Desarrollo, la expansión y<em&gt; En vivo</em&gt; Monitoreo de las células NK humanas a partir de células madre embrionarias humanas (hESCs) y y células madre pluripotentes inducidas (iPSCs)

Resumen

Este protocolo describe el desarrollo, la expansión, y en la formación de imágenes in vivo de células NK derivadas de hESCs y iPSCs.

Resumen

Se presenta un método para derivar las células asesinas naturales (NK) de hESCs indiferenciadas y iPSCs utilizando un enfoque de enlace de forma gratuita. Este método da lugar a altos niveles de células NK después de 4 semanas la cultura y puede someterse a una mayor expansión 2-registro con las células presentadoras de antígeno artificiales. células NK y células madre IPSC derivado desarrollados en este sistema tienen un fenotipo y función maduro. La producción de un gran número de células NK modificables genéticamente es aplicable tanto para mecanicista básica, así como los estudios antitumorales. La expresión de la luciferasa de luciérnaga en células madre derivadas de células NK permite un enfoque no invasivo para seguir el injerto de células NK, la distribución, y la función. También se describe un esquema de doble imagen que permite el monitoreo independiente de dos poblaciones celulares diferentes para caracterizar con más claridad sus interacciones in vivo. Este método de derivación, la expansión, y de doble en vivo de imágenes proporciona un enfoque fiable para la producción de células NK y su evaluaciónación que es necesaria para mejorar las terapias actuales adoptivos de células NK.

Introducción

Las células madre embrionarias humanas (hESCs) y células madre pluripotentes inducidas (iPSCs), son células indiferenciadas pluripotentes capaces de auto-renovación y multi-linaje diferenciación ilimitada. hESCs se han diferenciado con éxito en subconjuntos maduras y funcionales de cada capa germinal, incluyendo las células del sistema hematopoyético ^1-3. Las células asesinas naturales (NK) son los linfocitos del sistema inmune innato que se puede derivar de hESCs por la formación de cuerpos embrioides (EB) ^{de 4,5} o co-cultivo con líneas de células del estroma ^1,2,6-8. Las células NK poseen capacidades anti-virales y anti-tumoral y tienen el potencial para ser eficaz contra una amplia gama de tumores malignos, ya que no requieren la estimulación de antígenos antes de llevar a cabo sus funciones efectoras. Por lo tanto, las células NK son células madre derivada de una atractiva fuente de células para la inmunoterapia. Además, la derivación de las células NK de hESCs proporciona un sistema genéticamente susceptibles a estudiar el desarrollo normal in vitro.

Debido a que proporcionan un sistema manejable de forma genética, las células NK células madre derivado experimentalmente pueden ser modificados para expresar reporteros fluorescentes y bioluminiscentes proporcionar un modelo óptimo para estudiar las funciones efectoras de células NK in vitro e in vivo. células NK hCME-derivados poseen actividad contra una amplia gama de objetivos, incluyendo el VIH ^9, leucemia (K562) y otros tipos de cáncer ^7,8. Sin embargo, la capacidad de derivar eficazmente suficientes células NK capaces de tratar a los pacientes sigue siendo un obstáculo importante para la traducción clínica y es, en menor grado, una limitación para una amplia pre-clínica en los estudios in vivo de desarrollo de las células NK y las funciones anti-cáncer. Aquí, utilizamos un enfoque EB giro para obtener progenitores hematopoyéticos de hESCs ^4,5,10. Después de 11 días el giro EBs se transfieren al cultivo de células NK con o sin alimentadores para 28 días. Después de 4 semanas en medio de cultivo de las células NK, las células NK son transferred de co-cultivo con células K562 modificadas para expresar unido a la membrana interleucina 21 (IL-21), que sirven como células presentadoras de antígeno artificiales (AAPCS). Adaptación de un protocolo para la expansión de las células NK de sangre periférica utilizando estos vehículos blindados artificial ^11,12, somos capaces de expandir las células NK 2-logs, manteniendo un fenotipo maduro y capacidades citotóxicas.

Este proceso de desarrollo y expansión proporciona suficientes células NK células madre derivadas de una amplia caracterización in vivo. Para los estudios in vivo, que son capaces de controlar de forma no invasiva el injerto a largo plazo y la cinética de la inyección de la luciferasa de luciérnaga expresar (Fluc ^+), células NK células madre derivadas utilizando imágenes de bioluminiscencia. Además, somos capaces de seguir las interacciones de células NK con células tumorales utilizando un esquema de formación de imágenes de doble, bioluminiscente o fluorescente. Un estudio anterior de nuestro grupo utilizó imágenes de bioluminiscencia en un modelo anti-tumor para seguir la progresión del tumor y cleArance de células Fluc ⁺ K562 in vivo ^7. Ahora, mediante la ingeniería nuestros hESCs para expresar luciferasa de luciérnaga ^13,14 podemos seguir la biodistribución y el tráfico de las células NK a K562 células tumorales que expresan la proteína fluorescente recientemente caracterizado, turboFP650 ^15. Hemos elegido este sistema dual reportero con el fin de seguir simultáneamente las dos poblaciones de células in vivo (Figura 1). La mayoría de los modelos de doble imagen han sido los sistemas de doble luciferasa, pero estos sistemas pueden ser técnicamente difícil debido a los requisitos de entrega de coelenterazina, el sustrato necesario para la expresión de la mayoría de Renilla y Gaussia luciferase reporteros ^16-18. Reporteros fluorescentes han permitido un fácil monitoreo de muchas líneas celulares y los constructos in vitro, pero ha tenido un éxito limitado para la formación de imágenes in vivo debido a la superposición entre el tejido y la autofluorescencia de piel y los espectros de emisión de muchos commonly utilizado reporteros fluorescentes como GFP, DsRed y tdTomato ^15,19. Esta preocupación ha impulsado el desarrollo de las proteínas fluorescentes de rojo lejano, que permiten una mejor penetración del tejido y una mayor señal específica en comparación con el ^15,19 de fondo. TurboFP650, la proteína fluorescente se muestra en este sistema, es desplazado rojo lejano y supera muchos de los problemas involucrados con las proteínas fluorescentes de imágenes de los animales que viven.

Este método para el desarrollo y expansión de células NK derivadas de hESCs nos ha permitido caracterizar además células NK células madre derivado de in vitro e in vivo, lo que es necesario para comprender mejor la función de células NK y clínicamente importante para mejorar las terapias actuales adoptivos de células NK. También es susceptible a la derivación y la expansión de las células NK derivadas de IPSC. El esquema imágenes fluorescentes y bioluminiscentes dual es ampliamente aplicable a sistemas distintos del modelo antitumoral hemos demostrado aquí.

Protocolo

1. Adaptación hESCs o iPSCs en TrypLE para Spin Culturas EB

1. La disociación inicial con TrypLE funciona mejor si las colonias ES / iPS procedentes de los cultivos de colagenasa-a pasadas relativamente pequeño. El ES inicio / poblaciones deben ser células iPS pasó no más de 4-5 días anterior. 4-5 días antes del inicio del paso TrypLE, pasan a las células madre embrionarias a una densidad que permita que las células sean ~ 70% de confluencia en 4 días el tiempo. Utilizar los medios ES regulares para el cultivo de células madre embrionarias TrypLE-passaged. En este caso, estamos usando hESCs estable modificados con una construcción de luciferasa (Tabla de Materiales). El protocolo también trabaja con iPSCs, utilizando iPSCs sin modificar para la comparación de células progenitoras hematopoyéticas y el desarrollo de las células NK.
2. Cuatro días antes del inicio del paso TrypLE, pasan a las células ES / iPS con colagenasa IV, siguiendo un protocolo normal de pasaje. Normalmente nos pasamos 01:01 en el primer pasaje con TrypLE. Ampliar las células ES / iPS consecuencia de antemano.
3. Un día antes del inicio del paso TrypLE, placa MEFs en placas de 6 pocillos a 0,9 a 1 x 10 ⁵ células / pocillo. Pase 1:1 (o 2:1 para difíciles de adaptar las líneas celulares o cultivos de menor densidad) en el primer pasaje con TrypLE. Por lo tanto, prepare 1 placa MEF para cada plato ES / iPS tiene previsto poner a la cultura TrypLE.
4. Elegir con cuidado las colonias diferenciadas (los que carecen de una frontera circunscrita o tienen características fibroblásticas / epitelial) antes de proceder a TrypLE disociación. Las células diferenciadas pueden hacerse cargo de la cultura con relativa facilidad con el paso TrypLE, por lo que es importante asegurarse de que la población inicial es muy limpio.
5. Aspirar los medios de los pocillos y añadir 1,0 ml TrypLE precalentado Seleccione por pocillo.
6. Incubar las células ES / iPS en TrypLE de 5 min en un 37 ° C incubadora. Después de 5 min, las células ES de pipeta suavemente fuera de la parte inferior del pozo.
7. Recoger la suspensión celular TrypLE de pozos y transferir a un tubo cónico. Pipetear hacia arriba y abajo gently 2-3 veces para alentar a los grupos más grandes se rompan. Diluir TrypLE con al menos 1 ES medios de volumen iguales y 1 DPBS igual volumen. TrypLE nunca se apaga por medio de cultivo, por lo que es importante para diluir la TrypLE con los medios y DPBS después de eliminar las células de la placa. Utilizamos DPBS + medios para el lavado para ahorrar papel ES.
8. Centrifugar las células a 1500 rpm durante 5 min en la centrífuga refrigerada (8 ° C).
9. Aspirar el apagado tanto del sobrenadante como sea posible para eliminar TrypLE.
10. Resuspender las células en los medios de comunicación 4 ml ES más DPBS 4 ml y repetir giro para deshacerse de trazas restantes de TrypLE.
11. Aspirar el sobrenadante y resuspender en medio ES volumen adecuados para la deposición.
12. Las células ES Plate 01:01 (o 02:01 si es necesario) en MEFs de baja densidad en ES medios de comunicación.
13. Después de 24 horas, alimentar a las células madre embrionarias con los medios nuevos. Lo más probable es que muchas células individuales que no se unen. Alimentar a las células ES a diario con los medios de comunicación ES.
14. Pasar con TrypLE en MEFs fresca (0,9 a 1 x 10 ^{5 células / pocillo) cada 3-4 días (por ejemplo, martes y viernes) utilizando el mismo procedimiento básico que el anterior. Normalmente, usted no debería tener que recoger las células pasan a TrypLE.}
15. Durante los primeros pasajes (hasta el pase 5-10), las células requerirán que pasa a 1:01. Esto hace difícil la expansión de las células. En nuestra experiencia, plateando la eficiencia de las células madre embrionarias se reduce drásticamente en torno pasos 4-5 y luego vuelve a subir en un par de pasajes. Después de pasajes 5-7, es posible que pueda comenzar pasando las células a 01:02, y finalmente, 01:03. Más allá del paso 20, puede que tenga que comenzar a pasar las células a 01:05 o 01:06. Asegúrese de que la placa de las células ES en una alta densidad de los primeros 5-10 pasajes. Una vez que llegue a un punto en el que la placa de celdas hacia abajo con suficiente eficacia que puedan alcanzar ~ 70% de confluencia dentro de dos días después de la aprobación, se puede tratar de comenzar a pasar a 1:2, y, finalmente, debe ser capaz de pasar a 1:3 ó 01:04. CMPI, en particular, si no se pasaron densamente suficiente antes plenamente undapted, tienden a diferenciar.

2. Preparar soluciones patrón que para la configuración de las Culturas EB Giro

1. Solución de BSA al 10% en IMDM: Suspender 4 g de BSA en 35 ml de IMDM (en una cónico de 50 ml). Deje que la solución en reposo a temperatura ambiente durante 1-2 horas para permitir la BSA se disuelva completamente. Ajuste el volumen total a 40 ml con IMDM para obtener una concentración final de 10%. BSA comercialmente disponible puede ser citotóxica para las células ES. Desionización la solución puede reducir el potencial de citotoxicidad. Para desionizar, añada ~ 1,3 g de perlas de resina de 40 ml de la solución de BSA y agitar bien para mezclar.
2. Lugar solución de BSA (con perlas de resina) a 4 ° C hasta que las perlas cambio de color de azul-verde a amarillo (lo que indica que la capacidad de intercambio se ha agotado).
3. Agite la solución cada 20 a 30 minutos para facilitar el intercambio de
4. Cada cambio puede tardar hasta 2 horas. Cuando el intercambio es completo, centrifugar la solución durante 2 minutos a 1000 rpm a perlas de pellets en la parte inferior del tubo.
5. Pepitasolución ette BSA en un fresco 50 ml cónico, dejando perlas para ser desechados.
6. Repita los pasos 2.2 hasta 2.5 por lo menos dos veces más para un total de tres o más intercambios. Durante el último cambio, la capacidad de las perlas puede no ser totalmente agotado, incluso después de dos horas de incubación con las cuentas.
7. Filtro estéril de la solución de BSA y eliminar cualquier perlas restantes.
8. La solución de BSA debe ser estable a 4 ° C durante al menos 2 meses.
9. Solución de PVA al 5%: Medir 100 ml Millipore H ₂ O en 125 ml botella de vidrio.
10. Añadir 5 g de PVA al agua. Es importante añadir el PVA al agua de modo que el PVA consigue totalmente "mojado". Si se agrega el agua al PVA, tomará mucho tiempo para que el PVA para ir a la solución.
11. PVA no se disolverá inmediatamente. Lugar solución de PVA / agua a 4 ° C durante la noche.
12. La mañana siguiente, el lugar solución de PVA / agua de 37 ° C baño de agua durante 4-8 horas. PVA debe ser en su mayoría en solución por el final dela incubación.
13. Coloque la botella de nuevo en 4 ° C durante un 24-48 h adicionales, o hasta que esté completamente disuelto. Solución podría ser ligeramente viscosa.
14. Soluciones de PVA debe ser estable a 4 ° C durante al menos 6 semanas.
15. Los ácidos linoleico y linolénico (10.000 soluciones X): Diluir a 1 mg / ml en etanol 200 grados. Añadir 10 ml de aceite puro a 10 ml de etanol. Alícuota y almacenar a -20 ° C.
16. α-MTG solución madre: Diluir 13 l α-MTG en 1 ml IMDM.
17. Acid solución de 2-fosfato ascórbico (100X): Hacer a 5 mg / ml de solución. 250 mg de ácido ascórbico 2-fosfato en 50 ml, de grado de cultivo de tejidos estéril H ₂ O. Disuelve fácilmente.

3. Asamblea de BPEL Prensa (para ~ 200 ml de volumen total)

1. Haga una mezcla de PVA-lípidos (este paso evita que el PVA se formen gotas insolubles en el medio que se filtran hacia afuera).
2. Añadir 20 ml de IMDM y 20 ml de mezcla de nutrientes F-12 a 50tubo cónico ml.
3. Añadir 10 ml de 5% stock PVA, 0,4 ml synthechol, 20 de ácido linolénico l, y 20 l de ácido linoleico por 200 ml de medios BPEL. Agite tubo bien para mezclar. Ponga a un lado, mientras que otros componentes de medios se montan.
4. Añadir todos los componentes de los medios restantes al principio de la unidad de filtración de 250 ml Stericup. Añadir el resto de IMDM requerida y F-12 volúmenes (66 ml cada uno), BSA, a-MTG, 100X ITS, ácido Pen / Strep, libre de proteínas hibridoma mezcla II y ascórbico Glutamax I,. Añadir la mezcla de PVA-lípidos de la etapa 1 a la parte superior de la Stericup. Se filtra el medio. Medio debe ser estable a 4 ° C durante al menos 2 semanas. Use el medio viejo para los pasos de lavado.

4. La creación de células madre embrionarias TrypLE-passaged en estadio I girar EBS

Usar células madre embrionarias / iPS que se han adaptado a TrypLE pasaje sobre (es decir, las células ES / iPS que se ha cultivado con TrypLE al menos 5-7 veces) de baja densidad MEFs. Si las células se pueden pasar en ~ 01:03 y se convierten en 70-80% de confluencia en 3-4 días, Las células deben ser buenas para su uso.

1. Dos días antes de establecer la diferenciación EB centrifugado (día -2): Pase adaptadas TrypLE células ES / iPS en MEFs fresco a una densidad que les permita ser un 70-80% de confluencia en el día de la instalación diferenciación. Normalmente nos pasamos 48 horas antes de girar configuración EB.
2. Día de la instalación EB vuelta en la Etapa I Diferenciación (día 0): Para preparar para el chapado EB Spin, pipeta de 150 l de agua estéril en los 36 pocillos exteriores de cada placa de 96 pocillos para minimizar la evaporación. Use sólo de fondo redondo, de fijación placas de 96 pocillos bajos.
3. Aspirar el medio de cultivo de las células ES / iPS y añadir 1,0 ml TrypLE precalentado Seleccione a cada pocillo.
4. Coloque las placas en la incubadora (37 ° C) durante 5 min. Pipetear suavemente las células fuera de la placa.
5. Recoger las células disociadas en un tubo cónico y pipetear arriba y abajo para separar las matas. Diluir con 1 TrypLE medios BPEL volúmenes iguales y por lo menos 1 DPBS igual volumen.
6. Aspirar el sobrenadante y resuspender ellas células en 5 ml de medio BPEL más 5 ml de DPBS. Repita el giro.
7. Eliminar las células sobrenadante y resuspender en 5 a 10 ml de medio BPEL, dependiendo del número de células anticipada. Pasar las células a través de filtro de 70 micras (BD Falcon # 352350) en una fresca 50 ml cónica con el fin de eliminar grumos (que puede interferir con la formación de EB).
8. Contar las células filtradas. Células alícuotas que se utilizarán para la siembra en un matraz cónico y vuelta 50. Para las planchas: 3.000 células ES / pocillo, 60 pocillos / placa = 1.8x10 ⁵ células ES / placa.
9. Después de la centrifugación, tendrán que ser resuspendieron a 3x10 ⁴ células / ml (volumen 100 l / pocillo, las células ES 3000 / pocillo) células.
10. Preparar un volumen de BPEL medios + citoquinas suficientes para resuspender las células (esto será 6 ml / placa). Para que la diferenciación etapa, utilizamos SCF (40 ng / ml), BMP4 (20 ng / ml), y VEGF (20 ng / ml) para la derivación de las células progenitoras hematopoyéticas.
11. Placa 100 células l / pocillo (= 3000 células / pocillo) en cada uno de los 60 pozos internos de la prepaed placas de 96 pocillos. Esto es más fácil cuando se utiliza una pipeta multicanal y el canal estéril. Asegúrese de mezclar las células con la pipeta antes de poner en el canal y trabajar con rapidez para que las células no tienen la oportunidad de estabilizarse.
12. Haga girar las placas de 96 pocillos en centrífuga refrigerada durante 4 min a ~ 1500 rpm, 8 ° C.
13. Transferir cuidadosamente las placas de centrífuga de 37 ° C incubadora. Evitar la interrupción de las placas tanto como sea posible. Consultar las placas para asegurarse de que las células formaron gránulos uniformes en el fondo de los pocillos.
14. Etapa I girar EBS no debe ser alimentado o perturbado otra manera a través de 3-4 días hasta que la diferenciación EBS han formado una capa externa más duradera. Si EBS se quedará en la etapa I más allá de 10 a 12 días, a veces nos alimentamos EBS con 50 medios BPEL frescas l con citoquinas a cada pocillo (primer saque 50 l de los medios tradicionales de cada pocillo). Dentro de 24 horas, las células deben comenzar a formar una estructura de EB 3-D, y por día 3-5 deben tener una capa externa distinta, y comience a desatrotando estructuras quísticas.

5. Disociar la Etapa I OC para Análisis FACS

Recoger EB around18-36 giro para el análisis FACS. Si el análisis de las células antes del día 6, se necesitan más pozos para obtener el número de células suficientes.

1. Preparar el volumen necesario de la tripsina con 2% de suero de pollo. Coloque en 37 ° C baño de agua hasta su uso.
2. Transferencia giro EBS y los medios de comunicación a partir de placas de 96 pocillos a tubos cónicos de 15 ml.
3. Permitir EBS se deposite en la parte inferior de los tubos cónicos. Con una pipeta de 5 ml pipetear con cuidado el sobrenadante y transferir a un tubo separado (se puede poner en común todo el sobrenadante en un 15 ml ó 50 ml tubo cónico). Como algunas células hematopoyéticas ya se han liberado de la EB giro entre los días 9 y 11, separando el sobrenadante que contiene estas células impide tripsinización excesiva.
4. Resuspender EBs en tripsina + 2% suero de pollo: 3-4 ml a cada tubo cónico de 15 ml. Coloque EBS con tripsina en 37 ° C waterbath durante 3-7 min. Agite o suavemente vortex cada 1-2 min. En puntos de tiempo anteriores (antes del día 8), EBS se rompen más fácilmente y puede tomar tan poco como 3 min. En los puntos de tiempo posteriores (días 8 +) los OC puede tomar más tiempo para disociar. Por lo general, no les dejamos trypsinize durante más de 5 min a 37 ° C. Tenga en cuenta que estos tiempos son sólo una guía. Para cualquier línea celular concreta o diferenciación EB, puede tardar más o menos tiempo para disociar el EBS. Seguir de cerca la disociación. Es importante no dejar las células en tripsina durante demasiado tiempo. Es mejor dejar la tripsina disociación cuando sólo unos pocos grupos pequeños permanecen visibles en lugar de tratar de eliminar todos los grumos.
5. Quench tripsina con al menos 1 volumen igual de medio que contenía FBS. Centrifugar las células (1500 rpm, 5 min, 8 ° C).
6. Resuspender las células en un volumen apropiado de los medios de comunicación para contar (por lo general 3-5 ml).
7. Células filtrar con un filtro de células de 100 micras. Eliminar una alícuota de células para el recuento. Proceda con célulascon los protocolos estándar de laboratorio de FACS.

6. Desarrollo, la expansión y caracterización de células NK de células progenitoras derivadas de HPSC

Debido a que el giro EBs contiene un alto porcentaje de células progenitoras hematopoyéticas, que pueden ser transferidos directamente al cultivo de células NK en el día 11. El giro EBs puede ser transferida a placas de 24 pocillos con o sin alimentadores. Hemos demostrado ninguna diferencia en el fenotipo o función entre las células NK derivadas en cada condición. Por lo tanto, por lo general, transferir a cultivos sin alimentadores de tener un sistema completamente definido para el desarrollo de las células NK. Si se utiliza una línea de células madre / IPSC con la diferenciación hematopoyética subóptima se recomienda el uso de capas de alimentación ^7,8.

1. Usando una pipeta multicanal ajustado a 100 l, la transferencia de espín 6 EBs a cada pocillo de una placa de 24 pocillos.
2. Con Alimentadores: transferencia de espín EBS placas de 24 pocillos que contenían 100.000 irradiado (3000 cGY) EL08-1D2 (a embryoni murinoc línea de células del hígado) las células por pocillo. Sin alimentadores: Transferencia EBS directamente sin recubrimiento, placas de 24 pocillos.
3. Añadir 400 l medio de diferenciación NK que contienen citoquinas (IL-3, IL-15, IL-7, SCF, Flt3L, todo de Peprotech) por lo que el volumen total en cada pocillo es de ~ 1 ml.
4. Células de lugar en la incubadora y alimentar cada 5-7 días con medio de diferenciación NK que contienen todas las citoquinas en el paso 6.3, excepto la IL-3.
5. Las células NK se expresar un fenotipo maduro en el día 28 después de la transferencia a la cultura diferenciación de las células NK (Figura 2).
6. Para probar la citotoxicidad de las células NK, un ensayo de liberación de cromo de 4 horas se puede realizar ^8.
7. Si se necesitan grandes cantidades de células para estudios in vivo, co-cultivo con células presentadoras de antígeno artificiales (AAPCS) puede producir una expansión de 2 log o superior. Para un protocolo detallado, visite http://www.jove.com/video/2540/expansion-purification-functional-assessment-human-peripheral-blood ^11,12.

7. En la imagen fluorescente y bioluminiscente vivo a Monitor células madre derivadas de células NK y células tumorales en ratones inmunodeficientes

Utilizamos obesos diabéticos / inmunodeficiencia combinada severa con nocaut de cadena gamma (NOD / SCID /? C ^{- / -)} ratones que son de 6 a 8 semanas de edad, en todos nuestros experimentos. Utilizamos un modelo dual de imágenes para seguir simultáneamente la progresión tumoral (turboFP650 reportero) y células hESC-NK cinética (periodista Fluc expresa en células madre embrionarias de padres) en vivo. Este esquema de formación de imágenes es ampliamente aplicable a los sistemas que no sean el modelo anti-tumor que se muestra aquí. El espectro IVIS (Caliper Life Sciences) es óptima para imágenes fluorescentes y bioluminiscentes in vivo simultáneamente.

1. 24 horas antes de la inyección de células tumorales, los ratones irradian cGY (225-250).
2. Resuspender el número deseado delas células tumorales (10 x ⁶ células K562 1 se muestran) en 200 l medio de Dulbecco modificado por Iscove (IMDM) suplementado con 20% de FBS. Dosis de células del tumor se puede variar en función del modelo utilizado. TurboFP650 también podría expresarse en los tipos no tumorales. Lo mejor es fotografiada con las células localizadas en una única localización anatómica.
3. Inyectar las células tumorales por vía subcutánea en la parte superior del tórax izquierdo de los ratones utilizando una aguja de calibre 27 o 28 y permitir a injertar durante 4 días. Las células deben formar una burbuja debajo de la piel del ratón. Los ratones pueden ser afeitado en esta parte del cuerpo para visualizar mejor la inyección. También expone el área para mejor en imagen fluorescente in vivo. Inyección alrededor del tórax de los ratones se utilizó en este modelo, ya que las células NK inyectados ip se visualizan mejor mientras que el ratón está en posición supina. Métodos alternativos para la administración subcutánea, como la espalda o flanco, es menos estresante para el animal y debe ser considerado.
4. Resuspender el número deseado de células madre deri-células NK ved (10 ⁶ células NK 10 x se muestran) en 300 l medio de Dulbecco modificado por Iscove (IMDM) suplementado con 20% de FBS sin antibióticos.
5. Inyectar células madre derivadas de las células NK en cada ratón por vía intraperitoneal (IP) usando una aguja de calibre 27 o 28. Para todos los experimentos, incluir los ratones que no recibieron infusión de células tumorales o NK como un control negativo.
6. Para sostener las poblaciones de células NK in vivo, ratones dar una inyección IP 250 l de IL-2 (1x10 ⁴ U / ratón) e IL-15 (10 ng / ratón) en DPBS estériles cada día durante los primeros 7 días, seguido por la IL- 2 sólo cada 2 ó 3 días, hasta el momento del sacrificio.
7. Monitorear el injerto de células madre derivadas de células NK por bioluminiscente de imágenes. Inyectar cada IP ratón con 120 l de D-luciferina (150 mg / kg). Imagen del ratón 10 min después de la inyección D-luciferina.
8. Anestesie ratones usando una cámara que permite la entrada en el cuadro de isoflurano en 0,8 l / min. Asegúrese de que hay también el flujo de oxígeno en la cámara.
9. Coloque anestesiadoratones en IVIS Spectrum y ratones seguras en la espalda con cinta adhesiva o velcro y permitir la entrada de isoflurano en el cuadro a 0,5 l / min para mantener la anestesia.
10. Conjunto máquina IVIS para corregir plataforma de imágenes (D para 4-5 ratones, C durante 3 o menos los ratones), establece binning a medio, f / parada a 1 y la imagen de adquirir durante 1 min.
11. Para realizar la proyección de imagen fluorescente de células turboFP650 ^+, utilice el asistente de imágenes para crear una exploración de emisión de medición de la sonda de interés, así como la señal de fondo. En la lista de sondas elegir Em entrada / Ex, y entran en la excitación y emisión correcta. Para turboFP650, utilice 605 de excitación y emisión de 660 a 720 para medir la señal de tumor y 570 de excitación y emisión de 640 a 720 para medir la señal de fondo. Utilice los ajustes de exposición automática y seleccionar la plataforma de imagen deseada. La secuencia completa de imágenes tomará generalmente 3-5 min adquirir.
12. Permitir que los ratones que se recuperan completamente de la anestesia antes de su transporte desde el sistema de imágenes. Analizar las imágenes utilizando el Living software Image versión del paquete 4.2 (Caliper Life Sciences).
13. Cuantificar la señal bioluminiscente con una región de interés (ROI) ajustado en flujo total (fotones / segundo) o luminosidad media (fotones / s / cm ² / sr) y ajustar todas las imágenes a la misma escala (Figura 3). Aquí, las imágenes representativas se utilizan para demostrar las dos poblaciones de células en cada ratón (Figura 3). Otros estudios realizados en nuestro laboratorio han demostrado colocalización con esta técnica ^20. Tendrá que ser optimizado basado en el modelo experimental utilizado temporización colocalización.
14. Para cuantificar la señal fluorescente de la secuencia de barrido de emisión de utilizar la función "desmezcla espectral" en la vida de imagen. Seleccionar las imágenes para incluir en el análisis y dibujar una máscara sobre la zona del ratón que contiene la señal de interés, en este caso, la parte superior del tórax. Seleccionar autofluorescense tejido y la sonda desconocido para ser sin mezclar. Si los ratones se les da alimento que contiene la alfalfa, la señal de los alimentos también puede ser unmixed de la sonda de interés y autofluorescencia del tejido.
15. Si las imágenes resultantes no muestran una distribución uniforme de la autofluorescencia de los tejidos (incluyendo el área donde se encuentra la señal) limitaciones se pueden ajustar para conseguir una distribución homogénea y una mejor separación de los componentes que no mezcladas. Esto es típico y, a menudo es necesario para las sondas que no están en el software, y cuando la señal específica es baja, o cerca de la señal de fondo. Configurar un filtro de paso alto, que se encuentra bajo la etiqueta de actualización, de 640 nm, que corresponde al extremo inferior de la curva de emisión para turboFP650. Una restricción del filtro de paso bajo también se puede ajustar, pero no era necesario para el análisis de imágenes que se muestra aquí.
16. Cuantificar la señal fluorescente de la imagen sin mezclar con una región de interés (ROI) ajustado a la eficiencia radiante (fotones / s / cm ² / sr) / mW) y ajustar todas las imágenes a la misma escala (Figura 3).
17. En un punto de tiempo deseado, los ratones pueden ser sacrificados y analizados para la lineagraftment de células derivadas de células madre mediante citometría de flujo. Para las células NK inyectados por vía intraperitoneal que típicamente analizamos la sangre periférica (purga vena facial), el bazo, y el peritoneo. Lavados peritoneales se pueden realizar sólo mediante la exposición de la membrana peritoneal y haciendo una incisión medial lo suficientemente ancha como para permitir una pipeta Pasteur de vidrio para acceder a la cavidad peritoneal. Uso de PBS estéril, realizar varios lavados de la cavidad peritoneal asegurándose de mezclar la solución a fondo mediante la rotación del ratón. Recoger el líquido suficiente hasta que haya una visible pellet después de la centrifugación (normalmente, un 5-10 ml de lavado).

Resultados

La generación de células progenitoras hematopoyéticas utilizando el enfoque de EB giro permite el desarrollo de las células NK óptima de hESCs y iPSCs. Como se demuestra en la Figura 2, día 11 espín EBs contienen altos porcentajes de células progenitoras que expresan CD34, CD45, CD43, y CD31. Los altos niveles de CD34 y CD45 permite la transferencia directa a las condiciones de NK sin necesidad de clasificación o el apoyo a las células del estroma. Si no es subóptima diferenciación EB giro, ...

Discusión

hESCs son una plataforma ideal para estudiar diversos tipos de células y mantener un notable potencial para la traducción clínica. Utilizamos un enfoque EB giro definido para diferenciar células madre / iPSCs de células progenitoras hematopoyéticas. El enfoque EB giro ha dado derivación consistente de células progenitoras hematopoyéticas y la diferenciación a células NK, sin embargo, todavía existe variación en la eficiencia de la diferenciación a través de líneas de células y puede necesitar ser modifi...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
Media
BPEL media for Spin EB generation
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)	Fisher Scientific	SH3022801
F-12 Nutrient Mixture w/ Glutamax I	Invitrogen	31765035
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A3311	Commercially available BSA can be cytotoxic to ES cells. Deionizing the solution can reduce the potential for cytotoxicity.
Poly(vinyl alcohol)	Sigma-Aldrich	P8136
Linoleic Acid	Sigma-Aldrich	L1012
Linolenic Acid	Sigma-Aldrich	L2376
Synthechol 500X solution	Sigma-Aldrich	S5442
a-monothioglycerol (a-MTG)	Sigma-Aldrich	S5442
Protein-free hybridoma mix II	Invitrogen	12040077
Ascorbic Acid 2-phosphate	Sigma-Aldrich	A8960
Glutamax I	Invitrogen	35050061
Insulin, Transferrin, Selenium 100X solution (ITS)	Invitrogen	41400-045
Pen-Strep	Invitrogen	15140122
NK Differentiation Media
Dubecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Invitrogen	11965-118
F-12 Media	Invitrogen	CX30315
15% Human AB serum	Valley Biomed	HP1022HI
5 ng/ml Sodium Selenite	Sigma-Aldrich	S5261
50 uM ethanolamine	Sigma-Aldrich	E9508
20 ng/ml ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A8960
25 uM 2-mercapt–thanol (BME)	Gibco	21985
2 mM L-glutamine	Gibco	CX30310
1% Pen-Strep	Invitrogen	15140122
Cytokines
(all cytokines used fresh from frozen aliquots)
SCF	PeproTech, Inc.	300-07	40 ng/ml in BPEL media; 20 ng/ml in NK medium). As noted by the Elefanty protocol, and as we discovered with a bad lot of BMP4, there can be lot differences with cytokines in regards to hematopoietic differentiation.Especially if buying cytokines in bulk, obtain a sample of the lot to test prior to purchase. Compare head-to-head with old lot.
rhBMP-4	R & D Systems	314-BP	20 ng/ml in BPEL media
rhVEGF	R&D Systems	293-VE	20 ng/ml in BPEL media
IL-2	PeproTech, Inc.	200-02	1 x 105 U/ml given to mice after NK cell injection; 50 U/ml used in NK cell expansion protocol
IL-15	PeproTech, Inc.	200-15	10 ng/ml given to mice after NK cell injection (first 7 days only)
IL-3	PeproTech, Inc.	200-03	5 ng/ml in NK media
IL-7	PeproTech, Inc.	200-07	20 ng/ml in NK media
Flt-3-Ligand	PeproTech, Inc.	300-19	10 ng/ml in NK media
In vivo Imaging
D-Luciferin Sodium Salt	Gold BioTechnology	Lucna-500
TurboFP650 plasmid	Evrogen, Moscow, Russia	FP731	Subcloned into a Sleeping Beauty transposon based plasmid driven by the mCAGs promoter. Cells were then sorted on their expression of turboFP650 by FACS. Cells and plasmids can be obtained from our lab.
Equipment
IVIS Spectrum Imaging System	Caliper Life Sciences
Cells
Membrane bound IL-21 expressing artificial antigen presenting cells	MD Anderson, Houston, TX		contact: Dean A. Lee. http://www.jove.com/video/2540/expansion-purification-functional-assessment-human-peripheral-blood
Firefly luciferase expressing hESCs	University of Minnesota, Minneapolis, MN		contact: Dan S. Kaufman . H9 cells modified with a Sleeping Beauty transposon based method (references 13 and 14). Expression of firefly luciferase is driven by the mCAGGS promoter. Following the firefly luciferase gene is an IRES element at the 5' end of a GFP:zeocin fusion construct.
TurboFP650 expressing K562 cells	University of Minnesota, Minneapolis, MN		contact: Dan S. Kaufman. Description under plasmid comments section
Materials Table.