Ayrılması<em&gt; Plasmodium falciparum</emManyetik Yoluyla&gt; Geç Evre-enfekte Eritrositler

Özet

Hemozoin bir paramanyetik özelliklerinin geç aşamalarında izole etmek için kullanılırlar Plasmodium falciparum-enfekte kırmızı kan hücreleri. Bu yöntem çok kolay ve hızlı ve parazitlerin sonraki invazif yetenekleri etkilemez.

Özet

Diğer Plasmodium türlerin aksine, P. falciparum onun çalışma ¹ kolaylaştırır laboratuar, kültüre edilebilir. Elde parazitemi ≈% 40 sınırına ulaşabilir olsa da, araştırmacı genellikle yaklaşık% 10 oranda tutar. Pek çok durumda, kültür zenginleştirmek ve belirli bir deney ile devam etmek için enfekte olmamış olanlardan parazit içeren kırmızı kan hücrelerinin (eritrositler), izole etmek için gereklidir.

Zaman P. falciparum eritrosit bozar, parazit düşürür ve hemoglobin ^{2, 3} beslenir. Ancak, parazitin bir çok toksik demir içeren haem parçası ^{4, 5} ile ilgilenmek zorundadır. Parazit haemozoin ^{6, 7 olarak} adlandırılan bir inert kristal polimer içine haem dönüştürerek kendi toksisite eludes. Bu demir içeren moleküller, gıda vakuol içinde depolanır ve bir metal haem ⁸ biri farklı bir oksidasyon durumuna sahiptir. Haem demir ferrik durumuozoin bu bulaşmamış eritrosit eksik olan paramanyetik özellikte bahşeder. Işgalci parazit olgunluğa ulaşır gibi haemozoin içeriği de P. son aşamalarında daha paramanyetizma ihsan, ^{9 da} artar eritrosit içindeki falciparum.

Bu paramanyetik özelliği, P. son aşamalarında dayanarak falciparum enfekte-kırmızı kan hücreleri manyetik boncuklar ihtiva eden bir sütun içinden geçen kültür tarafından ayrılabilir. Bunları içeren sütunlar bir mıknatıs tutucu üzerine konulduğunda Bu boncuklar manyetik hale gelir. Flow-through içerecektir iken onların paramanyetizma nedeniyle Enfekte RBCs, sonra çoğunlukla, enfekte olmamış eritrosit ve parazit içerenler erken aşamalarında için, sütun içine hapsolmuş edilecektir.

Burada, biz iyi parazit canlılığı ¹⁰ korur manyetik sütunlar ile geç evre parazitlerin nüfusu zenginleştirmek için metodoloji açıklanmaktadır.Bu yordamı gerçekleştirdikten sonra, bekâr kültürü kalan parazitler büyümeye devam sağlamak için bir inkübatör iade edilebilir.

Protokol

Protokolünün tüm adımları, centrifugations hariç, örnek steril tutmak için bir başlık içinde yapılmalıdır.

1. P. Geç Evre İzolasyonu falciparum-enfekte Eritrositler

Parazit paramanyetizma bahşeder hemozoin, cins için ortak bir metabolit olduğundan Plasmodium enfekte eritrositlerin tüm evrelerinde, bu metodoloji ile ayrılabilir. Tipik bir kültür% 2-4 hematokrit (kırmızı kan hücrelerinin hacminin yüzdesi) ve% 1-8 parazitemi (enfekte yüzdesi içerecektir ancak kültürde yüksek parazitemi (% 3-10), bu protokol ile daha iyi verim almak için tavsiye edilir kırmızı kan hücreleri). Trager ve Jansen ¹ tarafından açıklandığı gibi parazitler yetiştirilebilir.

1. Basit, çok parçalı kurulum her schizont izolasyon prosedürü için monte edilmelidir. Bunun için, LS kolonlar, bir manyetik MidiMACS Ayırıcı ve Miltenyi Biotec bir MACS MultiStand (Şekil 1 ) kullanılır. İlk olarak, metal stand için manyetik ayırıcı bağlamak ve ardından ayırıcı üzerinde kolon manyetik yerleştirin.
2. Ayrı bir tüp içinde (genelinde 50 ml conicals kullanın), RPMI 1640 23.2 ml ve iş çözümü oluşturmak için% 7.5 sodyum bikarbonat 750 ul karıştırın. Atılması için ise ek borular var ve akan toplama parazit kültür.
3. Bunu dengelemek için sütun çalışma çözeltisinin 3 ml ekleyin ve akan bir tüp içine atın.
4. P. 8 mL sütun falciparum kültürü, en kısa sürede çalışma çözeltisinin son bölümü olarak kültür ile sütun dışarı itilmiş olan emin, alıcı tüp bağsız kültür iyileşme başlatmak için bir toplama ile değiştirilir. Bu, daha fazla kültür seyreltilmesi önlemek için gereklidir.
5. Sütunu boyunca kültür akış bittikten sonra, sütunun geri kalan eritrositler dışarı itmek için çalışma çözeltisinin 1 ml eklemek.
6. Adım Yıkama: kolon için çalışma çözeltisi başka bir 3 ml ilave edilir ve diğer tüp içinde akan olarak kaydedilmiş olan kültür seyreltilmesi önlemek için "ıskarta" tüp içine akan sıvı toplamak.
7. Elüsyon: 3 ml kolonundan geçirilir sonra, stand ikinci çıkarın ve 15 ml tüp üstüne yerleştirin.
8. Yine, sütun için çalışma çözelti 3 ml eklenir. Bu adım sütun boncuk mahsur kalmışlardı geç evre parazit ile enfekte eritrositler elutes.

Not: bu noktada, ve gereken parazitlerin miktarına bağlı olarak, orijinal kültür içinde parazitemi sınırları belli tabi toplama başka yuvarlak / lar, başlar. Akışını istikrarlı bir devlet korur gibi sütun sürece yeniden kullanılabilir.

9. Toplanan parazitlerin konsantrasyonu: Oda sıcaklığında 150 x g'de 5 dakika boyunca elüsyon içeren 15 ml'lik santrifüjparazitlenmiş eritrositten karanlık bir pelet oluşturur.
10. Çok küçük bir örnek almak ve (aşağıya bakınız adım 2) mikroskopi ile konsantrasyonu ve toplam verim belirlemek için yeterli sıvı bırakarak Süpernatantı.
11. Geç evre parazit izolasyonu ve yakalama biçimde gerçekleştirilir, bu noktada, taze medya ile tekrar toplanan kültür inkübe edin.
12. Müteakip deneyler için gerekli hacim ve çözelti içinde toplanmış parazit seyreltilir.

2. Saflık ve Verim Analizi

1. Hemasitometre kullanarak ve bir ışık mikroskobu altında sayılarak elde edilen parazitlerin konsantrasyonu doğrulayın. Saymak için, hemasitometre bir kapak kayma altında toplanan parazit ve medya karışımı 10 ul ekleyin. Hemasitometre dört kadran parazit sayısını sayın ve 4 ile toplam sayısını bölün. Enfekte e konsantrasyonu elde etmek için 10 ⁴ ile bu sayı çarpmaml başına rythrocytes.

Notlar: karışımı a) konsantrasyon daha fazla veya daha az orta ekleyerek, pelet resuspending yapıldığı andaki kullanıcı tarafından belirlenecektir. Önerilen bir çalışma konsantrasyonu ul başına 5,5 X 10 ⁴ schizontes (bu genellikle toplanan parazitler 100-300 ul ekleyerek elde edilir) 'dir. Bu konsantrasyon 20 ul ortam ve eritrositler, tipik bir% 4 hematokrit kültür içinde yaklaşık% 1 arasında bir parazitemi 100 ul karışım nihai hacmi eklenmiş ise elde edilecektir. b) hemasitometre altında Sayma eritrositler odasının içindeki örnek kurudukça parçalama başından beri, hızlı olmak zorunda. Çoğunluk olmalı Enfekte eritrositler, non-enfekte olanlardan onları ayıran bir karanlık nokta içinde gösterecektir.

2. İnce tabaka Giemsa,% 10 metanol içinde çok hızlı bir şekilde slaytlar sabitleme onları kurutma, ve t daldırarak toplama saflığını belirlemek için leke gerçekleştirmeGiemsa bir% 20 çözelti halinde kenar damıtık su ile seyreltilmiştir leke. Onlar hava ile kurutulur ve mikroskop altında incelenebilir sonra 10 dakika için slaytlar Leke. De% 70 üzerinde bir parazitemi ulaşılabilir olmalıdır.

Sonuçlar

Şekil 2'de, manyetik sütun içinden geçen kültür önce gösterilmiştir (A) ve işlemden sonra (B). Şekil 2A oklar ile enfekte eritrositleri işaret ile, Şekil 2 'de gösterildiği gibi bir veya iki enfekte eritrositler genellikle bir 100X büyütme alan üzerinde görülür. Tipik bir prosedürde asitleştirme,% 5 parazitemi (Şekil 2A) bir kültür ile başlayarak, bu işlemin performansı genellikle% 97 ile% 100

Tartışmalar

Sıtma paraziti P. in vitro kültürlerde falciparum kültürü daha fazla olan en yüksek çoğalma noktada enfekte olmamış kırmızı kan hücrelerinin yarısından, sınırlı parazitemi sergiler. En çok araştırma deneyleri için, enfekte olmuş eritrositler ile birlikte çalışmak için sadece arzu edilir. Bu amaçla, bir ayırma tekniği, enfeksiyon göre kültür bölmek için gereklidir. Yararlı yöntemler enfekte olmamış eritrositler ¹¹ ve iki grupların farklı yoğunluk ya...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktif Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar (isteğe bağlı)
RPMI 1640 Hepes Modifiye	Sigma-Aldrich	R4130	% 10 insan serumu,% 2 glükoz, ve% 0.2 sodyum bikarbonat ile desteklenmiş
MidiMACS Ayırıcı	MACS Miltenyi BioTec	130-042-302
MACS MultiStand	MACS Miltenyi BioTec	130-042-303
LS Sütunlar	MACS Miltenyi BioTec	130-042-401
Hemasitometre	Grafco	Grafco Neubauer Odası	Diğer birçok tedarikçileri yoluyla bulunabilir