فصل<em&gt; المتصورة المنجلية</em&gt; في وقت متأخر مرحلة المصابين تبدي الكريات الحمر بوسائل المغناطيسي

Summary

وتستخدم خصائص ممغطس من هيموزوين لعزل المراحل المتأخرة من المتصورة المنجلية المصابة خلايا الدم الحمراء نموا في الثقافة. هذه الطريقة بسيطة وسريعة ولا يؤثر على قدرات اللاحقة الغازية من الطفيليات.

Abstract

على عكس الأنواع الأخرى المتصورة، P. يمكن زرعها في المختبر المنجلية، مما يسهل دراستها ^1. في حين أن تحقيق تطفلن الدم يمكن أن تصل إلى حد 40٪ ≈، المحقق يحتفظ عادة نسبة حوالي 10٪. في كثير من الحالات يكون من الضروري عزل الطفيلي التي تحتوي على خلايا الدم الحمراء (كرات الدم الحمراء) عن تلك غير مصاب، لإثراء الثقافة والمضي قدما في تجربة معينة.

عندما P. يصيب كرات الدم الحمراء المنجلية، ويحط الطفيلي يتغذى من الهيموغلوبين ^{2، 3.} ومع ذلك، يجب أن الطفيلي التعامل مع شاردة الحديد سامة جدا هيم التي تحتوي على ^{4 و 5.} الطفيلي يتملص سميته عن طريق تحويل هيم إلى البوليمر الكريستال خاملة دعا haemozoin ^{6 و 7.} يتم تخزين هذا الجزيء التي تحتوي على الحديد في فجوة الغذائية والمعدنية في دولة لديها الأكسدة التي تختلف عن تلك الموجودة في هيم ^8. الدولة الحديديك الحديد في هيمozoin يضفي عليه خاصية ممغطس غائبة في كرات الدم الحمراء غير المصابة. كما الطفيلي الغازية تصل إلى مرحلة النضج، ومضمون haemozoin يزيد أيضا ^9، الذي يمنح المزيد من المغطسة على آخر مراحل P. داخل كرات الدم الحمراء المنجلية.

استنادا إلى هذه الخاصية ممغطس، أحدث مراحل P. ويمكن فصل الخلايا المنجلية المصابة الدم الحمراء عن طريق تمرير الثقافة من خلال عمود تحتوي على الخرز المغناطيسي. هذه الخرز المغناطيسي تصبح عندما يتم وضع الأعمدة التي تحتوي عليها على حامل المغناطيس. وبعد ذلك كرات الدم الحمراء المصابة، وذلك بسبب المغطسة بهم، أن المحاصرين داخل العمود، في حين أن التدفق من خلال ستتضمن، بالنسبة للجزء الاكبر، وكرات الدم الحمراء غير مصاب تلك المراحل المبكرة من المحتوية على الطفيلي.

هنا، نحن تصف منهجية لإثراء السكان من الطفيليات مرحلة متأخرة مع الأعمدة المغناطيسي، والذي يحافظ على بقاء الطفيليات جيدة ^10.بعد تنفيذ هذا الإجراء، يمكن إرجاعها إلى ثقافة غير مرتبط حاضنة للسماح للطفيليات المتبقية لمواصلة النمو.

Protocol

جميع الخطوات من البروتوكول، باستثناء centrifugations، ينبغي القيام بها داخل غطاء للحفاظ على عينة معقمة.

1. في وقت متأخر من مرحلة عزل P. المنجلية المصابة تبدي الكريات الحمر

ويمكن فصل جميع المراحل المتأخرة من الكريات الحمراء المنجلية المصابة مع هذه المنهجية، منذ هيموزوين، الذي يمنح المغطسة على الطفيلي، هو المستقلب المشتركة بين جنس. ينصح تطفلن الدم عالية (3-10٪) في الثقافة للحصول على أفضل غلة مع هذا البروتوكول، على الرغم من أن الثقافة التقليدية وتحتوي على 2-4٪ الهيماتوكريت (نسبة حجم خلايا الدم الحمراء) وتطفلن الدم 1-8٪ (النسبة المئوية من المصابين خلايا الدم الحمراء). يمكن تربيتها الطفيليات كما وصفها Trager ويانسن ^1.

1. يجب أن يتم تجميعها A البسيطة، متعددة الأجزاء الإعداد لإجراء العزل كل المتقسمة. لهذا، والأعمدة LS، فاصل المغناطيسي MidiMACS وMultiStand MACS من بيوتيك Miltenyi (الشكل 1 ) يتم استخدامها. أولا، نعلق الفاصل المغناطيسي للحامل معدني ومن ثم وضع العمود المغناطيسي على الفاصل.
2. في أنبوب منفصل (استخدام 50 مل في جميع أنحاء conicals)، مزيج 23،2 مل من RPMI 1640 و 750 ميكرولتر من بيكربونات الصوديوم 7.5٪ لإنشاء حل العمل. لديك أنابيب إضافية على يد لنبذ وجمع التدفق من خلال ثقافة الطفيلي.
3. أضف 3 مل من الحل إلى العمود العمل لتتوازن فيه، وتجاهل التدفق من خلال أنبوب إلى.
4. إضافة 8 مل من P. ثقافة المنجلية إلى العمود، والتأكد من أن بمجرد أن الجزء الأخير من الحل تم عمل طردوا من العمود من قبل الثقافة، ويتم استبدال الأنبوب تلقي من جانب واحد لبدء جمع انتعاش ثقافة غير منضم. هذا ضروري لتجنب إضعاف الثقافة أكثر من ذلك.
5. مرة واحدة في تدفق الثقافة من خلال العمود قد توقف، إضافة 1 مل من محلول العمل لدفع كرات الدم الحمراء المتبقية من العمود.
6. غسل الخطوة: إضافة آخر مل 3 من محلول العمل إلى العمود وجمع السائل التي تصب في أنبوب "تجاهل" من أجل تجنب إضعاف الثقافة يتم حفظ والتدفق من خلال أنبوب في أخرى.
7. شطف: مرة واحدة في 3 مل مرت من خلال العمود، فصل الأخير من الموقف ووضعه على رأس أنبوب 15 مل.
8. مرة أخرى، أضف 3 مل من محلول العمل إلى العمود. هذه الخطوة elutes والكريات الحمراء المصابة بالطفيليات المرحلة المتأخرة التي تم المحاصرين في حبات من العمود.

ملاحظة: عند هذه النقطة، وهذا يتوقف على مقدار من الطفيليات المطلوبة، تبدأ جولة أخرى / ثانية من جمع وتخضع بشكل مباشر للحدود تطفلن الدم في الثقافة الأصلية. يمكن إعادة استخدامها العمود طالما تدفق يحافظ على حالة مستقرة.

9. تركيز الطفيليات التي تم جمعها: الطرد المركزي في أنبوب 15 مل تحتوي على شطافة لمدة 5 دقائق في 150 XG في درجة حرارة الغرفةلتشكيل بيليه الظلام من الكريات الحمراء الطفيلي.
10. إزالة طاف ترك ما يكفي من السوائل لأخذ عينة صغيرة جدا وتحديد تركيز والمحصول الكلي من خلال المجهر (راجع الخطوة 2 أدناه).
11. في هذه اللحظة، إذا تم إنجاز العزلة والقبض على الطفيليات مرحلة متأخرة مرض، احتضان الثقافة جمعها مرة أخرى مع وسائل الإعلام الجديدة.
12. يخفف من الطفيليات التي تم جمعها في حجم والحل اللازم لتجارب لاحقة.

2. النقاء وتحليل الربح الموزع

1. تحقق من تركيز الطفيليات التي تم الحصول عليها باستخدام عدادة الكريات والفرز تحت المجهر الخفيفة. لحساب، إضافة 10 ميكرولتر من مزيج من الطفيليات التي تم جمعها وسائل الإعلام تحت غطاء زلة لعدادة الكريات. حساب عدد الطفيليات في الأرباع الأربعة من عدادة الكريات وتقسيم العدد الإجمالي بنسبة 4. مضاعفة هذا العدد بمقدار 10 ⁴ للحصول على تركيز ه المصابةrythrocytes لكل مل.

ملاحظات: سيتم تحديد أ) تركيز المزيج من قبل المستخدم في لحظة resuspending بيليه، وذلك بإضافة أكثر أو أقل المتوسطة. A تركيز اقترح العمل هو 5.5 X 10 ⁴ schizontes في ميكرولتر (ويتحقق هذا عادة عن طريق إضافة 100-300 ميكرولتر إلى جمع الطفيليات). إذا تم إضافة 20 ميكرولتر من هذا التركيز إلى وحدة تخزين النهائي من 100 ميكرولتر مزيج من وسائل الاعلام والكريات الحمراء، وتطفلن الدم من حوالي 1٪ في ثقافة نموذجية الهيماتوكريت 4٪ يمكن الحصول عليها. ب) في إطار العد عدادة الكريات يجب أن يكون سريعا، منذ بدء lysing الكريات الحمراء كما أن يجف عينة داخل الغرفة. والكريات الحمراء المصابة، التي ينبغي أن تكون الأغلبية، تظهر داخل بقعة داكنة، والتي تميزهم عن غير المصابة منها.

2. تنفيذ طبقة رقيقة بالغيمزا وصمة عار لتقييم نقاء جمع عن طريق تحديد الشرائح بسرعة كبيرة في الميثانول بنسبة 10٪، والتجفيف لهم، وتخبط روصمة عار المخفف تنحنح في حل 20٪ من بالغيمزا مع الماء المقطر. وصمة عار الشرائح لمدة 10 دقيقة، وبعد ذلك يمكن أن تجفف الهواء من قبل وفحصها تحت المجهر. وينبغي أن يكون تطفلن الدم أعلى بكثير من 70٪ يمكن تحقيقه.

النتائج

في الشكل 2، يظهر الثقافة التي تمر عبر العمود المغناطيسي، قبل (A) وبعد العملية. (B) وينظر عادة واحد إلى اثنين الكريات الحمراء المصابة في حقل التكبير 100X كما هو مبين في الشكل 2، ويتجهان إلى الكريات الحمراء المصابة في الشكل 2A. في ...

Discussion

في الثقافات المختبر من الملاريا الطفيلية P. يحمل المنجلية تطفلن الدم محدودة، مع أكثر من نصف خلايا الدم الحمراء غير مصاب في أعلى نقطة انتشار الثقافة. معظم البحوث للتجارب، من المستحسن أن تعمل فقط مع الكريات الحمراء المصابة. تحقيقا لهذه الغاية، وهي ت?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم كاشف	شركة	كتالوج رقم	التعليقات (اختياري)
RPMI 1640 HEPES تم التعديل	سيغما الدريخ	R4130	تستكمل مع مصل الإنسان 10٪ والجلوكوز 2٪، و 0.2٪ بيكربونات الصوديوم
MidiMACS فاصل	MACS Miltenyi بيوتيك	130-042-302
MACS MultiStand	MACS Miltenyi بيوتيك	130-042-303
LS أعمدة	MACS Miltenyi بيوتيك	130-042-401
عدادة الكريات	Grafco	Grafco نويباور غرفة	ويمكن الاطلاع من خلال العديد من الموردين الآخرين