البريتونى خلايا NK حقن نحن عادة تحليل الدم المحيطي (تنزف الوريد الوجهي) والطحال، والصفاق. يغسل البريتوني لا يمكن أن يؤديها من خلال تعريض الغشاء البريتوني فقط، وجعل شق وسطي فقط واسعة بما يكفي للسماح للزجاج باستور ماصة للوصول إلى التجويف البريتوني. باستخدام برنامج تلفزيوني العقيمة، نفذ العديد من يغسل من التجويف البريتوني مع التأكد من خلط حل شامل من خلال تناوب الماوس. جمع ما يكفي من السوائل حتى يكون لديك مرئية بيليه التالية الطرد المركزي (5-10 عادة مل من غسل).

النتائج

جيل من الخلايا الاصلية المكونة للدم باستخدام نهج EB تدور يسمح الأمثل تطوير خلايا NK من hESCs وiPSCs. كما هو موضح في الشكل 2، يوم 11 تدور EBS تحتوي على نسب عالية من الخلايا الاصلية التعبير عن CD34، CD45، CD43، CD31 و. مستويات عالية من CD34 CD45 ويسمح النقل المباشر لظروف NK دون الحاجة ل...

Discussion

hESCs هي منصة مثالية لدراسة أنواع الخلايا المتنوعة وعقد المحتملة ملحوظا للترجمة السريرية. ونحن نستخدم، وتدور نهج EB تعريف للتمييز HESC / iPSCs إلى الخلايا الاصلية المكونة للدم. وقد أسفرت النهج EB تدور اشتقاق ثابت من الخلايا الاصلية المكونة للدم والتمايز إلى خلايا NK، ومع ذلك، ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
Media
BPEL media for Spin EB generation
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)	Fisher Scientific	SH3022801
F-12 Nutrient Mixture w/ Glutamax I	Invitrogen	31765035
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A3311	Commercially available BSA can be cytotoxic to ES cells. Deionizing the solution can reduce the potential for cytotoxicity.
Poly(vinyl alcohol)	Sigma-Aldrich	P8136
Linoleic Acid	Sigma-Aldrich	L1012
Linolenic Acid	Sigma-Aldrich	L2376
Synthechol 500X solution	Sigma-Aldrich	S5442
a-monothioglycerol (a-MTG)	Sigma-Aldrich	S5442
Protein-free hybridoma mix II	Invitrogen	12040077
Ascorbic Acid 2-phosphate	Sigma-Aldrich	A8960
Glutamax I	Invitrogen	35050061
Insulin, Transferrin, Selenium 100X solution (ITS)	Invitrogen	41400-045
Pen-Strep	Invitrogen	15140122
NK Differentiation Media
Dubecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Invitrogen	11965-118
F-12 Media	Invitrogen	CX30315
15% Human AB serum	Valley Biomed	HP1022HI
5 ng/ml Sodium Selenite	Sigma-Aldrich	S5261
50 uM ethanolamine	Sigma-Aldrich	E9508
20 ng/ml ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A8960
25 uM 2-mercapt–thanol (BME)	Gibco	21985
2 mM L-glutamine	Gibco	CX30310
1% Pen-Strep	Invitrogen	15140122
Cytokines
(all cytokines used fresh from frozen aliquots)
SCF	PeproTech, Inc.	300-07	40 ng/ml in BPEL media; 20 ng/ml in NK medium). As noted by the Elefanty protocol, and as we discovered with a bad lot of BMP4, there can be lot differences with cytokines in regards to hematopoietic differentiation.Especially if buying cytokines in bulk, obtain a sample of the lot to test prior to purchase. Compare head-to-head with old lot.
rhBMP-4	R & D Systems	314-BP	20 ng/ml in BPEL media
rhVEGF	R&D Systems	293-VE	20 ng/ml in BPEL media
IL-2	PeproTech, Inc.	200-02	1 x 105 U/ml given to mice after NK cell injection; 50 U/ml used in NK cell expansion protocol
IL-15	PeproTech, Inc.	200-15	10 ng/ml given to mice after NK cell injection (first 7 days only)
IL-3	PeproTech, Inc.	200-03	5 ng/ml in NK media
IL-7	PeproTech, Inc.	200-07	20 ng/ml in NK media
Flt-3-Ligand	PeproTech, Inc.	300-19	10 ng/ml in NK media
In vivo Imaging
D-Luciferin Sodium Salt	Gold BioTechnology	Lucna-500
TurboFP650 plasmid	Evrogen, Moscow, Russia	FP731	Subcloned into a Sleeping Beauty transposon based plasmid driven by the mCAGs promoter. Cells were then sorted on their expression of turboFP650 by FACS. Cells and plasmids can be obtained from our lab.
Equipment
IVIS Spectrum Imaging System	Caliper Life Sciences
Cells
Membrane bound IL-21 expressing artificial antigen presenting cells	MD Anderson, Houston, TX		contact: Dean A. Lee. http://www.jove.com/video/2540/expansion-purification-functional-assessment-human-peripheral-blood
Firefly luciferase expressing hESCs	University of Minnesota, Minneapolis, MN		contact: Dan S. Kaufman . H9 cells modified with a Sleeping Beauty transposon based method (references 13 and 14). Expression of firefly luciferase is driven by the mCAGGS promoter. Following the firefly luciferase gene is an IRES element at the 5' end of a GFP:zeocin fusion construct.
TurboFP650 expressing K562 cells	University of Minnesota, Minneapolis, MN		contact: Dan S. Kaufman. Description under plasmid comments section
Materials Table.