Trypsin Digest Protokoll zum Analysieren des retinalen Gefäßsystem eines Maus-Modell

Zusammenfassung

Trypsin Digest ist eines der am häufigsten verwendeten Methoden, um retinale Gefäßsystem zu analysieren. Dieses Manuskript beschreibt das Verfahren im Detail, einschließlich der wichtigsten Änderungen, die Technik zu optimieren und entfernen Sie die nicht-vaskulären Gewebe und gleichzeitig die gesamte Architektur der Schiffe.

Zusammenfassung

Trypsin verdauen ist der Goldstandard Methode, um die retinale Gefäßsystem ^1-5 zu analysieren. Es ermöglicht die Visualisierung des gesamten Netzwerks von komplexen dreidimensionalen retinalen Blutgefäßen und Kapillaren, indem eine zweidimensionale Flachbild-Halterung der miteinander verbundenen Gefäßkanäle nach Aufschluss der nicht-vaskulären Komponenten der Netzhaut. Dies erlaubt es, verschiedene pathologische Gefäßveränderungen, wie Mikroaneurysmen Kapillare Degeneration und abnorme Endothelzellen zu pericyte Verhältnisse zu studieren. Allerdings ist das Verfahren technisch anspruchsvoll, vor allem bei Mäusen, die haben sich die am weitesten verbreitete Tiermodell, um die Netzhaut wegen der Leichtigkeit der genetischen Manipulationen ^6,7 studieren. In der Maus Auge, ist es besonders schwierig, vollständig zu entfernen, die nicht-vaskulären Komponenten, während die allgemeine Struktur der Blutgefäße der Netzhaut. Bis heute gibt es einen Mangel an Literatur, die Trypsin verdauen Technik beschreibt im Detail, in die Maus. Dieses Manuskript enthält eine detaillierte Schritt-für-Schritt-Methodik des Trypsin Digest in Maus Netzhaut, sondern schafft auch Tipps zur Fehlerbehebung schwierige Schritte.

Einleitung

Visualisierung des Gefäßsystems der Netzhaut ist ein äußerst wichtiger Ansatz, um die Mechanismen der verschiedenen Augenkrankheiten wie diabetischer Retinopathie sezieren. Er erlaubt es, die frühesten Gefäßveränderungen, einschließlich Mikroaneurysmen, Kapillar-Degeneration und Verlust pericyte ^8,9 bewerten. Bis heute gab es mehrere Techniken entwickelt, um die retinale Gefäßsystem zu analysieren. Perfusion verschiedener Farbstoffe verwendet worden ist, um die Gefäße zu markieren, sondern alle ähnliche Grenzen geteilt. Injection selten hebt die gesamte Netzhaut Gefäßsystem, es sei denn bei einem hohen Druck, das Aufbrechen und schädigen die Gefäße ¹ Risiken gegeben. Immunfärbung von vaskulären Endothel mit fluorophormarkierten G isolectin B4 (Alexa Fluor 594 konjugierten; I21413; Invitrogen; Verdünnung 1:100) und retinale flachen Halterungen können markieren Sie die gesamte Architektur der Schiffe, aber ohne detaillierte Visualisierung der Kapillaren, Basalmembranen und Perizyten . Es wurde von dem bekanntenFriedenwald, dass die Schiffe durch Färbung Flachbild-Halterungen der Netzhaut mit periodischen acid-Schiff (PAS) oder Hämatoxylin und Eosin (H & E)-Färbung ¹⁰ können hervorgehoben werden. Allerdings war Färbung nicht spezifisch für die Gefäße und markiert die nicht-vaskulären Gewebe sowie, was es schwierig macht, die Gefäße zu unterscheiden. In den 1960er Jahren entwickelt und Cogan Kuwabara das Trypsin zu verdauen Technik, die es einfacher, die retinalen Gefäße durch Verdauen des vaskulären Komponenten der Netzhaut ¹ sichtbar gemacht. Seit dieser Zeit hat sich das Trypsin Digest zum Goldstandard-Methode bei der Analyse der Gefäße der Netzhaut ^2-5. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass andere alternative Techniken, um das Gefäß zu isolieren beschrieben wurden. Die Verwendung von osmotischen Lyse wurde verwendet, um die Gefäße zu isolieren und damit biochemische Untersuchungen des Gewebes ^11,12, aber das Verfahren ist nicht als primäre Methode anatomischen Studie verwendet. Das Gewebe Druckmethode wurdeverwendet werden, um große Teile der Mikrovaskulatur zu isolieren und ermöglicht die Fähigkeit, die elektrotonischen Architektur des Gefäßsystems ¹³ zu studieren. Theoretisch könnte diese Technik auch verwendet werden, um anatomische Veränderungen zu untersuchen, wie die Qualität der Gefäße hoch ist. Es ist jedoch nur in der Lage, um Segmente des gesamten Gefäßsystem Netzwerk zu isolieren. Obwohl diese Methoden nicht ersetzen kann Trypsin verdauen, ist es wichtig zu beachten, dass sie unterschiedliche Vor-und Nachteile haben und sind in dieser Hinsicht ergänzen.

Das Trypsin Digest-Methode ist technisch anspruchsvoll und schwierig ist, konsequent ^6,7 durchzuführen. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass Trypsin Digest besonders schwierig ist auf einem Maus-Modell, insbesondere, wenn man wünscht, die gesamte Gefäßarchitektur der Netzhaut ^6,7 bewahren. Herausforderungen umfassen (1) über-Verdauung der Netzhaut, Verlust sowohl das Gefäßsystem sowie nicht-vaskulären Gewebe verursacht, (2) unter-Verdauung, erfordernumfangreiche mechanische Präparation wodurch wiederum führen zu Schäden des Schiffes Bett, (3) einer schlechten Trennung des nicht-vaskulären Gewebes aus dem Gefäßsystem zu nicht-spezifischen Färbung. Mehrere Manuskripte haben diese Herausforderungen hervorgehoben, aber keine haben eine detaillierte und konsistente Protokoll vorgesehen, um sie zu überwinden ^14,15. Dieses Manuskript wird es eine Schritt-für-Schritt-Methodik detailliert die Technik, um das Trypsin zu verdauen auf Maus und Ratte Netzhaut führen mit speziellen Tipps für den Umgang mit den besonders schwierigen Schritte. Eine schematische Übersicht ist in Fig. 1 gezeigt.

Protokoll

1. Retinal Vorbereitung

1. Enucleate die Maus Auge. Mit einer Hand, öffnen Sie die Augenlider so dass das Auge sichtbar ist. Mit der anderen Hand, mit einer gebogenen Pinzette (gebogen nach oben), Druck auf superior und inferior Aspekte der Umlaufbahn, bis die Kugel ragt. Schließen Sie vorsichtig Zange am hinteren Teil des Auges und heben in einer kontinuierlichen Bewegung, um das Auge entkernen.
2. Fix Auge mit 10% neutral gepuffertem Formalin für mindestens 24 Stunden.
3. Augenmarker in PBS-Lösung in eine kleine Petrischale.
4. Sezieren Netzhaut sorgfältig unter dem Mikroskop, wobei darauf zu achten induzieren große Tränen. Machen Sie eine erste Schnitt in der Hornhaut mit Dissektion Schere. Dann während die Schnittfläche mit geraden Pinzette, mit einer Schere entlang der Grenze der Hornhaut und Lederhaut Entfernen der Hornhaut geschnitten. Mit feinen gebogenen und geraden Pinzette vorsichtig schälen die Lederhaut und Aderhaut weg von der Netzhaut zum Sehnerven. Dieser Schritt erfordert Geduldschnell die Befreiung der Netzhaut kann zu Tränen führen. Nehmen Sie den Objektivdeckel und überschüssige Iris und Schmutz von der Netzhaut ^16.

2. Wasser wäscht

1. Platz Netzhaut in eine 24-Well-Platte und Deckel mit Wasser (etwa 500 ul, mit mindestens einem 45 um-Filter gefiltert).
2. Wechseln Sie das Wasser alle 30 min-1 h, mindestens 4-5 mal.
3. Lassen Sie über Nacht in Wasser unter leichtem Schütteln bei Raumtemperatur.

Hinweis: Die Waschschritte sind sehr wichtig, da sie zu trennen, die neuralen retinalen Schichten aus den Blutgefäßen zu helfen.

3. Trypsin Digest

1. Entfernen Sie das Wasser und Inkubation Netzhaut in einer Lösung von 3% Trypsin (Difco 1:250) in 0,1 M Tris-Puffer (pH 7,8) bei 37 ° C unter leichtem Schütteln keiner. Trypsin verdauen ist abgeschlossen, wenn das Gewebe beginnt Anzeichen des Zerfalls (ca. 1,5 h).
   Hinweis: Vermeiden Sie schnelles Schüttelnda dies zu Schäden am Gefäßsystem.
   
2. Vorsichtig aus Trypsin Pipette in einem separaten und mit Hilfe eines Mikroskops zu vermeiden, berühren die Netzhaut. Dieses überschüssige Trypsin kann später verwendet werden, wenn die Manipulation der Gefäße unter dem Mikroskop, in Schritt 4.3.

4. Die Trennung des Gefäßsystems

1. In gefiltertes Wasser an der Netzhaut. Dann schälen versuchen aus dem inneren Grenzmembran mit einer Pinzette, mit der Schere, wenn nötig. Schütteln Sie unter leichtem Rühren für 5 min. Vorsichtig Pipette das Wasser unter dem Mikroskop, um eine Beschädigung der Netzhaut.
2. Wiederholen Wasserwaschungen (jeweils 5 min), um kostenlos das Netzwerk von Schiffen aus der anhaftenden Netzhautgewebe helfen. Wasser wäscht abgeschlossen sind, wenn es wenig bis gar keine Trümmer im Wasser nach dem Waschen.
3. Sorgfältige Manipulationen unter einem Dissektionsmikroskop nun weiter frei bis das Netzwerk von Schiffen benötigt. Nachfolgend finden Sie einige nützliche Techniken, die in Sequenz oder ind verwendet werden kannividually zur Erreichung des gewünschten Ergebnisses zu technischen Präferenz:
   1. Mit einer 200 ul Pipette vorsichtig pipettieren Wasser nach oben und unten neben Schiffen, bläst Wasser bei Schiffen, was leichtem Rühren.
   2. Mit 200 ul Pipette pipettieren das Trypsin nach oben und unten zu beschichten Wände der Pipette helfen. Anschließend vorsichtig mit Pipette das gesamte Gefäß-Netzwerk einmal auf und ab zu helfen, brechen nicht-vaskulären Gewebe.
      Hinweis: Zentrieren der Pipettenspitze an der Sehnerven nicht die Kanten des vaskulären Netz kann auch verhindern, dass das Gefäßsystem Kleben an der Spitze.
      
   3. Heben Gefäßsystem mit feinen Pinzette aus dem Wasser, um nicht-vaskulären Komponenten zu entfernen.
   4. Wenn die oben genannten Schritte nicht funktionieren, fügen Trypsin auf die Netzhaut zu helfen, brechen das Gewebe, und Inkubation bei 37 ° C für mehrere Minuten. Dann entfernen Trypsin und wiederholen Sie die Schritte 4.1-4.3.

Hinweis: Achten Sie darauf, zu beschichten alle Instrumente, die in Kontakt mit den Gefäßen in Trypsin (zB Pipette, Pinzette) wird kommen. Dies wird Ihnen helfen zu vermeiden Haftung Gefäßsystem an die Ausrüstung.

5. Visualisierung des Gefäßsystems

1. Geben Sie einen Tropfen Wasser auf einen sauberen Objektträger. Mit einer 200 ul Pipette oder Pinzette, übertragen Sie die verdaut Schiffe ins Wasser. Stellen Sie sicher, dass das vaskuläre Flachbild-Halterung entfaltet. Die Oberflächenspannung des Wassers hilft, die jetzt durchsichtig Gefäßnetz entfalten. Wenn das Gewebe nicht zu entfalten ist, fügen Sie zusätzliche Wasser und schütteln Sie die Folie zu erleichtern Entfaltung.
2. Überschüssiges Wasser sehr langsam durch Pipettieren oder mit einem Papiertuch.
3. Lassen Sie die Objektträger vollständig trocknen.
4. Stain Folien über entsprechende Protokoll entweder mit PAS / Hämatoxylin oder H & E-Färbung.
   Hinweis: PAS / Hämatoxylin ist nützlich zur Identifizierung von Gefäßwand und Zellkerne, H & E ist nützlich für demonstration von RBC als gut.
   
5. Entwässern und montieren (Permount Eindeckmediums).

Ergebnisse

Das Endprodukt eines erfolgreichen Verfahrens ist ein Flachbild-Halterung des gesamten Netzes der Maus retinalen Gefäßen, mit der Architektur gehalten, gefärbt entweder mit PAS / Hämatoxylin oder H & E, wie in den Figuren 2-4 gezeigt. Klare Differenzierung von Endothelzellen und Perizyten zu sehen, wie in Abbildung 3 gezeigt. In der Netzhaut sind die Kerne von Endothelzellen oval oder länglich und liegen vollständig innerhalb der Gefäßwand. Perizyten Kerne sind klein, kugelf...

Diskussion

Trypsin Digest ist ein Standardverfahren, um die Vaskulatur des Retina zu bewerten. Leider ist es technisch anspruchsvoll und kann in hohen Rate von Probe verloren gehen, wenn sie nicht ordnungsgemäß durchgeführt. Darüber hinaus ist das Verfahren besonders schwierig in Mäusen, welche die Anwendung dieser Technik bei den üblicherweise verwendeten genetischen Tiermodellen für Erkrankungen des Auges zu begrenzen. Dieses Papier gibt Hinweise, wie das Verfahren effektiv und konsequent durchzuführen, Maus Augen.

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
10% neutral buffered formalin	Fischer Scientific	SF100-4
Trypsin (1:250)	Amresco	0458-50G	Make 3% trypsin in 0.1 M Tris
TRIZMA base	Sigma	T1503-1KG	Create 0.1 M Tris Buffer (pH 7.8 @ 37 °C)
TRIZMA	Sigma	T3253-500G
Steritop sterile vacuum bottle	Millipore	SCGPS05RE	Create filtered water
EQUIPMENT
Dissecting microscope			Any microscope that allows good visualization of the retina is adequate. (10x is sufficient with working distance of 24 mm)
Straight scissors	Fine Science Tools	15024-10	Cutting edge: 8 mm; Tip diameter: 0.2 mm; 10 cm
Straight Forceps (Inox)	Dumont #5	11252-20	Biologie tip; 0.05 x 0.02 mm; 11 cm
Curved Forcepts (Dumostar)	Dumont #7	11297-10	Biologie tip; 0.07 x 0.04 mm; 11.5 cm
Dubnoff Metabolic Shaker Incubator	Precision Scientific	BDG59442	Shaker optional
24-well dish	Falcon	353047
Microscope Slides	VWR	82027-132