التربسين بروتوكول دايجست لتحليل الأوعية الدموية الشبكية للنموذج الفأر

Summary

التربسين هضم هي واحدة من الطرق الأكثر استخداما لتحليل الأوعية الدموية في شبكية العين. يصف هذا المخطوط الأسلوب في التفاصيل، بما في ذلك التعديلات الرئيسية لتحسين تقنية وإزالة الأنسجة غير والأوعية الدموية مع الحفاظ على الهيكل العام للسفن.

Abstract

التربسين هضم هو الأسلوب معيار الذهب لتحليل الأوعية الدموية في شبكية العين ^1-5. فإنه يسمح التصور من شبكة كاملة من ثلاثي الأبعاد الأوعية الدموية في شبكية العين المعقدة والشعيرات الدموية من خلال خلق ثنائية الأبعاد مسطحة جبل من القنوات المترابطة الأوعية الدموية بعد هضم مكونات غير الأوعية الدموية في شبكية العين. هذا يسمح احد لدراسة مختلف التغيرات المرضية الوعائية، مثل microaneurysms، انحطاط الشعرية، والبطانية غير طبيعية إلى نسب خلية حوطية. ومع ذلك، فإن هذه الطريقة صعبة من الناحية التقنية، لا سيما في الفئران، التي أصبحت نموذج حيواني معظم المتاحة على نطاق واسع لدراسة شبكية العين بسبب سهولة التلاعب الجيني ^6،7. في العين الماوس، فإنه من الصعوبة بمكان إزالة المكونات غير والأوعية الدموية مع الحفاظ على الهيكل العام للأوعية الدموية في شبكية العين. حتى الآن، ليس هناك ندرة في الأدبيات التي تصف هضم تقنية التربسين بالتفصيل أنان الماوس. يقدم هذا المخطوط منهجية خطوة بخطوة مفصل للهضم التربسين في الماوس شبكية العين، في الوقت الذي توفر أيضا نصائح حول مخرج الخطوات الصعبة.

Introduction

تصور الأوعية الدموية في شبكية العين نهجا هاما للغاية لتشريح آليات أمراض العيون المختلفة مثل اعتلال الشبكية السكري. فإنه يسمح احد لتقييم أقرب شذوذ الأوعية الدموية، بما في ذلك microaneurysms، انحطاط الشعرية، وفقدان خلية حوطية ^8،9. حتى الآن، كانت هناك العديد من التقنيات المتقدمة لتحليل الأوعية الدموية في شبكية العين. وقد استخدم نضح من مختلف الأصباغ لتسليط الضوء على السفن، ولكن كل تقاسمت قيود مماثلة. حقن نادرا ما يسلط الضوء على الأوعية الدموية في شبكية العين بأكملها ما لم يعطى في الضغط العالي، الذي يهدد بتمزيق واتلاف الاوعية ^1. المناعية من بطانة الأوعية الدموية مع fluorophore المسمى G isolectin B4 (اليكسا فلور 594 مترافق؛ I21413؛ إينفيتروجن؛ 1:100 تمييع) يمكن أن يتصاعد وشقة الشبكية تسليط الضوء على البنية الكلية للسفن، ولكن من دون عرض التصور من الشعيرات الدموية والأغشية الطابق السفلي وpericytes . ولوحظ من قبلFriedenwald أن السفن يمكن إبراز بواسطة تلطيخ مسطحة يتصاعد من شبكية العين مع الدوري حمض شيف (PAS) أو الهيماتوكسيلين ويوزين (H & E) تلطيخ ^10. ومع ذلك، كان تلطيخ غير محددة إلى السفن وسلطت الضوء على الأنسجة غير والأوعية الدموية وكذلك، مما يجعل من الصعب التفريق بين الأوعية. في 1960s، وضعت كوجان وكوابارا تقنية هضم التربسين التي جعلت من السهل تصور الأوعية الدموية في شبكية العين عن طريق هضم مكونات اوعائي من شبكية العين ^1. منذ ذلك الوقت، أصبح التربسين هضم طريقة المعيار الذهبي في تحليل الأوعية الدموية للشبكية العين ^2-5. ومع ذلك، فمن المهم أن نلاحظ أن تقنيات بديلة أخرى لعزل الأوعية الدموية وقد وصفت. وقد استخدمت استخدام تحلل التناضحي لعزل الأوعية الدموية والسماح الدراسات البيوكيميائية في الأنسجة ^11،12، ولكن لم يتم استخدامه الإجراء كوسيلة الأولية للدراسة تشريحية. لقد كان الأسلوب Print الأنسجةتستخدم لعزل قطاعات واسعة من الأوعية الدموية الدقيقة ويسمح للقدرة لدراسة الهندسة المعمارية تيار كهربي من الأوعية الدموية ^13. من الناحية النظرية، ويمكن أيضا أن هذه التقنية يمكن استخدامها لدراسة التغيرات التشريحية، كما نوعية السفن عالية. ومع ذلك، أنها قادرة على عزل أجزاء من شبكة الأوعية الدموية بأكملها فقط. على الرغم من أن هذه الأساليب لا يمكن أن تحل محل التربسين هضم، فمن المهم أن نلاحظ أن لديهم مزايا وعيوب مختلفة ومكملة في هذا الصدد.

طريقة هضم التربسين يمثل تحديا تقنيا ويصعب تنفيذ باستمرار ^6،7. وعلاوة على ذلك، لوحظ أن التربسين هضم من الصعب خصوصا على نموذج الفأر، ولا سيما إذا كان أحد يرغب في الحفاظ على بنية الأوعية الدموية الشاملة للشبكية العين ^6،7. وتشمل التحديات (1) الإفراط في الهضم من شبكية العين الذي يسبب خسارة كل من الأوعية الدموية وكذلك الأنسجة غير والأوعية الدموية، (2) وكيل الهضم، وتتطلبتشريح الميكانيكية واسعة النطاق والتي يمكن أن تؤدي بدورها إلى التلف من السرير السفينة، (3) فصل الفقيرة من الأنسجة غير والأوعية الدموية من الأوعية الدموية مما يؤدي إلى تلطيخ غير محددة. وقد أبرزت العديد من المخطوطات لهذه التحديات، ولكن قدمت بلا بروتوكول مفصلة ومتسقة للتغلب عليها ^14،15. وهذه المخطوطة تقديم منهجية خطوة بخطوة تفاصيل تقنية لتنفيذ التربسين هضم في شبكية العين الماوس والفئران مع نصائح محددة بشأن التعامل مع خطوات صعبة بشكل خاص. يتم عرض لمحة التخطيطي في الشكل 1.

Protocol

1. تحضير الشبكية

1. استأصل العين الماوس. باستخدام يد واحدة، فتح الجفون بحيث العين مرئيا. مع من ناحية أخرى، وذلك باستخدام ملقط المنحني (صعودا تواجه المنحني)، والضغط على الجوانب الأعلى والأدنى من المدار حتى يبرز العالم. إغلاق بلطف ملقط في الجانب الخلفي من العين ورفع في حركة مستمرة لاستأصل العين.
2. إصلاح العين مع 10٪ محايدة مخزنة الفورمالين لمدة 24 ساعة على الأقل.
3. مكان العين في حل PBS في طبق بتري الصغيرة.
4. تشريح خارج شبكية العين بعناية تحت المجهر، مع الحرص على تجنب إحداث الدموع كبيرة. إجراء الخفض الأولي في القرنية مع مقص تشريح. ثم، في حين الضغط على منطقة قطع مع ملقط على التوالي، واستخدام مقص لقطع على طول الحدود بين القرنية والصلبة إزالة القرنية. باستخدام ملقط غرامة المنحنية والمستقيمة، بعناية قشر الصلبة والمشيمية بعيدا عن الشبكية نحو العصب البصري. هذه الخطوة يتطلب الصبر كمايمكن بسرعة الافراج عن الشبكية يؤدي إلى الدموع. إزالة العدسة والقزحية أي الزائد والحطام من شبكية العين ^16.

2. يغسل الماء

1. مكان شبكية العين في صحن 24 أيضا، وتغطي مع الماء (حوالي 500 ميكرولتر وتصفيتها مع ما لا يقل عن مرشح ميكرون 45).
2. تغيير الماء كل 30 دقيقة، 1 ساعة، 4-5 مرات على الأقل.
3. ترك بين عشية وضحاها في الماء مع الهز لطيف في درجة حرارة الغرفة.

ملاحظة: الخطوات غسل مهمة جدا لأنها تساعد فصل طبقات الشبكية العصبية من الأوعية الدموية.

3. التربسين دايجست

1. إزالة المياه وشبكية العين احتضان في محلول 3٪ التربسين (Difco 1:250) في 0.1 م تريس العازلة (درجة الحموضة 7.8) عند 37 درجة مئوية مع الهز لطيف للا. اكتمال التربسين هضم عندما تبدأ الأنسجة التي تظهر عليها علامات التفكك (حوالي 1.5 ساعة).
   ملاحظة: تجنب المصافحة السريعوهذا يمكن أن يتلف الأوعية الدموية.
   
2. بعناية، ماصة من التربسين إلى منفصلة جيدا باستخدام المجهر لتجنب لمس شبكية العين. هذا التربسين الزائدة يمكن استخدامها في وقت لاحق، عند التعامل مع السفن تحت المجهر، في الخطوة 4.3.

4. فصل الأوعية الدموية

1. إضافة الماء المصفى إلى شبكية العين. ثم، محاولة لتقشر الغشاء الداخلي يحد بالملقط، وذلك باستخدام مقص إذا لزم الأمر. يهز مع الإثارة خفيفة لمدة 5 دقائق. بعناية، ماصة خارج الماء تحت المجهر لتجنب إتلاف شبكية العين.
2. كرر يغسل الماء (لمدة 5 دقائق لكل منهما) للمساعدة في الافراج عن شبكة من الأوعية من الأنسجة الشبكية ملتصقة. يتم الانتهاء من يغسل الماء عندما يكون هناك قليل من دون الحطام المتبقي في الماء بعد الغسيل.
3. وهناك حاجة إلى التلاعب حذرا تحت المجهر تشريح الآن إلى مزيد من تحرير شبكة من الأوعية. وفيما يلي العديد من التقنيات المفيدة، التي يمكن استخدامها في تسلسل أو دائرة الهجرة والجنسيةividually لتحقيق النتيجة المرجوة على أساس تفضيل التقنية:
   1. باستخدام ماصة ميكرولتر 200، ماصة بعناية الماء صعودا وهبوطا المتاخمة للسفن، تهب المياه في الأوعية، مما تسبب في الإثارة لطيف.
   2. باستخدام ماصة ميكرولتر 200، ماصة التربسين صعودا وهبوطا للمساعدة في الجدران معطف من ماصة. ثم، ماصة بعناية شبكة السفينة بأكمله صعودا وهبوطا مرة واحدة للمساعدة في كسر الأنسجة غير والأوعية الدموية.
      ملاحظة: يمكن توسيط طرف ماصة في العصب البصري بدلا من حواف شبكة الأوعية الدموية أيضا منع الأوعية الدموية من الالتصاق إلى الحافة.
      
   3. رفع بلطف الأوعية الدموية مع ملقط غرامة للخروج من الماء لطرد عناصر غير والأوعية الدموية.
   4. إذا لم يعمل الخطوات المذكورة أعلاه، إضافة التربسين إلى الشبكية للمساعدة في تحطيم الأنسجة، واحتضان عند 37 درجة مئوية لعدة دقائق. ثم، وإزالة التربسين وكرر الخطوات من 4،1-4،3.

ملاحظة: تأكد من معطف جميع الصكوك التي سوف تأتي في اتصال مع السفن في التربسين (مثل ماصة، ملقط). وهذا سوف يساعد على تجنب التصاق من الأوعية الدموية إلى المعدات.

5. تصور الأوعية الدموية

1. وضع قطرة من الماء على شريحة نظيفة. باستخدام ماصة ميكرولتر 200 أو ملقط، نقل السفن هضمها في الماء. تأكد من تكشفت الأوعية الدموية مسطحة جبل. والتوتر السطحي للماء يساعد على تتكشف شبكة الأوعية الدموية الآن شفاف. إذا لم تتكشف الأنسجة، وإضافة كميات إضافية من الماء ويهز بلطف الشريحة لتسهيل تتكشف.
2. إزالة المياه الزائدة ببطء شديد من قبل pipetting أو باستخدام منشفة ورقية.
3. تسمح الشرائح لتجف تماما.
4. وصمة عار الشرائح عبر البروتوكول المناسب إما مع PAS / الهيماتوكسيلين أو H & E وصمة عار.
   ملاحظة: PAS / الهيماتوكسيلين مفيد لتحديد جدار الوعاء الدموي والنوى الخلوية؛ H & E مفيد لدemonstration من RBC كذلك.
   
5. يذوى وجبل (Permount تصاعد متوسطة).

النتائج

المنتج النهائي من إجراء الناجح هو جبل المسطح من شبكة كاملة من الأوعية الدموية في شبكية العين الماوس، مع الحفاظ على العمارة، ملطخة إما PAS / الهيماتوكسيلين أو H & E، كما هو موضح في الشكلين 2-4. تمايز واضح من الخلايا البطانية وpericytes يمكن أن ينظر إليه كما ?...

Discussion

التربسين هضم هي طريقة قياسية لتقييم الأوعية الدموية في شبكية العين. لسوء الحظ، فإنه يمثل تحديا تقنيا ويمكن أن يؤدي إلى ارتفاع معدل فقدان العينة إذا لم يتم تنفيذ بشكل صحيح. وعلاوة على ذلك، فإن الإجراء صعب وخاصة في الفئران، والتي يمكن أن تحد من تطبيق هذه التقنية في النم...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
10% neutral buffered formalin	Fischer Scientific	SF100-4
Trypsin (1:250)	Amresco	0458-50G	Make 3% trypsin in 0.1 M Tris
TRIZMA base	Sigma	T1503-1KG	Create 0.1 M Tris Buffer (pH 7.8 @ 37 °C)
TRIZMA	Sigma	T3253-500G
Steritop sterile vacuum bottle	Millipore	SCGPS05RE	Create filtered water
EQUIPMENT
Dissecting microscope			Any microscope that allows good visualization of the retina is adequate. (10x is sufficient with working distance of 24 mm)
Straight scissors	Fine Science Tools	15024-10	Cutting edge: 8 mm; Tip diameter: 0.2 mm; 10 cm
Straight Forceps (Inox)	Dumont #5	11252-20	Biologie tip; 0.05 x 0.02 mm; 11 cm
Curved Forcepts (Dumostar)	Dumont #7	11297-10	Biologie tip; 0.07 x 0.04 mm; 11.5 cm
Dubnoff Metabolic Shaker Incubator	Precision Scientific	BDG59442	Shaker optional
24-well dish	Falcon	353047
Microscope Slides	VWR	82027-132