פיתוח, הרחבה, ו<em&gt; בvivo</emתאי גזע pluripotent&gt; ניטור של תאי NK אדם מתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) ומושרה (iPSCs)

Summary

פרוטוקול זה מתאר את הפיתוח, הרחבה, ובתחום ההדמיה vivo של תאי NK הנגזרים מhESCs וiPSCs.

Abstract

אנו מציגים שיטה להפקה טבעי (נ"ח) רוצח תאים מhESCs מובחן וiPSCs באמצעות גישה חופשית מזין. שיטה זו מביאה לרמות גבוהות של תאי NK לאחר שבועות תרבות 4 ויכולה לעבור התרחבות של 2 יומן נוסף עם תאי מציגי אנטיגן מלאכותיים. hESC וiPSC נגזר תאי NK התפתחו במערכת זו יש לי הפנוטיפ ותפקוד בוגר. הייצור של כמויות גדולות של תאי NK גנטי לשינוי הוא ישים עבור שניהם מכניסטית בסיסית, כמו גם מחקרים אנטי סרטניים. ביטוי של לוציפראז הגחלילית בhESC שמקורם בתאי NK מאפשר גישה לא פולשנית לעקוב engraftment NK תא, הפצה, ותפקוד. אנו גם מתארים הדמיה כפולה ערכה המאפשרת ניטור נפרד משתי אוכלוסיות תאים שונות כדי לאפיין את יחסי הגומלין שלהם יותר במובהק in vivo. שיטה זו של גזירה, הרחבה, וכפול in vivo ההדמיה מספקת גישה אמינה לייצור תאי NK וevaluation אשר הכרחי כדי לשפר את הטיפולים בתאי NK מאמצים הנוכחיים.

Introduction

תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) ותאי גזע pluripotent מושרה (iPSCs) הם תאים בלתי מפותחים, pluripotent מסוגלים בידול התחדשות עצמית ורבת שושלת בלתי מוגבל. hESCs כבר הבדיל בהצלחה לקבוצות משנה בוגרת ותפקודיות של כל שכבת נבט, כוללים תאים של מערכת hematopoietic ^1-3. טבעיים (נ"ח) רוצח תאים לימפוציטים של מערכת החיסון המולדת שניתן להפיק מhESCs על ידי היווצרות של גופי embryoid (EBS) ^4,5 או תרבות משותפת עם שורות תאי סטרומה ^1,2,6-8. תאי NK יש יכולות אנטי ויראלית ואנטי סרטנית ויש לו את הפוטנציאל להיות יעיל נגד טווח רחב של גידולים ממאירים, כפי שהם אינם דורשים גירוי אנטיגן לפני לבצע פעולות מפעיל שלהם. לכן, תאי NK hESC הנגזרות הם מקור אטרקטיבי של תאים לטיפול חיסוני. בנוסף, הנטילה של תאי NK מhESCs מספקת מערכת גנטית נוחה ללמוד התפתחות נורמלית במבחנה.

משום שהם מספקים מערכת גנטית צייתנית, תאי NK hESC הנגזרות יכולים להיות שונה באופן ניסיוני להביע כתבי ניאון וbioluminescent מתן מודל אופטימלי ללמוד פונקציות מפעיל NK תאים במבחנה ובחי. תאי NK hESC הנגזרות בעלי פעילות נגד מגוון רחב של יעדים, כולל ⁹ HIV, לוקמיה (K562) וסוגי סרטן אחרים ^7,8. עם זאת, היכולת להפיק יעילות מספיק תאי NK המסוגלים חולי טיפול נשאר מכשול חשוב לתרגום קליני, והוא, במידה פחותה, להגבלה נרחבת טרום קלינית במחקרי vivo של התפתחות תא NK ופונקציות אנטי סרטניים. כאן, אנו משתמשים בגישת EB ספין לגזור אבות hematopoietic מhESCs ^4,5,10. לאחר 11 ימי הספין EBS מועבר לתרבית תאי NK עם או בלי מתקני האכלה במשך 28 ימים. לאחר 4 שבועות במדיום תרבות תא NK, תאי NK הם טראןsferred לתרבות משותפת עם K562 תאים מהונדסים להביע אינטרלוקין קרום הנכנס 21 (IL-21), המשמש כתאי מציגי אנטיגן מלאכותיים (aAPCs). התאמת פרוטוקול להתרחבות של תאי NK דם היקפיים באמצעות אלה נגמ"שים מלאכותיים ^11,12, אנו מסוגלים להרחיב את תאי NK-2 יומנים תוך שמירה על הפנוטיפ בוגר ויכולות ציטוטוקסיות.

תהליך זה של פיתוח והרחבה מספק תאי NK hESC הנגזרות מספיקים לרב באפיון vivo. במחקרי vivo, אנו מסוגלים לפקח engraftment וקינטיקה לטווח ארוכים של לוציפראז הגחלילית המוזרק הלא פולשני להביע (fluc ^+), תאי NK hESC שמקורם בשימוש בהדמית פליטת אור. יתר על כן, אנו מסוגלים לעקוב אחר אינטראקציות תא NK עם תאים סרטניים באמצעות ערכה כפולה, bioluminescent או ניאון הדמיה. מחקר קודם לכן על ידי הקבוצה שלנו בשימוש בהדמית פליטת אור מודל אנטי גידול לעקוב אחרי התקדמות גידול וCLEarance של K562 ⁺ תאי fluc in vivo ^7. עכשיו, באמצעות הנדסת hESCs לבטא גחלילית לוציפראז ^13,14 אנחנו יכולים לעקוב biodistribution והסחר של תאי NK לK562 תאים סרטניים המבטאים את החלבון פלואורסצנטי מתאפיין לאחרונה, turboFP650 ^15. אנו בחרנו מערכת כתב כפול זה על מנת לעקוב בו זמנית בשתי אוכלוסיות תאי in vivo (איור 1). מודלים הדמיה כפולים ביותר היו מערכות כפולה לוציפראז, אבל המערכות האלה יכולות להיות מאתגרות מבחינה טכנית בשל דרישות האספקה ​​של coelenterazine, המצע נדרש לביטוי של רוב Renilla וכתבי לוציפראז Gaussia ^16-18. כתבי ניאון אפשרו ניטור קל של שורות תאים רבות ובונה במבחנה, אך יש לו הצלחה מוגבלת בתחום ההדמיה vivo בשל החפיפה בין הרקמות וautofluorescence הפרווה וספקטרום הפליטה של שיתוף רביםמשמש mmonly כתבי ניאון כולל GFP, DsRed, וTdTomato ^15,19. עודד חשש זה הפיתוח של חלבוני ניאון מרחיק אדומים, המאפשרים לpenetrance רקמה טובה יותר, ואות ספציפית גבוהה יותר בהשוואה לרקע ^15,19. TurboFP650, חלבון פלואורסצנטי שמוצג במערכת זו, הוא מרחיקת אדומה העביר ומתגבר רבים של הבעיות מעורבות עם חלבוני ניאון הדמיה בבעלי חי חיים.

שיטה זו לפיתוח והרחבת תאי NK הנגזרים מhESCs אפשרה לנו לאפיין את תאי NK hESC הנגזרות נוסף במבחנה ובחי, אשר הכרחית כדי להבין טוב יותר את תפקוד תא NK וחשיבות קלינית כדי לשפר את הטיפולים בתאי NK מאמצים הנוכחיים. זה גם נוח לגזירה וההתרחבות של תאי NK iPSC הנגזרות. ערכת ההדמיה הניאון וbioluminescent הכפולה היא החלים רחב למערכות אחרות מאשר הדגם אנטי גידול שהראינו כאן.

Protocol

1. התאמת hESCs או iPSCs בTrypLE לתרבויות EB ספין

1. הניתוק הראשוני עם TrypLE עובד הכי טוב אם מושבות ES / IPS מתרבויות collagenase-passaged הן קטנות יחסית. ES מתחיל / אוכלוסיות iPS צריכים להיות תאים עבר לא יותר מ 4-5 ימים קודמים. 4-5 ימים לפני תחילתו של מעבר TrypLE, עוברים תאי גזע עובריים בצפיפות שתאפשר לתאים להיות מחוברות ~ 70% ב4 ימים כל פעם. להשתמש במדיה ES הרגילים לתרבות של תאי גזע עובריים TrypLE-passaged. כאן, אנו משתמשים hESCs שונה ביציבות עם מבנה כתב לוציפראז (לוח חומרים). הפרוטוקול גם עובד עם iPSCs, באמצעות iPSCs ללא שינוי לצורך ההשוואה של תא אבות היווצרות דם והתפתחות תא NK.
2. ארבעה ימים לפני תחילתו של מעבר TrypLE, עוברים תאי גזע עובריים / IPS עם collagenase הרביעי, בעקבות פרוטוקול מעבר נורמלי. אנחנו בדרך כלל עוברים 1:1 במעבר הראשון עם TrypLE. הרחב את תאי גזע עובריים / IPS בהתאם לפני כן.
יום לפני תחילתו של מעבר TrypLE, צלחת MEFs ב6 גם צלחות ב0.9-1 x 10 ⁵ תאים / גם אחת. לעבור 1:1 (או 2:01 לשורות תאים שקשה להסתגל או לתרבויות פחות צפופות) במעבר הראשון עם TrypLE. לכן, להכין 1 MEF צלחת לכל צלחת ES / IPS אתה מתכנן לשים לתוך תרבות TrypLE.
3. לבחור בקפידה את מושבות הבדיל (אלה שאין לי גבול מוגבל או שיש לי מאפייני fibroblastic / אפיתל) לפני שתמשיך לTrypLE דיסוציאציה. תאים מובחנים יכולים להשתלט על התרבות בקלות יחסית עם מעבר TrypLE, ולכן חשוב לוודא אוכלוסיית המוצא שלך היא מאוד נקי.
4. לשאוב תקשורת מבארות ולהוסיף TrypLE 1.0 מ"ל מראש חימם בחר בכל טוב.
5. תאי גזע עובריים דגירה / IPS בTrypLE עבור 5 דקות ב 37 ° C חממה. לאחר 5 דקות, בעדינות תאי גזע עובריים פיפטה מתחתית הבאר.
6. אסוף את ההשעיה תא TrypLE מבארות ולהעביר אל צינור חרוטי. פיפטה מעלה ומטה gently 2-3 פעמים כדי לעודד את הגושים הגדולים להתפרק. לדלל TrypLE עם לפחות 1 תקשורת ES נפח שווה ו1 DPBS נפח שווה. TrypLE לא הרווה ידי תקשורת ותרבות, ולכן חשוב לדלל TrypLE עם תקשורת וDPBS לאחר הסרת תאים מן הצלחת. אנו משתמשים בDPBS + מדיה עבור שוטף להציל תקשורת גזע עובריים.
7. ספין למטה תאים ב 1500 סל"ד במשך 5 דקות בצנטריפוגה בקירור (8 מעלות צלזיוס).
8. לשאוב את כמה שיותר את supernatant ככל האפשר כדי להסיר TrypLE.
9. תאי Resuspend ב 4 מ"ל תקשורת ES ועוד 4 DPBS מ"ל וחוזר על סיבוב כדי להיפטר משאריות של TrypLE.
10. לשאוב את supernatant ו resuspend בתקשורת ES נפח המתאימה לציפוי.
11. תאי גזע עובריים פלייט 1:1 (או 02:01 אם יהיה בכך צורך) על גבי MEFs בצפיפות נמוכה בתקשורת ES.
12. לאחר 24 שעות, להאכיל את תאי גזע עובריים עם תקשורת טרי. סביר להניח שיהיו רבים תאים בודדים שלא ייחס. להאכיל את תאי גזע עובריים ביום עם תקשורת גזע עובריים.
13. לעבור עם TrypLE על MEFs הטרי (0.9-1 x 10 ^{5 תאים / טוב) כל 3-4 ימים (למשל יום שלישי ושישי) באותו האופן בסיסי כאמור לעיל. בדרך כלל, אתה לא צריך לבחור תאים עברו עם TrypLE.}
14. לכמה קטעים הראשונים (עד למעבר 5-10), התאים ידרשו עוברים ב1:1. זה עושה את ההתרחבות של תאים קשה. מניסיוננו, ציפוי יעילות של תאי הגזע העובריים יורד באופן דרמטי סביב 4-5 קטעים ואז עולה בחזרה בתוך כמה קטעים. לאחר קטעי 5-7, ייתכן שתוכלו להתחיל להעביר את התאים ב01:02, וסופו של דבר, 01:03. מעבר למעבר 20, ייתכן שתצטרך להתחיל להעביר את התאים ב1:05 או 1:06. הקפד צלחת תאי הגזע העובריים בצפיפות גבוהה המעברים 5-10 הראשון. ברגע שאתה מגיע לנקודה שבה צלחת התאים למטה יעילות מספיק שהם יכולים להגיע למפגש ~ 70% בתוך יומיים לאחר מעבר, אתה יכול לנסות להתחיל ב01:02 עובר, וסופו של דבר צריך להיות מסוגל להעביר ב01:03 או 1:4. iPSCs, בפרט, אם לא צפוף מספיק לפני passaged מלאdapted, נוטה להבחין.

2. הכן פתרונות מניות להגדרת תרבויות EB ספין

1. 10% פתרון BSA בIMDM: להשעות 4 גרם של BSA ב35 מ"ל IMDM (ב50 מיליליטר חרוטי). פתרון יאפשר לשבת בטמפרטורת חדר למשך 1-2 שעות, כדי לאפשר BSA לפזר באופן מלא. התאם נפח הכולל עד 40 מ"ל עם IMDM כדי לקבל ריכוז סופי של 10%. BSA זמין מסחרי יכול להיות רעיל לתאים לתאי גזע עובריים. Deionizing הפתרון יכול להפחית את הפוטנציאל לcytotoxicity. לdeionize, להוסיף 1.3 ~ חרוזים שרף גרם ל 40 מ"ל של תמיסת BSA ולנער היטב כדי לערבב.
2. פתרון מקום BSA (עם חרוזים שרף) בשעה 4 מעלות צלזיוס עד חרוזים שינוי צבע מכחול ירוק לצהוב (מצביע על כך שקיבולת חילופי מוצתה).
3. Shake פתרון כל 20-30 דקות כדי להקל על החלפה
4. כל חליפין עשויים להימשך עד שעה 2. כאשר התמורה היא מוחלטת, צנטריפוגות פתרון עבור 2 דקות ב 1000 סל"ד לחרוזי גלולה בחלק תחתון של צינור.
5. חרצןפתרון ette BSA לתוך 50 מיליליטר חרוטי טריים, והשאיר את חרוזים כדי להיות מושלכים.
6. חזרו על שלבי 2.2-2.5 לפחות שתי פעמים נוספות עבור סכום כולל של שלושה או יותר חילופים. במהלך חילופי שעבר, היכולת של החרוזים עשוי שלא להיות מותשת באופן מלא גם לאחר שתי דגירה שעה עם החרוזים.
7. סינון סטרילי פתרון BSA ולהסיר את כל חרוזים שנותרו.
8. פתרון BSA צריך להיות יציב על 4 מעלות צלזיוס לפחות 2 חודשים.
9. 5% פתרון PVA: מדוד 100 מ"ל Millipore H ₂ O לתוך בקבוק זכוכית 125 מ"ל.
10. הוסף 5 גרם PVA למים. חשוב להוסיף PVA למים, כך שPVA מקבל באופן מלא "רטוב". אם אתה מוסיף את המים לPVA, זה ייקח הרבה מאוד זמן לPVA להיכנס לפתרון.
11. PVA לא לפזר באופן מיידי. פתרון מקום PVA / מים ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
12. למחרת בבוקר, פתרון מקום PVA / מים ב37 מעלות צלזיוס במשך שעה waterbath 4-8. PVA צריך להיות בעיקר בפתרון עד סוףהדגירה.
13. בקבוק בחזרה ב4 מעלות צלזיוס מקום ל24-48 שעות נוספות, או עד שהיא נמסה לגמרי. פתרון עשוי להיות מעט צמיג.
14. פתרונות PVA צריכים להיות יציבים על 4 מעלות צלזיוס במשך לפחות 6 שבועות.
15. חומצות לינולאית וינולנית (10,000 פתרונות X): לדלל עד 1 מ"ג / מ"ל באתנול 200 הוכחה. הוסף 10 מיליליטר שמן טהור למיליליטר אתנול 10. Aliquot ולאחסן ב -20 ° C.
16. פתרון α-MTG מניית: המדולל α-MTG μl 13 בIMDM 1 מ"ל.
17. פתרון 2-פוספט חומצה אסקורבית (100X): בצע פתרון מיליליטר מ"ג 5 /. 250 מ"ג חומצה אסקורבית 2 פוספט בכיתת 50 רקמות תרבות מיליליטר סטרילי, H ₂ O. מתמוסס בקלות.

3. הרכבה של BPEL מדיה (ל~ סה"כ נפח 200 מ"ל)

1. לעשות תערובת PVA-שומנים (צעד זה מונע מPVA ויוצר טיפות מסיסות במדיום שמקבל סונן).
2. הוסף IMDM 20 מ"ל ו 20-F-12 תערובת מזינה מ"ל ל -50צינור חרוטי מ"ל.
3. הוסף 10 מ"ל של 5% PVA מניות, 0.4 מ"ל synthechol, 20 חומצה לינולנית μl, וחומצה לינולאית 20 μl לתקשורת BPEL 200 מ"ל. Shake צינור גם לערבב. מניח בצד ואילו רכיבי מדיה אחרים הם התאספו.
4. להוסיף את כל רכיבי התקשורת שנותרו לחלק העליון של 250 יחידת סינון Stericup מ"ל. הוסף את יתרת IMDM הנדרש וכרכי F-12 (66 מ"ל כל אחד), BSA,-MTG, 100X, חומצת ITS Glutamax, פן / סטרפטוקוקוס, ללא חלבון hybridoma תערובת השני, ואסקורבית. הוסף את תערובת PVA-שומנים משלב 1 לחלק העליון של Stericup. סנן בינונית. בינוני צריכים להיות יציב על 4 מעלות צלזיוס לפחות 2 שבועות. השתמש במדיום ישן לצעדים לשטוף.

4. הקמת תאי גזע עובריים TrypLE-passaged למה אני ספין EBS

השתמש בתאי גזע עובריים / IPS שהותאמו לTrypLE מעבר בתאים (כלומר ES / IPS, כי כבר passaged עם TrypLE ב5-7 פעמים לפחות) נמוכה יותר בצפיפות MEFs. אם יכולים להיות מועברים תאים ב ~ 1:03 ולהיות 70-80% ומחוברות ב3-4 ימים, התאים צריכים להיות טובים לשימוש.

1. יומיים לפני הקמת בידול EB ספין (יום -2): לעבור TrypLE מותאמים לתאי גזע עובריים / IPS על MEFs הטרי בצפיפות ומאפשרת להם להיות 70-80% ומחוברות ביום התקנת בידול. אנחנו בדרך כלל עוברים 48 שעות לפני ספין התקנת EB.
2. היום של התקנת EB ספין למה אני בידול (יום 0): כדי להתכונן לציפוי EB ספין, המים פיפטה μl 150 סטרילי לתוך 36 בארות החיצוניות של כל צלחת 96 היטב כדי למזער את האידוי. השתמש 96 צלחות מסביב לתחתית, נמוכות מצורפים גם בלבד.
3. לשאוב את התקשורת והתרבות של תאי גזע עובריים / IPS ולהוסיף TrypLE 1.0 מ"ל מראש חימם בחר היטב כל אחד.
4. צלחות מקום החממה (37 מעלות צלזיוס) למשך 5 דקות. בעדינות פיפטה את התאים של הצלחת.
5. איסוף תאים ניתק בצינור חרוטי ופיפטה מעלה ומטה כדי להתפרק גושים. לדלל עם 1 TrypLE תקשורת BPEL נפח שווה ולפחות 1 DPBS נפח שווה.
6. הסר supernatant ו resuspendתאים בתקשורת BPEL 5 מ"ל בתוספת 5 DPBS מ"ל. חזור על ספין.
7. הסרת תאי supernatant ו resuspend בתקשורת BPEL 5-10 מ"ל, תלוי במספר התאים צפוי. תאים עוברים דרך 70 מיקרומטר מסננים (BD פלקון # 352,350) לתוך 50 מיליליטר חרוטי טרי כדי להסיר גושים (מה שיכול להפריע להיווצרות EB).
8. ספירת תאים מסוננים. תאי Aliquot שישמש לציפוי למיליליטר חרוטי 50 וספין. לציפוי: 3,000 תאי גזע עובריים / כן, 60 בארות / צלחת = 1.8x10 ⁵ תאי גזע עובריים / צלחת.
9. לאחר צנטריפוגה, תאים צריכים להיות resuspended ל3x10 ⁴ תאים / מ"ל (נפח μl 100 / היטב, 3,000 תאי גזע עובריים / טוב).
10. הכן את נפח תקשורת BPEL + ציטוקינים מספיקים לresuspending התאים (זה יהיה 6 מ"ל / צלחת). לבמה אני בידול, אנו משתמשים SCF (40 ng / ml), BMP4 (20 ng / ml), וVEGF (20 ng / ml) לגזירה של תאי hematopoietic.
11. 100 תאי μl פלייט / טוב (= 3,000 תאים / טוב) לכל אחד מ60 הבארות הפנימיות של prepared 96 צלחות היטב. זה הכי קל בעת שימוש pipettor רבת ערוצים ושוקת סטרילי. הקפד לערבב תאים על ידי pipetting לפני לשים בשוקת ולעבוד במהירות, כך שאין לי תאי סיכוי להגיע להסדר מחוץ.
12. ספין הצלחות 96, גם בצנטריפוגה בקירור למשך 4 דקות ב ~ 1500 סל"ד, 8 ° C.
13. להעביר בזהירות מהצלחות צנטריפוגות כדי 37 מעלות צלזיוס חממה. למנוע שיבוש הלוחות ככל האפשר. בדקו צלחות כדי לוודא שהתאים יצרו כדורים אחידים בחלק התחתון של הבארות.
14. שלב I ספין EBS לא צריך להיות מוזן או אחר מוטרד דרך ימי בידול 3-4 עד EBS יצר שכבה חיצונית עמידה יותר. אם EBS יישאר בשלב שמעבר ל10-12 ימים, לפעמים אנחנו מאכילים את EBS עם 50 תקשורת μl טרי BPEL עם ציטוקינים היטב כל אחד (ראשון להוציא 50 μl של המדיה הישנה מכל טוב). בתוך 24 שעות, התאים צריכים להתחיל ליצור מבנה EB 3-D, וביום צריכים להיות 3-5 שכבה חיצונית ברורה, ולהתחיל developing מבני פיברוזיס.

5. Dissociating השלב I EBS לניתוח FACS

לאסוף EB-36 around18 ספין לניתוח FACS. אם ניתוח תאים לפני היום 6, יותר בארות יש צורך לקבל מספרים סלולריים מספיקים.

1. הכן את הנפח דרוש של טריפסין עם 2% בסרום עוף. מקום 37 ° C waterbath עד לשימוש.
2. העבר את הספין EBS ותקשורת מצלחות 96, גם לצינורות חרוטי 15 מ"ל.
3. לאפשר EBS להתיישב לתחתית צינורות החרוטים. עם 5 מ"ל פיפטה, פיפטה בזהירות את supernatant ולהעביר צינור נפרד (שתוכל בריכת כל supernatant לתוך 15 מ"ל אחד או שפופרת 50 מיליליטר חרוטי). כפי שכבר שוחררו מEB הספין בין ימים 9 ו -11 כמה תאי hematopoietic, מפרידים את supernatant המכיל תאים אלה מונע trypsinization מוגזם.
4. Resuspend EBS בטריפסין + עוף 2% בסרום: 3-4 מ"ל לכל צינור חרוטי 15 מ"ל. הנח EBS עם טריפסין באספקת מים 37 מעלות צלזיוסrbath עבור 3-7 דקות. לנער או מערבולת בעדינות בכל דקות 1-2. בנקודתי זמן קודמות (לפני היום 8), EBS יתפרק בקלות רבה יותר ויכול לקחת קצת כמו 3 דקות. בנקודתי זמן מאוחרות יותר (+ יום 8) EBS עשוי להימשך זמן רב יותר כדי לנתק. בדרך כלל אנחנו לא נותנים להם trypsinize ליותר מ -5 דקות בשעה 37 ° C. שימו לב, בימים אלה הם מדריך בלבד. עבור כל שורת תאים מסוימת או בידול EB, זה עלול לקחת זמן, פחות או יותר כדי לנתק את EBS. לעקוב מקרוב אחר דיסוציאציה. חשוב לא להשאיר את התאים בטריפסין במשך זמן רב מדי. עדיף להפסיק טריפסין דיסוציאציה, כאשר רק כמה גושים קטנים יישארו גלויים ולא לנסות לחסל את כל הגושים.
5. להרוות טריפסין עם לפחות 1 נפח שווה של תקשורת המכילה FBS. ספין למטה תאים (1,500 סל"ד, 5 דקות, 8 מעלות צלזיוס).
6. Resuspend תאים בנפח מתאים של תקשורת לספירה (בדרך כלל 3-5 מ"ל).
7. תאי סינון דרך מסננת תא 100 מיקרומטר. הסר aliquot של תאים לספירה. להמשיך עם תאיםלפרוטוקולי FACS מעבדה סטנדרטיים.

6. פיתוח, הרחבה, ואפיון של תאי NK מתאי אב שמקורם hPSC

בגלל EBS הספין מכיל אחוז גבוה של תאי אבות היווצרות דם, הם יכולים להיות מועברים לתרבית תאי NK ישירות על 11 יום. ספין EBS עשוי להיות מועבר ל24 צלחות גם עם או בלי מתקני האכלה. אנחנו לא הראינו הבדלים בפנוטיפ או פונקציה בין תאי NK הנגזרים בכל תנאי. לכן, אנחנו בדרך כלל להעביר לתרבויות בלי מתקני האכלה יש מערכת מוגדרת לחלוטין להתפתחות תא NK. אם אתם משתמשים בקו hESC / iPSC עם בידול hematopoietic הכי מוצלח בשימוש בשכבות מזין מומלץ ^7,8.

1. באמצעות פיפטה רבה מוגדרת 100 μl, העברת 6 הספין EBS היטב בכל צלחת 24 באר.
2. עם האכלה: העברת הספין EBS ל24 גם צלחות המכילות 100,000 מוקרן (3,000 cGy) EL08-1D2 (embryoni עכבריג שורת תאי כבד) תאים בכל טוב. בלי מתקני האכלה: ההעברה EBS ישירות לציפוי, 24 צלחות היטב.
3. הוסף 400 תקשורת בידול NK μl המכיל ציטוקינים (IL-3, IL-15, IL-7, SCF, Flt3L, כל מPeprotech), כך הנפח הכולל בכל טוב הוא ~ 1 מ"ל.
4. תאי מקום החממה ולהאכיל כל 5-7 ימים עם תקשורת בידול NK המכיל את כל ציטוקינים בשלב 6.3 למעט IL-3.
5. תאי NK יביעו פנוטיפ בוגר בהעברה הבאה 28 יום לתרבות התמיינות תאי NK (איור 2).
6. כדי לבדוק cytotoxicity תא NK, ניתן לבצע assay שחרור כרום ⁸ שעות 4.
7. אם מספר גדול של תאים נדרשים במחקרי vivo, תרבות משותפת עם תאי מציגי אנטיגן מלאכותיים (aAPCs) יכולה להניב התרחבות של 2 יומן או גדול יותר. לפרוטוקול מפורט, בקר http://www.jove.com/video/2540/expansion-purification-functional-assessment-human-peripheral-blood ^11,12.

7. בדימות פלואורסצנטי וBioluminescent vivo לפקח hESC שמקורם בתאי NK ותאים סרטניים בעכברים immunodeficient

אנו משתמשים סוכרתיים nonobese / חמור בשילוב עם כשל חיסוני נוקאאוט גמא שרשרת (NOD / SCID / γC ^{- / -)} בעכברים, כי הם 6 עד 8 ​​שבועות בכל הניסויים שלנו. אנו משתמשים במודל הדמיה כפול כדי לעקוב אחר התקדמות גידול (turboFP650 כתב) וקינטיקה תאי NK-hESC (כתב fluc מתבטא בתאי גזע עובריים הוריים) in vivo בו זמנית. ערכת הדמיה זו החלים רחבה למערכות אחרות מאשר הדגם אנטי גידול שמוצג כאן. IVIS הספקטרום (Caliper מדעי חיים) הוא אופטימלי עבור דימות פלואורסצנטי וbioluminescent in vivo בו זמנית.

1. 24 שעות לפני הזרקת תאים סרטנית, עכברים להקרין (225-250 cGy).
2. מספר רצוי של resuspendתאים סרטניים (1 x 10 ⁶ תאי K562 מוצגים) ב200 Iscove μl שונה Dulbecco בינוני (IMDM) בתוספת 20% FBS. יכול להיות מגוון מינון תא גידול בהתאם למודל שימוש. TurboFP650 יכול גם לבוא לידי ביטוי בסוגים שאינם סרטניים. הוא צילמו הטוב ביותר עם תאים המקומיים למיקום האנטומי יחיד.
3. הזרק תאים סרטניים מתחת לעור לתוך בית החזה השמאלי העליון של העכברים באמצעות מחט מד 27 או 28 ולאפשר לנקלטים במשך 4 ימים. תאים צריכים ליצור בועה מתחת לעור של העכבר. יכולים להיות מגולחים עכברים בחלק זה של הגוף כדי להמחיש טוב יותר הזרקה. זה גם חושף את האזור לטוב בתחום ההדמיה vivo ניאון. הזרקה סביב בית החזה של העכברים הייתה בשימוש במודל זה, כי תאי NK ip המוזרקים הם דמיינו הטובים ביותר בזמן שהעכבר הוא שכיבה. שיטות חלופיות של משלוח תת עורית, כולל בגב או באגף, הן פחות מלחיצה לבעלי החיים וצריכים להילקח בחשבון.
4. Resuspend את המספר הרצוי של hESC-דרעיתאי NK VED (10 10 ⁶ תאי NK x מוצגים) ב300 Iscove μl שונה Dulbecco בינוני (IMDM) בתוספת 20% FBS ללא אנטיביוטיקה.
5. הזרק hESC שמקורם בתאי NK לכל intraperitoneally עכבר (IP) באמצעות מחט מד 27 או 28. לכל הניסויים, כולל עכברים שקבלו שום עירוי תאים סרטני או נ"ק כביקורת שלילית.
6. כדי לקיים אוכלוסיות תאי NK in vivo, לתת עכברי זריקת ה-IP μl 250 של IL-2 (1x10 ⁴ U / עכבר) ו-IL-15 (10 ng / עכבר) בDPBS סטרילי בכל יום למשך 7 הימים הראשונים ואחריו על ידי IL- 2 כל 2 עד 3 ימים רק עד הזמן של הקרבה.
7. לפקח engraftment של hESC שמקורם בתאי NK על ידי ההדמיה bioluminescent. הזרק כל IP עכבר עם 120 D-luciferin μl (150 מ"ג / ק"ג). תמונת 10 דקות לאחר הזרקת עכברי D-luciferin.
8. הרדימי עכברים באמצעות תא המאפשר כניסת isoflurane לתוך התיבה ב0.8 ליטר / דקה. ודא שיש גם זרימת חמצן לתוך התא.
9. הנח הרדיםעכברים בספקטרום IVIS ועכברים מאובטחים על גבם באמצעות קלטת או סקוטש ולאפשר כניסת isoflurane לתוך התיבה ברמה של 0.5 ליטר / דקה כדי לשמור על הרדמה.
10. הגדר IVIS מכונה לתקן פלטפורמת הדמיה (D עבור 4-5 עכברים, צלזיוס במשך 3 או פחות עכברים), להגדיר binning עד בינונית, ו / להפסיק עד 1 ולרכוש תמונת דקות 1.
11. כדי לבצע הדמיה ניאון לturboFP650 ⁺ תאים, השתמש באשף ההדמיה להגדיר סריקת פליטת מדידת הבדיקה של עניין, כמו גם אות רקע. מהרשימה של בדיקות לבחור Em הקלט / EX, ולהיכנס בעירור ופליטה נכונים. לturboFP650, השתמש 605 עירור ופליטה 660-720 למדוד אות גידול ו570 עירור ופליטה 640-720 למדוד אות רקע. השתמש בחשיפה אוטומטית של הגדרות ובחר את פלטפורמת ההדמיה הרצויה. רצף ההדמיה כולו יהיה בדרך כלל לוקח 3-5 דקות כדי לרכוש.
12. אפשר לעכברים כדי להחלים לחלוטין מן ההרדמה לפני ההובלה ממערכת ההדמיה. לנתח את התמונות באמצעות ליוינג גרסת תוכנת 4.2 חבילת תמונה (Caliper מדעי חיים).
13. לכמת אות bioluminescent באמצעות אזור של עניין (ROI) להגדיר לשטף הכולל (פוטונים / sec) או קרינה ממוצעת (פוטונים / שנייה / ² ס"מ / SR) ולהגדיר את כל התמונות לאותו קנה המידה (איור 3). כאן, תמונות נציג משמשות כדי להדגים את שתי אוכלוסיות תאים בכל עכבר (איור 3). מחקרים אחרים מהמעבדה שלנו הראו colocalization שימוש בטכניקה זו ^20. עיתוי colocalization יצטרך להיות מותאם המבוסס על מודל ניסיוני בשימוש.
14. כדי לכמת אות ניאון מרצף סריקת הפליטה להשתמש בתכונת "ספקטרלי unmixing" בתמונת חיים. בחר את התמונות שיש לכלול בניתוח ולצייר מסכה על פני השטח של העכבר המכיל את האות של עניין, במקרה זה, בית החזה העליון. בחר autofluorescense רקמה ובדיקה ידועה להיות בלתי מהולה. אם עכברים מקבלים מזון המכיל אספסת, אות מזון יכולה להיות גם unmixed מהבדיקה של עניין וautofluorescence רקמות.
15. אם התקבלה התמונות לא מראות חלוקה שווה של autofluorescence רקמות (כולל שטח שבו נמצא אות) ניתן להגדיר אילוצים לקבל הפצה אחידה והפרדה טובה יותר של המרכיבים שבלתי מעורבבים. זה אופייני ולעתים קרובות יש צורך לבדיקות שאינן כלולות בתוכנה וכאשר אות מסוימת היא נמוכה, או בסמוך לאות רקע. הגדרת מסנן גבוה לעבור, מצא תחת לשונית העדכון, ל640 ננומטר, אשר תואם את הקצה התחתון של עקומת הפליטה לturboFP650. ניתן גם להגדיר אילוץ מסנן מעביר נמוך, אבל זה היה מיותר לניתוח ההדמיה שמוצג כאן.
16. לכמת אות ניאון מהתמונה באמצעות הצרופה אזור של עניין (ROI) מוגדר יעילות קורנת (פוטונים / שנייה / ² ס"מ / SR) / μW) ולהגדיר את כל התמונות לאותו קנה המידה (איור 3).
17. בנקודת זמן רצויה, אפשר להקריב עכברים וניתח עבור engraftment של hESC שמקורם בתאים על ידי cytometry הזרימה. לתאי NK intraperitoneally מוזרקים בדרך כלל אנחנו מנתחים את הדם ההיקפי (לדמם וריד פנים), טחול, והצפק. ניתן לבצע שטיפת הצפק על ידי חשיפה רק קרום הצפק וביצוע חתך המדיאלי רחב מספיק כדי לאפשר לזכוכית פיפטה פסטר לגשת לחלל הצפק. באמצעות PBS סטרילי, לבצע מספר שטיפות של חלל הצפק לוודא לערבב פתרון ביסודיות על ידי החלפה של העכבר. לאסוף מספיק נוזלים עד שיש לך בעקבות צנטריפוגה גלולה גלויה (בדרך כלל 5-10 מ"ל של לשטוף).

תוצאות

הדור של תאי hematopoietic המשתמשים בגישת EB הספין מאפשר פיתוח תא NK אופטימלי מhESCs וiPSCs. כפי שמודגם באיור 2, 11 יום הספין EBS מכיל אחוזים גבוהים של תאים המבטאים CD34, CD45, CD43, וCD31. רמות גבוהות של CD34 ו CD45 מאפשרת העברה ישירה לתנאי NK ללא צורך במיון או לתמיכה בתאי סטרומה. אם יש בידול ...

Discussion

hESCs הוא פלטפורמה אידיאלית ללמוד סוגי תאים שונים ולהחזיק פוטנציאל יוצא דופן לתרגום קליני. אנו משתמשים, גישת EB ספין מוגדר להבדיל hESC / iPSCs לתאי אבות היווצרות דם. גישת EB הספין הניבה גזירה של תאים והתמיינות לתאי NK hematopoietic עולה בקנה אחד, ובכל זאת, עדיין קיימת שונות ביעילות ביד...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Reagent	Company	Catalog Number	Comments
			Materials
			Media
			BPEL media for Spin EB generation
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)	Fisher Scientific	SH3022801
F-12 Nutrient Mixture w/ Glutamax I	Invitrogen	31765035
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A3311	Commercially available BSA can be cytotoxic to ES cells. Deionizing the solution can reduce the potential for cytotoxicity.
Poly(vinyl alcohol)	Sigma-Aldrich	P8136
Linoleic Acid	Sigma-Aldrich	L1012
Linolenic Acid	Sigma-Aldrich	L2376
Synthechol 500X solution	Sigma-Aldrich	S5442
a-monothioglycerol (a-MTG)	Sigma-Aldrich	S5442
Protein-free hybridoma mix II	Invitrogen	12040077
Ascorbic Acid 2-phosphate	Sigma-Aldrich	A8960
Glutamax I	Invitrogen	35050061
Insulin, Transferrin, Selenium 100X solution (ITS)	Invitrogen	41400-045
Pen-Strep	Invitrogen	15140122
			NK Differentiation Media
Dubecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Invitrogen	11965-118
F-12 Media	Invitrogen	CX30315
15% Human AB serum	Valley Biomed	HP1022HI
5 ng/ml Sodium Selenite	Sigma-Aldrich	S5261
50 uM ethanolamine	Sigma-Aldrich	E9508
20 ng/ml ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A8960
25 uM 2-mercaptoethanol (BME)	Gibco	21985
2 mM L-glutamine	Gibco	CX30310
1% Pen-Strep	Invitrogen	15140122
			Cytokines
			(all cytokines used fresh from frozen aliquots)
SCF	PeproTech, Inc.	300-07	40 ng/ml in BPEL media; 20 ng/ml in NK medium). As noted by the Elefanty protocol, and as we discovered with a bad lot of BMP4, there can be lot differences with cytokines in regards to hematopoietic differentiation.Especially if buying cytokines in bulk, obtain a sample of the lot to test prior to purchase. Compare head-to-head with old lot.
rhBMP-4	R &D Systems	314-BP	20 ng/ml in BPEL media
rhVEGF	R&D Systems	293-VE	20 ng/ml in BPEL media
IL-2	PeproTech, Inc.	200-02	1 x 105 U/ml given to mice after NK cell injection; 50 U/ml used in NK cell expansion protocol
IL-15	PeproTech, Inc.	200-15	10 ng/ml given to mice after NK cell injection (first 7 days only)
IL-3	PeproTech, Inc.	200-03	5 ng/ml in NK media
IL-7	PeproTech, Inc.	200-07	20 ng/ml in NK media
Flt-3-Ligand	PeproTech, Inc.	300-19	10 ng/ml in NK media
			In vivo Imaging
D-Luciferin Sodium Salt	Gold BioTechnology	Lucna-500
TurboFP650 plasmid	Evrogen, Moscow, Russia	FP731	Subcloned into a Sleeping Beauty transposon based plasmid driven by the mCAGs promoter. Cells were then sorted on their expression of turboFP650 by FACS. Cells and plasmids can be obtained from our lab.
			Equipment
IVIS Spectrum Imaging System	Caliper Life Sciences
			Cells
Membrane bound IL-21 expressing artificial antigen presenting cells	MD Anderson, Houston, TX		contact: Dean A. Lee. http://www.jove.com/video/2540/expansion-purification-functional-assessment-human-peripheral-blood
Firefly luciferase expressing hESCs	University of Minnesota, Minneapolis, MN		contact: Dan S. Kaufman . H9 cells modified with a Sleeping Beauty transposon based method (references 13 and 14). Expression of firefly luciferase is driven by the mCAGGS promoter. Following the firefly luciferase gene is an IRES element at the 5' end of a GFP:zeocin fusion construct.
TurboFP650 expressing K562 cells	University of Minnesota, Minneapolis, MN		contact: Dan S. Kaufman. Description under plasmid comments section