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Method Article
Este protocolo describe el desarrollo, la expansión, y en la formación de imágenes in vivo de células NK derivadas de hESCs y iPSCs.
Se presenta un método para derivar las células asesinas naturales (NK) de hESCs indiferenciadas y iPSCs utilizando un enfoque de enlace de forma gratuita. Este método da lugar a altos niveles de células NK después de 4 semanas la cultura y puede someterse a una mayor expansión 2-registro con las células presentadoras de antígeno artificiales. células NK y células madre IPSC derivado desarrollados en este sistema tienen un fenotipo y función maduro. La producción de un gran número de células NK modificables genéticamente es aplicable tanto para mecanicista básica, así como los estudios antitumorales. La expresión de la luciferasa de luciérnaga en células madre derivadas de células NK permite un enfoque no invasivo para seguir el injerto de células NK, la distribución, y la función. También se describe un esquema de doble imagen que permite el monitoreo independiente de dos poblaciones celulares diferentes para caracterizar con más claridad sus interacciones in vivo. Este método de derivación, la expansión, y de doble en vivo de imágenes proporciona un enfoque fiable para la producción de células NK y su evaluaciónación que es necesaria para mejorar las terapias actuales adoptivos de células NK.
Las células madre embrionarias humanas (hESCs) y células madre pluripotentes inducidas (iPSCs), son células indiferenciadas pluripotentes capaces de auto-renovación y multi-linaje diferenciación ilimitada. hESCs se han diferenciado con éxito en subconjuntos maduras y funcionales de cada capa germinal, incluyendo las células del sistema hematopoyético 1-3. Las células asesinas naturales (NK) son los linfocitos del sistema inmune innato que se puede derivar de hESCs por la formación de cuerpos embrioides (EB) de 4,5 o co-cultivo con líneas de células del estroma 1,2,6-8. Las células NK poseen capacidades anti-virales y anti-tumoral y tienen el potencial para ser eficaz contra una amplia gama de tumores malignos, ya que no requieren la estimulación de antígenos antes de llevar a cabo sus funciones efectoras. Por lo tanto, las células NK son células madre derivada de una atractiva fuente de células para la inmunoterapia. Además, la derivación de las células NK de hESCs proporciona un sistema genéticamente susceptibles a estudiar el desarrollo normal in vitro.
Debido a que proporcionan un sistema manejable de forma genética, las células NK células madre derivado experimentalmente pueden ser modificados para expresar reporteros fluorescentes y bioluminiscentes proporcionar un modelo óptimo para estudiar las funciones efectoras de células NK in vitro e in vivo. células NK hCME-derivados poseen actividad contra una amplia gama de objetivos, incluyendo el VIH 9, leucemia (K562) y otros tipos de cáncer 7,8. Sin embargo, la capacidad de derivar eficazmente suficientes células NK capaces de tratar a los pacientes sigue siendo un obstáculo importante para la traducción clínica y es, en menor grado, una limitación para una amplia pre-clínica en los estudios in vivo de desarrollo de las células NK y las funciones anti-cáncer. Aquí, utilizamos un enfoque EB giro para obtener progenitores hematopoyéticos de hESCs 4,5,10. Después de 11 días el giro EBs se transfieren al cultivo de células NK con o sin alimentadores para 28 días. Después de 4 semanas en medio de cultivo de las células NK, las células NK son transferred de co-cultivo con células K562 modificadas para expresar unido a la membrana interleucina 21 (IL-21), que sirven como células presentadoras de antígeno artificiales (AAPCS). Adaptación de un protocolo para la expansión de las células NK de sangre periférica utilizando estos vehículos blindados artificial 11,12, somos capaces de expandir las células NK 2-logs, manteniendo un fenotipo maduro y capacidades citotóxicas.
Este proceso de desarrollo y expansión proporciona suficientes células NK células madre derivadas de una amplia caracterización in vivo. Para los estudios in vivo, que son capaces de controlar de forma no invasiva el injerto a largo plazo y la cinética de la inyección de la luciferasa de luciérnaga expresar (Fluc +), células NK células madre derivadas utilizando imágenes de bioluminiscencia. Además, somos capaces de seguir las interacciones de células NK con células tumorales utilizando un esquema de formación de imágenes de doble, bioluminiscente o fluorescente. Un estudio anterior de nuestro grupo utilizó imágenes de bioluminiscencia en un modelo anti-tumor para seguir la progresión del tumor y cleArance de células Fluc + K562 in vivo 7. Ahora, mediante la ingeniería nuestros hESCs para expresar luciferasa de luciérnaga 13,14 podemos seguir la biodistribución y el tráfico de las células NK a K562 células tumorales que expresan la proteína fluorescente recientemente caracterizado, turboFP650 15. Hemos elegido este sistema dual reportero con el fin de seguir simultáneamente las dos poblaciones de células in vivo (Figura 1). La mayoría de los modelos de doble imagen han sido los sistemas de doble luciferasa, pero estos sistemas pueden ser técnicamente difícil debido a los requisitos de entrega de coelenterazina, el sustrato necesario para la expresión de la mayoría de Renilla y Gaussia luciferase reporteros 16-18. Reporteros fluorescentes han permitido un fácil monitoreo de muchas líneas celulares y los constructos in vitro, pero ha tenido un éxito limitado para la formación de imágenes in vivo debido a la superposición entre el tejido y la autofluorescencia de piel y los espectros de emisión de muchos commonly utilizado reporteros fluorescentes como GFP, DsRed y tdTomato 15,19. Esta preocupación ha impulsado el desarrollo de las proteínas fluorescentes de rojo lejano, que permiten una mejor penetración del tejido y una mayor señal específica en comparación con el 15,19 de fondo. TurboFP650, la proteína fluorescente se muestra en este sistema, es desplazado rojo lejano y supera muchos de los problemas involucrados con las proteínas fluorescentes de imágenes de los animales que viven.
Este método para el desarrollo y expansión de células NK derivadas de hESCs nos ha permitido caracterizar además células NK células madre derivado de in vitro e in vivo, lo que es necesario para comprender mejor la función de células NK y clínicamente importante para mejorar las terapias actuales adoptivos de células NK. También es susceptible a la derivación y la expansión de las células NK derivadas de IPSC. El esquema imágenes fluorescentes y bioluminiscentes dual es ampliamente aplicable a sistemas distintos del modelo antitumoral hemos demostrado aquí.
1. Adaptación hESCs o iPSCs en TrypLE para Spin Culturas EB
2. Preparar soluciones patrón que para la configuración de las Culturas EB Giro
3. Asamblea de BPEL Prensa (para ~ 200 ml de volumen total)
4. La creación de células madre embrionarias TrypLE-passaged en estadio I girar EBS
Usar células madre embrionarias / iPS que se han adaptado a TrypLE pasaje sobre (es decir, las células ES / iPS que se ha cultivado con TrypLE al menos 5-7 veces) de baja densidad MEFs. Si las células se pueden pasar en ~ 01:03 y se convierten en 70-80% de confluencia en 3-4 días, Las células deben ser buenas para su uso.
5. Disociar la Etapa I OC para Análisis FACS
Recoger EB around18-36 giro para el análisis FACS. Si el análisis de las células antes del día 6, se necesitan más pozos para obtener el número de células suficientes.
6. Desarrollo, la expansión y caracterización de células NK de células progenitoras derivadas de HPSC
Debido a que el giro EBs contiene un alto porcentaje de células progenitoras hematopoyéticas, que pueden ser transferidos directamente al cultivo de células NK en el día 11. El giro EBs puede ser transferida a placas de 24 pocillos con o sin alimentadores. Hemos demostrado ninguna diferencia en el fenotipo o función entre las células NK derivadas en cada condición. Por lo tanto, por lo general, transferir a cultivos sin alimentadores de tener un sistema completamente definido para el desarrollo de las células NK. Si se utiliza una línea de células madre / IPSC con la diferenciación hematopoyética subóptima se recomienda el uso de capas de alimentación 7,8.
7. En la imagen fluorescente y bioluminiscente vivo a Monitor células madre derivadas de células NK y células tumorales en ratones inmunodeficientes
Utilizamos obesos diabéticos / inmunodeficiencia combinada severa con nocaut de cadena gamma (NOD / SCID /? C - / -) ratones que son de 6 a 8 semanas de edad, en todos nuestros experimentos. Utilizamos un modelo dual de imágenes para seguir simultáneamente la progresión tumoral (turboFP650 reportero) y células hESC-NK cinética (periodista Fluc expresa en células madre embrionarias de padres) en vivo. Este esquema de formación de imágenes es ampliamente aplicable a los sistemas que no sean el modelo anti-tumor que se muestra aquí. El espectro IVIS (Caliper Life Sciences) es óptima para imágenes fluorescentes y bioluminiscentes in vivo simultáneamente.
La generación de células progenitoras hematopoyéticas utilizando el enfoque de EB giro permite el desarrollo de las células NK óptima de hESCs y iPSCs. Como se demuestra en la Figura 2, día 11 espín EBs contienen altos porcentajes de células progenitoras que expresan CD34, CD45, CD43, y CD31. Los altos niveles de CD34 y CD45 permite la transferencia directa a las condiciones de NK sin necesidad de clasificación o el apoyo a las células del estroma. Si no es subóptima diferenciación EB giro, ...
hESCs son una plataforma ideal para estudiar diversos tipos de células y mantener un notable potencial para la traducción clínica. Utilizamos un enfoque EB giro definido para diferenciar células madre / iPSCs de células progenitoras hematopoyéticas. El enfoque EB giro ha dado derivación consistente de células progenitoras hematopoyéticas y la diferenciación a células NK, sin embargo, todavía existe variación en la eficiencia de la diferenciación a través de líneas de células y puede necesitar ser modifi...
Los autores desean agradecer a Melinda Hexum para la iniciación del protocolo EB vuelta a nuestro laboratorio. Nos gustaría dar las gracias a otros miembros del laboratorio, incluyendo Laura E. Bendzick, Michael Lepley, y Zhenya Ni por su asistencia técnica con este trabajo. Los autores también desean agradecer a Brad Taylor en Caliper Life Sciences por su asesoramiento técnico especializado.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments |
Materials | |||
Media | |||
BPEL media for Spin EB generation | |||
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Fisher Scientific | SH3022801 | |
F-12 Nutrient Mixture w/ Glutamax I | Invitrogen | 31765035 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3311 | Commercially available BSA can be cytotoxic to ES cells. Deionizing the solution can reduce the potential for cytotoxicity. |
Poly(vinyl alcohol) | Sigma-Aldrich | P8136 | |
Linoleic Acid | Sigma-Aldrich | L1012 | |
Linolenic Acid | Sigma-Aldrich | L2376 | |
Synthechol 500X solution | Sigma-Aldrich | S5442 | |
a-monothioglycerol (a-MTG) | Sigma-Aldrich | S5442 | |
Protein-free hybridoma mix II | Invitrogen | 12040077 | |
Ascorbic Acid 2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960 | |
Glutamax I | Invitrogen | 35050061 | |
Insulin, Transferrin, Selenium 100X solution (ITS) | Invitrogen | 41400-045 | |
Pen-Strep | Invitrogen | 15140122 | |
NK Differentiation Media | |||
Dubecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 11965-118 | |
F-12 Media | Invitrogen | CX30315 | |
15% Human AB serum | Valley Biomed | HP1022HI | |
5 ng/ml Sodium Selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | |
50 uM ethanolamine | Sigma-Aldrich | E9508 | |
20 ng/ml ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A8960 | |
25 uM 2-mercaptoethanol (BME) | Gibco | 21985 | |
2 mM L-glutamine | Gibco | CX30310 | |
1% Pen-Strep | Invitrogen | 15140122 | |
Cytokines | |||
(all cytokines used fresh from frozen aliquots) | |||
SCF | PeproTech, Inc. | 300-07 | 40 ng/ml in BPEL media; 20 ng/ml in NK medium). As noted by the Elefanty protocol, and as we discovered with a bad lot of BMP4, there can be lot differences with cytokines in regards to hematopoietic differentiation.Especially if buying cytokines in bulk, obtain a sample of the lot to test prior to purchase. Compare head-to-head with old lot. |
rhBMP-4 | R &D Systems | 314-BP | 20 ng/ml in BPEL media |
rhVEGF | R&D Systems | 293-VE | 20 ng/ml in BPEL media |
IL-2 | PeproTech, Inc. | 200-02 | 1 x 105 U/ml given to mice after NK cell injection; 50 U/ml used in NK cell expansion protocol |
IL-15 | PeproTech, Inc. | 200-15 | 10 ng/ml given to mice after NK cell injection (first 7 days only) |
IL-3 | PeproTech, Inc. | 200-03 | 5 ng/ml in NK media |
IL-7 | PeproTech, Inc. | 200-07 | 20 ng/ml in NK media |
Flt-3-Ligand | PeproTech, Inc. | 300-19 | 10 ng/ml in NK media |
In vivo Imaging | |||
D-Luciferin Sodium Salt | Gold BioTechnology | Lucna-500 | |
TurboFP650 plasmid | Evrogen, Moscow, Russia | FP731 | Subcloned into a Sleeping Beauty transposon based plasmid driven by the mCAGs promoter. Cells were then sorted on their expression of turboFP650 by FACS. Cells and plasmids can be obtained from our lab. |
Equipment | |||
IVIS Spectrum Imaging System | Caliper Life Sciences | ||
Cells | |||
Membrane bound IL-21 expressing artificial antigen presenting cells | MD Anderson, Houston, TX | contact: Dean A. Lee. http://www.jove.com/video/2540/expansion-purification-functional-assessment-human-peripheral-blood | |
Firefly luciferase expressing hESCs | University of Minnesota, Minneapolis, MN | contact: Dan S. Kaufman . H9 cells modified with a Sleeping Beauty transposon based method (references 13 and 14). Expression of firefly luciferase is driven by the mCAGGS promoter. Following the firefly luciferase gene is an IRES element at the 5' end of a GFP:zeocin fusion construct. | |
TurboFP650 expressing K562 cells | University of Minnesota, Minneapolis, MN | contact: Dan S. Kaufman. Description under plasmid comments section |
Materials Table.
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