Трипсин Digest протокола для анализа сосудистой сети сетчатки модели мыши

Резюме

Трипсин дайджеста является одним из наиболее широко используемых методов анализа ретинальных сосудов. Эта рукопись описывает способ, в деталях, в том числе ключевых изменений для оптимизации техники и удалить не-сосудистой ткани, сохраняя при этом общую архитектуру сосудов.

Аннотация

Трипсин дайджеста является золотым стандартом метод анализа сосудистой сети сетчатки ^1-5. Это позволяет визуализировать всю сеть сложных трехмерных кровеносных сосудов сетчатки и капилляров путем создания двумерной плоской горы взаимосвязанных сосудистые каналы, после переваривания несосудистые компонентов сетчатки. Это позволяет изучать различные патологические изменения сосудов, таких как микроаневризмы, капиллярные дегенерации, и аномальные эндотелиальных к перицитами соотношениях. Тем не менее, этот метод является технически сложным, особенно у мышей, которые стали наиболее широко доступны животная модель для изучения сетчатки из-за легкости генетических манипуляций ^6,7. У мышей глаз, это особенно трудно полностью удалить несосудистые компонентов при сохранении общей архитектуры кровеносных сосудов сетчатки. На сегодняшний день существует нехватка литературы, описывающий технику трипсина дайджест подробно яп мыши. Эта рукопись содержит подробный шаг за шагом методологии трипсина дайджеста в сетчатке мышей, а также предоставляет советы по устранению неисправностей трудных шагов.

Введение

Визуализация сосудистой сети сетчатки является чрезвычайно важным подходом к рассекают механизмы различных заболеваний глаз, таких как диабетическая ретинопатия. Это позволяет оценить ранние сосудистые аномалии, в том числе микроаневризмы, капиллярные дегенерации и потери перицитами ^8,9. На сегодняшний день было проведено несколько методов, разработанных для анализа сосудистой сети сетчатки. Перфузии различные красители были использованы для выделения сосудов, но все они сталкиваются с аналогичными ограничениями. Инъекции редко освещает всю сосудистую сеть сетчатки если не дано при высоком давлении, что риск разрушения и повреждения судов ^1. Иммуноокрашивание сосудистого эндотелия с флуорофором меченных G isolectin B4 (Alexa Fluor 594 конъюгированные; I21413; Invitrogen; разведении 1:100) и сетчатки плоские крепления можно выделить общую архитектуру сосудов, но без детальной визуализацией капилляров, базальной мембраны и перицитах . Было отмечено,Friedenwald, что суда могут быть выделены путем окрашивания плоским крепления сетчатки с периодическими кислотно-Шиффа (PAS) или гематоксилином и эозином (H & E) окрашивание ^10. Тем не менее, окрашивание неспецифической к сосудам и особо не-сосудистой ткани, а также, что делает его трудно отличить сосудов. В 1960 году Коган и Кувабара разработана методика трипсина дайджеста, который сделал его легче визуализировать сосудистую сеть сетчатки расщеплением несосудистой компонентов сетчатки ^1. С того времени, трипсин дайджест стала золотым стандартом метод в анализе сосудистой сетчатки ^2-5. Однако, важно отметить, что другие альтернативные методы, чтобы изолировать сосудистой были описаны. Использование осмотический лизис был использован, чтобы изолировать сосудистой и позволяют биохимических исследований тканей ^11,12, но процедура не был использован в качестве основного метода для анатомического исследования. Метод печати ткань былаиспользована для выделения больших сегментов микрососудов и позволяет способности к обучению электротоническим архитектуры сосудистой ^13. Теоретически, этот метод может быть также использован для изучения анатомических изменений, так как качество сосудов является высокой. Тем не менее, это только возможность изолировать сегменты всей сосудистой сети. Хотя эти методы не могут заменить трипсин дайджест, важно отметить, что они имеют различные преимущества и недостатки, и дополняют друг друга в этом отношении.

Метод трипсина дайджеста является технически сложным и трудно выполнить последовательно ^6,7. Кроме того, было отмечено, что трипсин дайджест особенно трудно на мышиной модели, в частности, если он желает сохранить общую архитектуру сосудистой сетчатки ^6,7. Проблемы включают в себя (1) по-пищеварению сетчатки, которая приводит к потере как сосудистую, а также не-сосудистую ткань, (2) при-пищеварения, требующихобширные механические рассечение который в свою очередь может привести к повреждению сосуда кровать, (3) плохое разделение не-сосудистую ткань из сосудистой приводит к неспецифическое окрашивание. Несколько рукописей выявили эти проблемы, но ни один не представил подробный и последовательный протокол их преодоления ^14,15. Эта рукопись представит шаг за шагом методологии подробно технику для выполнения трипсина дайджест на мышей и крыс с сетчатки конкретные советы по обращению с особенно трудным шагом. Схематический обзор показано на рисунке 1.

протокол

1. Подготовка сетчатки

1. Выяснять мыши глазом. Использование одной стороны, открыть веки таким образом, что глаз является видимым. С другой стороны, использование пинцетов (изогнутые вверх), оказать давление на высших и низших аспектов орбите до мира выступает. Аккуратно закройте щипцы на задней поверхности глаз и поднимают в непрерывном движении выяснять глаз.
2. Исправить глаз с 10% нейтральный буферный формалин по крайней мере 24 часов.
3. Место глазом в PBS решение в небольшой чашке Петри.
4. Рассеките из сетчатки тщательно под микроскопом, стараясь избежать вызывая крупные слезы. Сделайте первичный разрез в роговице с рассечение ножницами. Затем, удерживая место надреза с прямыми щипцами, используйте ножницы, чтобы вырезать по границе роговицы и склеры удаление роговицы. Использование тонких изогнутых и прямых щипцов, осторожно снимите склеры и сосудистой оболочки от сетчатки к зрительному нерву. Этот шаг требует терпения,быстро освобождая сетчатки может привести к слезам. Снимите объектив и любой избыток радужной оболочки и мусора от сетчатки ^16.

2. Вода смывает

1. Место сетчатки в 24-луночный планшет и залить водой (приблизительно 500 мкл, фильтруют с по меньшей мере 45 мкм).
2. Меняйте воду каждые 30 минут-1 час, по крайней мере в 4-5 раз.
3. Оставить на ночь в воде при осторожном встряхивании при комнатной температуре.

Примечание: промывки очень важны, поскольку они помогают отделить нейронных слоев сетчатки из кровеносных сосудов.

3. Трипсин Дайджест

1. Удалить воды и инкубируют сетчатки в растворе 3%-ным трипсином (Difco 1:250) в 0,1 М Трис-буфера (рН 7,8) при 37 ° С при легком встряхивании на нет. Трипсин дайджест завершается, когда ткань начинает показывать признаки распада (примерно 1,5 часа).
   Примечание: Не быстрым встряхиваниемтак как это может привести к повреждению сосудов.
   
2. Осторожно, пипетка из трипсина в отдельную также с помощью микроскопа, не прикасаясь к сетчатке. Этот избыток трипсина могут быть использованы в дальнейшем, при обработке судов под микроскопом, на этапе 4.3.

4. Разделение сосудистую

1. Добавить фильтрованной воды к сетчатке. Тогда, пытаются снять с внутренней пограничной мембраны пинцетом, с помощью ножниц, если необходимо. Дрожать от слабом перемешивании в течение 5 мин. Осторожно, пипетка из воды под микроскопом, чтобы не повредить сетчатку.
2. Повторите воды автомойки (по 5 мин), чтобы помочь освободить сеть сосудов от соседних тканей сетчатки. Вода смывает завершены когда там практически нет мусора, оставшегося в воде после стирки.
3. Тщательное манипуляций при вскрытии микроскопом теперь, необходимых для дальнейшего освободить сеть сосудов. Ниже приведены некоторые полезные методы, которые могут быть использованы в последовательности или индividually для достижения желаемого результата на основе технических предпочтения:
   1. С помощью 200 мкл пипетки, пипетки тщательно водой вверх и вниз рядом с судами, дует на воду сосудов, вызывая легкое перемешивание.
   2. С помощью 200 мкл пипеткой пипетки трипсин вверх и вниз, чтобы помочь слой стены пипетки. Затем осторожно пипеткой всей сети судно вверх и вниз один раз, чтобы помочь сломать несосудистые ткани.
      Примечание: Центрирование пипетки на зрительный нерв, а не на краях сосудистой сети может также предотвратить сосудистую от прилипания к наконечнику.
      
   3. Аккуратно поднимите сосудистой с тонким пинцетом из воды, чтобы выбить несосудистые компонентов.
   4. Если перечисленные выше меры не работают, добавить трипсина к сетчатке, чтобы помочь разрушить ткань, и инкубировать при 37 ° С в течение нескольких минут. Затем удалите трипсина и повторите шаги 4.1-4.3.

<сильной ноте>: Убедитесь, чтобы покрыть все инструменты, которые будут вступать в контакт с судов в трипсин (например, пипетки, пинцет). Это поможет избежать сосудистой адгезии к оборудованию.

5. Визуализация сосудистой

1. Поместить каплю воды на чистое предметное. С помощью 200 мкл пипеткой или щипцы, передавать расщепленную сосудов в воду. Убедитесь, что сосудистые плоским крепление развернулись. Поверхностное натяжение воды помогает разворачиваться теперь прозрачной сосудистой сети. Если ткань не разворачиваться, добавлять дополнительное количество воды и аккуратно встряхните слайд для облегчения развертывания.
2. Удалите излишки воды, очень медленно с помощью пипетки или с помощью бумажного полотенца.
3. Разрешить слайды до полного высыхания.
4. Пятно слайды с помощью соответствующего протокола либо PAS / гематоксилином или H & E пятно.
   Примечание: PAS / гематоксилином полезен для выявления сосудистой стенки и клеточные ядра, H & E является полезным для гemonstration РБК, а также.
   
5. Дегидрировать и смонтировать (Permount монтажа среды).

Результаты

Конечный продукт успешной процедуры с плоским горе всей сети сосудистой сети сетчатки мыши, с архитектурой поддерживается, либо окрашивают PAS / гематоксилином или H & E, как показано на рисунках 2-4. Ясно дифференцировки эндотелиальных клеток и перицитов можно рассматривать ка...

Обсуждение

Трипсин дайджеста является стандартным методом оценки сосудистой сетчатки. К сожалению, это технически сложно и может привести к высокой скорости потери образца при их неправильном выполнении. Кроме того, процедура особенно трудно у мышей, которые могут ограничить применение этого м?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
10% neutral buffered formalin	Fischer Scientific	SF100-4
Trypsin (1:250)	Amresco	0458-50G	Make 3% trypsin in 0.1 M Tris
TRIZMA base	Sigma	T1503-1KG	Create 0.1 M Tris Buffer (pH 7.8 @ 37 °C)
TRIZMA	Sigma	T3253-500G
Steritop sterile vacuum bottle	Millipore	SCGPS05RE	Create filtered water
EQUIPMENT
Dissecting microscope			Any microscope that allows good visualization of the retina is adequate. (10x is sufficient with working distance of 24 mm)
Straight scissors	Fine Science Tools	15024-10	Cutting edge: 8 mm; Tip diameter: 0.2 mm; 10 cm
Straight Forceps (Inox)	Dumont #5	11252-20	Biologie tip; 0.05 x 0.02 mm; 11 cm
Curved Forcepts (Dumostar)	Dumont #7	11297-10	Biologie tip; 0.07 x 0.04 mm; 11.5 cm
Dubnoff Metabolic Shaker Incubator	Precision Scientific	BDG59442	Shaker optional
24-well dish	Falcon	353047
Microscope Slides	VWR	82027-132