Tripsin Digest Protokolü Fare Modeli Retina damarları Analiz

Özet

Tripsin sindirmek retina damar analiz etmek için en sık kullanılan yöntemlerden biridir. Bu yazının gemilerin genel mimarisi korurken teknik optimize etmek ve olmayan vasküler doku kaldırmak için önemli değişiklikler de dahil olmak üzere, ayrıntılı olarak yöntem açıklanır.

Özet

Tripsin sindirmek retina damar ^1-5 analiz etmek için altın standart bir yöntemdir. Bu retinanın vasküler olmayan bileşenlerin sindirim sonra birbirine vasküler kanalların bir iki boyutlu düz montaj oluşturarak karmaşık üç boyutlu retina kan damarları ve kılcal damarların tüm ağ görselleştirme sağlar. Bu böyle bir mikroanevrizmalar gibi çeşitli patolojik vasküler değişiklikler, kılcal dejenerasyon ve pericyte oranları anormal endotel çalışma sağlar. Ancak, yöntem hangi çünkü genetik manipülasyonlar ^6,7 kolaylığı retina incelemek için en yaygın kullanılan hayvan modeli haline gelmiştir, özellikle farelerde, teknik olarak zordur. Fare gözünde, bu retinal kan damarlarının genel yapısını muhafaza ederken tamamen vasküler olmayan bileşenleri ortadan kaldırmak için özellikle zordur. Bugüne kadar, ayrıntılı olarak tripsin sindirmek teknik anlatılmaktadır edebiyat bir eksiklik olduğunu iFare n. Ayrıca zor adımlar sorun giderme ipuçları sağlarken Bu makale, fare retinada tripsin özet ayrıntılı bir adım adım yöntem sağlar.

Giriş

Retinanın damar görselleştirme, diyabetik retinopati gibi çeşitli göz hastalıklarının mekanizmaları incelemek için son derece önemli bir yaklaşımdır. Bu bir mikroanevrizmalar, kılcal dejenerasyon ve pericyte kaybı ^8,9 dahil olmak üzere en erken vasküler anormallikler, değerlendirmenizi sağlar. Bugüne kadar, retina damar analiz etmek için geliştirilen çeşitli teknikler olmuştur. Çeşitli boyaların Perfüzyon damarları vurgulamak için kullanılmıştır, ama benzer kısıtlamaları paylaştı. Gemiler ¹ kırılması ve zarar riskleri bir yüksek basınç, verilen sürece Enjeksiyon nadiren tüm retina damar vurgulamaktadır. Fluorofor etiketli G B4 isolectin (, I21413, Invitrogen, konjuge Alexa Fluor 594 1:100 seyreltme) ile vasküler endotel immün ve retina düz bağlar gemilerin genel mimarisi vurgulamak, ama kılcal damarların detaylı görüntülenmesi, bazal membran ve perisitler olmadan olabilir . Bu tarafından not edildiGemilerin periyodik asit-Schiff (PAS) veya hematoksilen ve eozin (H & E) boyama ¹⁰ ile retinanın düz bağlar boyama vurgulanan olabilir Friedenwald. Ancak, boyama gemilere spesifik olmayan ve de olmayan vasküler doku vurgulanır, zor damarları ayırt etmek için yapmak. 1960'larda, Cogan ve Kuwabara daha kolay retina ¹ nonvasküler bileşenleri sindirerek retina damar görselleştirmek için yapılan tripsin sindirmek tekniği geliştirdi. O zamandan beri, tripsin sindirmek retinanın ^2-5 damar analiz altın standart yöntem haline gelmiştir. Bununla birlikte, damar izole etmek için başka bir alternatif teknikler tarif edilmiştir dikkat etmek önemlidir. Ozmotik lizis kullanımı damar izole ve doku ^11,12 biyokimyasal çalışmaları sağlamak için kullanılmıştır, ancak prosedür anatomik çalışma için birincil yöntem olarak kullanılmamıştır. Doku baskı yöntemi olmuşturmikrovasküler büyük bölümü izole etmek için kullanılan ve damar ¹³ elektrotonik mimarisi çalışma yeteneği sağlar. Teorik olarak, bu tekniği de gemilerin kalitesi yüksek olarak, anatomik değişiklikleri incelemek için kullanılabilir. Ancak, sadece damar ağı tüm bölümleri tespit edebilmektedir. Bu yöntemler tripsin sindirmek yerini alamaz rağmen, farklı avantajları ve eksiklikleri var ve bu konuda tamamlayıcı olduğunu not etmek önemlidir.

Tripsin sindirmek yöntemi teknik olarak zor ve sürekli ^6,7 gerçekleştirmek zordur. Ayrıca, bu istediği retina ^6,7 genel vasküler mimarisi korumak için özellikle tripsin sindirmek, bir fare modeli özellikle zor olduğu görülmüştür. Sorunlar gerektiren, (1) yanı sıra, damar vasküler olmayan dokusu hem kaybına neden olan retinanın aşırı sindirilmesi, (2) altında yer sindirimen damar yatağının hasar, non-spesifik boyama yol açan damar gelen olmayan vasküler doku (3) kötü ayırma yol dönüşebilir geniş mekanik diseksiyonu. Çeşitli el yazmaları bu zorlukları ortaya koydu, ama hiçbiri onları ^14,15 üstesinden gelmek için detaylı ve tutarlı bir protokol hazırladık. Bu yazının özellikle zor adımları kullanımı ile ilgili özel ipuçları ile fare ve sıçan retina üzerinde tripsin sindirmek gerçekleştirmek için teknik ayrıntılı bir adım adım yöntem tanıtacak. Şematik bir genel görünüşü Şekil 1'de gösterilmiştir.

Protokol

1. Retina Hazırlık

1. Fareyi göz tanıttılar. Tek elle, gözle görülebilecek şekilde göz kapakları açın. Diğer elinizle, kavisli bir forseps (kavisli yukarı bakacak şekilde) kullanarak, yörüngesinin üst ve alt yönleri üzerinde baskı uygulamak dünya çıkıntı kadar. Yavaşça gözün arka yönü de forseps kapatın ve göz tanıttılar sürekli bir hareket kaldırın.
2. Nötr% 10, en az 24 saat boyunca tamponlu formalin içine göz düzeltildi.
3. Küçük bir Petri kabındaki PBS çözüm yeri göz.
4. Büyük gözyaşları uyaran önlemek için özen, bir mikroskop altında dikkatle retina parçalara ayır. Diseksiyon makas ile kornea bir ilk kesim olun. Daha sonra, düz forseps ile kesim alanı tutarken, kornea çıkarmadan kornea ve sklera sınırı boyunca kesmek için makas kullanın. Dikkatle sklera ve uzak optik sinir doğru retina koroid kabuğu, ince kavisli ve düz forseps kullanma. Bu adım olarak sabır gerektirirhızlı bir şekilde serbest retina yırtıkları yol açabilir. Lens ve retina ¹⁶ emdiği iris ve pislikleri temizleyin.

2. Su yıkar

1. 24 kuyulu bir yemek ve su (en az 45 mikron filtre ile süzüldü, yaklaşık 500 ul), ile kapakta yer retina.
2. , Her 30 dakika-1 saat en az 4-5 kez su değiştirin.
3. , Oda sıcaklığında nazik çalkalama ile su içinde bir gece bekletin.

Not: kan damarlarından nöral retina katmanları ayrı yardımcı olarak yıkama adımlar çok önemlidir.

3. Tripsin Digest

1. 37 0.1 M Tris tamponu (pH 7.8) içinde% 3 tripsin (Difco 1:250) solüsyonu ° C'de herhangi bir çalkalama için yumuşak olan, su ve inkübe retina çıkarın. Doku parçalanması belirtileri (yaklaşık 1,5 saat) gösteren başladığında tripsin sindirmek tamamlanır.
   Not: hızlı sallayarak kaçınınBu damar zarar verebilir gibi.
   
2. Dikkatle, retina dokunmamak için bir mikroskop kullanarak iyi bir ayrı içine tripsin dışarı pipetle. Adım 4.3 mikroskop altında damarları, işlenirken Bu aşırı tripsin, daha sonra kullanılabilir.

4. Damarları ayırmak

1. Retinaya filtrelenmiş su ekleyin. Daha sonra, gerekirse makas kullanarak, forseps ile iç sınırlayıcı membran kalkmasına çalışmayın. 5 dakika için hafif ajitasyon ile çalkalayın. Dikkatle, retina zarar vermemek için mikroskop altında su pipetle.
2. Yapışık retina dokusu, damar serbest ağ yardımcı olmak için su yıkama (her biri 5 dakika) için tekrarlayın. Yıkamadan sonra suda kalan hiçbir enkaz çok az olduğunda su yıkar tamamlanır.
3. Bir diseksiyon mikroskop altında dikkatli manipülasyon şimdi damarların ağ daha özgür ihtiyaç vardır. Aşağıda sırası veya ind kullanılabilecek birkaç yararlı teknikler vardırividually teknik tercihine göre istenen sonuca ulaşmak için:
   1. 200 ul pipet kullanarak, dikkatli bir şekilde yavaşça sallanarak neden, gemi su üfleme, aşağı komşu gemilere su pipet ve.
   2. 200 ul pipet kullanarak, pipet kat duvarları için aşağı tripsin yukarı pipet ve. Daha sonra, DİKKATLE olmayan vasküler doku yıkmak için bir kez tüm damar ağı ve aşağı yukarı pipetle.
      Not: yerine damar ağının kenarları daha optik sinir de pipet Merkezleme da ucu yapışmasını damar engelleyebilirsiniz.
      
   3. Yavaşça olmayan vasküler bileşenleri çıkarmak için su dışında ince forseps ile damar kaldırın.
   4. Yukarıdaki adımları işe yaramazsa, doku yıkmak yardımcı olur ve birkaç dakika ° C 37 inkübe retinaya tripsin ekleyin. Daha sonra, tripsin kaldırmak ve adımları 4.1-4.3 tekrarlayın.

Not: kat tripsin en gemiler (örneğin pipet, forseps) ile temas edecek tüm araçları emin olun. Bu ekipman damar yapışmasını önlemeye yardımcı olacaktır.

5. Damarları görselleştirme

1. Temiz bir slayt üzerine bir damla su koyun. 200 ul pipet veya forseps kullanarak, suya sindirilir damarları aktarın. Emin olun vasküler düz montaj gelişeceğini edilir. Suyun yüzey gerilimi şimdi yarı saydam damar ağı açılmak için yardımcı olur. Doku açılmak değilse, ek su ekleyin ve hafifçe açığa çıkmasını kolaylaştırmak için slayt sallayın.
2. Bir kağıt havlu pipetleme veya kullanarak çok yavaş aşırı su çıkarmak.
3. Slaytlar tamamen kurumasını bekleyin.
4. PAS / hematoksilen veya H & E boyama ile ya da uygun protokolü üzerinden slaytlar Leke.
   Not: PAS / hematoksilin damar duvarı ve hücre çekirdekleri tanımlamak için yararlıdır, H & E, D için yararlıdırRBC emonstration de.
   
5. (Permount orta montaj) kurutmak ve monte edin.

Sonuçlar

Başarılı bir prosedür nihai ürün Şekil 2-4 de gösterildiği gibi mimari, PAS / hematoksilin ve H & E ile boyandı ya da, muhafaza ile birlikte, fare retina damar sistemine ait bütün ağ düz bir montaj olup. Şekil 3'te gösterildiği gibi, endotelyal hücreler ve perisitler açık bir farklılaşma görülebilir. Retina endotelyal hücrelerinin çekirdeklerindeki oval veya uzun ve damar duvarı tamamen içinde yer alır. Pericyte çekirdekleri küçük, küresel, yoğ...

Tartışmalar

Tripsin özet retinanın damar değerlendirmek için standart bir yöntemdir. Ne yazık ki, teknik olarak zor ve Doğru şekilde gerçekleştirilmemesi durumunda numune kaybı yüksek oranda neden olabilir. Ayrıca, işlem göz hastalıkları, yaygın olarak kullanılan bir genetik hayvan modellerinde bu tekniğin uygulanması sınırlandıran, farelerde özellikle zordur. Bu kağıt fare gözünde etkin ve sürekli yordamı gerçekleştirmek için nasıl rehberlik sağlar.

Protokolde pek ç...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
10% neutral buffered formalin	Fischer Scientific	SF100-4
Trypsin (1:250)	Amresco	0458-50G	Make 3% trypsin in 0.1 M Tris
TRIZMA base	Sigma	T1503-1KG	Create 0.1 M Tris Buffer (pH 7.8 @ 37 °C)
TRIZMA	Sigma	T3253-500G
Steritop sterile vacuum bottle	Millipore	SCGPS05RE	Create filtered water
EQUIPMENT
Dissecting microscope			Any microscope that allows good visualization of the retina is adequate. (10x is sufficient with working distance of 24 mm)
Straight scissors	Fine Science Tools	15024-10	Cutting edge: 8 mm; Tip diameter: 0.2 mm; 10 cm
Straight Forceps (Inox)	Dumont #5	11252-20	Biologie tip; 0.05 x 0.02 mm; 11 cm
Curved Forcepts (Dumostar)	Dumont #7	11297-10	Biologie tip; 0.07 x 0.04 mm; 11.5 cm
Dubnoff Metabolic Shaker Incubator	Precision Scientific	BDG59442	Shaker optional
24-well dish	Falcon	353047
Microscope Slides	VWR	82027-132