توصيف الاستجابات الالتهابية خلال الاستعمار داخل الشرج مع الالتهاب الرئوي العقدي

Summary

يتم وصف استعمار البلعوم الأنفي المورين مع الالتهاب الرئوي العقدي والاستخراج اللاحق للخلايا الملتصقة أو المجندة. تتضمن هذه التقنية مسح البلعوم الأنفي وجمع السائل من خلال nares وهي قابلة للتكيف مع قراءات مختلفة ، بما في ذلك تحديد كمية الخلايا التفاضلية وتحليل تعبير مرنا في الموقع.

Abstract

استعمار البلعوم الأنفي بواسطة المكورات العقدية الرئوية هو شرط أساسي لغزو الرئتين أو مجرى الدم¹. هذا الكائن قادر على استعمار السطح المخاطي للناسوبهارين ، حيث يمكن أن يقيم ويتكاثر ويتغلب في نهاية المطاف على الدفاعات المضيفة لغزو الأنسجة الأخرى للمضيف. يؤدي إنشاء عدوى في الجهاز التنفسي السفلي عادة إلى الالتهاب الرئوي. بدلا من ذلك ، يمكن للبكتيريا أن تنتشر في مجرى الدم مما يسبب البكتيريا ، والتي ترتبط بارتفاع معدلات الوفيات²، أو تؤدي مباشرة إلى تطور التهاب السحايا الرئوي. فهم الحركية ، والاستجابات المناعية للاستعمار البلعومي الأنفي هو جانب مهم من نماذج العدوى الالتهاب الرئوي S.

نموذج الماوس لدينا من الاستعمار داخل الجهاز العصبي مقتبس من النماذج البشرية³ وقد استخدمت من قبل مجموعات بحثية متعددة في دراسة استجابات مسببات الأمراض المضيفة في البلعوم^{الأنفي 4-7}. في الجزء الأول من النموذج ، نستخدم عزلا سريريا للالتهاب الرئوي S. لإنشاء استعمار بكتيري ذاتي الحد يشبه أحداث النقل في البالغين البشريين. الإجراء المفصل هنا ينطوي على إعداد inoculum البكتيرية، تليها إنشاء حدث الاستعمار من خلال تسليم inoculum عبر طريق داخل الجهاز الداخلي للإدارة. الضامة المقيمة هي نوع الخلية السائد في البلعوم الأنفي خلال الحالة الثابتة. عادة، هناك عدد قليل من الخلايا الليمفاوية الموجودة في الفئران غير المصابة^8،ولكن الاستعمار المخاطي سيؤدي إلى التهاب منخفض إلى عالي الجودة (اعتمادا على ضراوة الأنواع البكتيرية والإجهاد) التي من شأنها أن تؤدي إلى استجابة مناعية وتجنيد الخلايا المناعية المضيفة في وقت لاحق. يمكن عزل هذه الخلايا عن طريق مرحاض محتويات القصبة الهوائية من خلال nares ، وترتبط بكثافة البكتيريا الاستعمارية لفهم حركة العدوى بشكل أفضل.

Protocol

قبل البدء: يتم تنفيذ جميع الخطوات في خزانة السلامة البيولوجية من المستوى 2 (BSL2) من Biohazard (BSC) ما لم يذكر خلاف ذلك. يرجى التأكد من حصولك على الموافقة المناسبة على المخاطر البيولوجية لاستخدام مسببات الأمراض البكتيرية المعدية وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية قبل بدء التجارب. بالإضافة إلى ذلك، يرجى التأكد من أن لديك جميع المواد والكواشف اللازمة لإجراء الإجراء المعد مسبقا. وشملت الفئران المستخدمة في هذه التجارب الفئران C57BL/6 الإناث من مختبرات جاكسون، نهر تشارلز أو Taconic وكانت 10-14 أسابيع من العمر (على الرغم من أننا لم نجد أي اختلافات كبيرة تعتمد على نوع الجنس في الحركية لإزالة استعمار الأنف أو العدوى). تم تربية جميع الفئران المستخدمة في هذه التجارب وصيانتها في ظل ظروف خالية من مسببات الأمراض المحددة ، وكانت خالية من الفيروسات الشائعة ، (LCMV ، MNV ، MPV ، reovirus ECTV ، وغيرها) البكتيريا(مثل H. pylori)والطفيليات(مثل الدودة الدبوسية ، ectoparasites) عن طريق اختبار عينات البراز وكذلك التقييم التشريحي المتكرر للفئران الحارسة المتعايشة داخل غرف منشأتها. عند إجراء هذه التجارب، نوصي باستخدام فئران التحكم التي لا تقل أعمارها عن 10-12 أسبوعا ولا يزيد عمرها عن 6 أشهر. الفئران الأصغر سنا أو الأكبر سنا من هذه الفئة العمرية هي أكثر عرضة لفترة أطول النقل الأنفي وزيادة احتمال نشر العدوى. خلفية الماوس هو اعتبار مهم آخر قد يؤثر على نتائج تجربة الاستعمار ، حيث أثبتت عدة مجموعات أن الفئران من خلفيات وراثية مختلفة لديها قابليات مختلفة لسلالة S. pneumoniae D39 (النمط المصلي 2)^910. S. الالتهاب الرئوي ليس الممرض مورين التي تحدث بشكل طبيعي وخزانها الطبيعي الوحيد هو البلعوم الأنفي البشري. يحدث انتقال العدوى عن طريق قطرات الجهاز التنفسي ، وبما أن الفئران لا تنتج إفرازات تنفسية ، لا يمكن للفئران الفردية نقل البكتيريا إلى الفئران الأخرى ، لذلك لا يوجد قلق لانتقال الماوس إلى الماوس^11. للحصول على نظرة عامة مرئية على الإجراءات الموضحة في هذه المخطوطة، يرجى الرجوع إلى الشكل 1.

1. إعداد ثقافة الالتهاب الرئوي S.

1. تلقيح 5 مل من أجار الصويا المحاولة لنمو تعليق المكورات العقدية الالتهاب الرئوي.
2. الثقافة في ظل ظروف ثابتة في 37 درجة مئوية في 5٪ CO₂ حتى يصل inoculum البكتيرية نمو مرحلة السجل مع كثافة السائل المقابلة من 10⁸ CFU/ml كما يحددها عداد المسافات تعيين إلى 600 نانومتر. القراءة الدقيقة المقابلة لهذا CFU سوف تختلف تبعا لسلالة البكتيرية المحددة المختارة. بالنسبة لمعظم سلالات الالتهاب الرئوي S. وهذا يتوافق مع نطاق OD₆₀₀ من 0.45-0.55. عادة، سوف تنمو سلالات الالتهاب الرئوي S. في الثقافة السائلة إلى هذه الكثافة في غضون 1.5-2.5 ساعة في ظل الظروف الموصى بها، مع عدم الحاجة إلى التصنيع الفرعي. لا ينبغي السماح للثقافة أن تنمو أكثر من مرة (بعد قراءة OD من 0.75) لأن هذا يمثل النقطة التي البكتيريا لم تعد في مرحلة النمو سجل وتخضع لتحلل تلقائي واسع النطاق.
3. سيتم تلقيح كل فأر بحوالي 10⁷ بكتيريا. لذلك ، لكل 9 فئران يتم استعمارها ، ماصة 1 مل من inoculum في أنبوب Eppendorf وتدور في 15000 × غرام لمدة 1 دقيقة. يجب أن تكون بيليه بيضاء مرئية. إزالة supernatant، مع الحرص على عدم تعكير صفو بيليه وإعادة إنفاق البكتيريا في 100 ميكروغرام من الفوسفات المالحة المخزنة (PBS)، وبالتالي زيادة التركيز إلى 10⁹ CFU/ml. في هذه المرحلة ، يجب أن تظل البكتيريا قابلة للحياة ، ولكنها لن تتكرر بسهولة.
4. إذا كنت تستخدم عدة أليوت، والجمع بين أنبوب واحد للسيطرة على اختلافات طفيفة بين العينة في الكثافة البكتيرية.
5. احتفظ بالبكتيريا على الجليد حتى تصبح جاهزة للتلقيح، لمدة ساعة واحدة كحد أقصى.
6. للحصول على عدد بكتيري دقيق ، قم بإجراء سلسلة تخفيف تسلسلي من الحكمة الخشبية بدءا من inoculum البكتيرية الأنيقة. تمييع تسلسلي 10 أضعاف، مضيفا 10 ميكروغرام من إلى 90 ميكروغرام من برنامج تلفزيوني عقيمة.
7. لوحة من أصل 3 قطرات من عينات 10 ميكرولتر من التخفيفات^10-5 -^{10 -9}، بالإضافة إلى التحكم في التلوث PBS فقط ، على أقسام وصفت بشكل منفصل من أجار الصويا المحاولة (TSA) لوحة تكملها 5 ٪ من دم الأغنام(الشكل 2). تأكد من تغيير نصائح ماصة لكل خطوة تمييع من تركيز CFU أعلى إلى تركيز CFU أقل لتجنب حمل البكتيريا الزائدة وزيادة تقلب النتائج. يمكن أيضا استخدام ألواح أجار الدم البشري (HBA) بدلا من TSA. نظرا لأن العديد من سلالات الالتهاب الرئوي S. مقاومة للنيوميسين (من 5-20 ميكروغرام / مل) ، يمكن أيضا إضافة هذا المضاد الحيوي إلى وسيط أجار المفضل أثناء مرحلة إعداد اللوحة. وهذا يسهل التعداد لأنه يقضي على البكتيريا غير الكترتيز. يجب اختبار قابلية المضادات الحيوية لكل سلالة مسبقا لتحديد التركيز الأمثل للمضادات الحيوية لاستخدامها لكل سلالة بكتيرية.
8. السماح لتجف لمدة 15-30 دقيقة كشف، ثم تغطية لوحات ووضع رأسا على عقب في حاضنة البكتيرية تعيين إلى 37 درجة مئوية و 5٪ CO₂. يكبر المستعمرات البكتيرية على لوحة لمدة 24 ساعة.
9. تحديد عدد وحدات تشكيل مستعمرة وتركيزها المقابلة. استنادا إلى تحديد قيمة OD₆₀₀ ، يجب أن يكون التركيز ضمن نطاق 1-4 × 10⁹ CFU / ml. يجب أن تظهر مستعمرات الالتهاب الرئوي الصغيرة الدائرية بلون مصفر بيج ، مع منخفض صغير في المركز يعطيها مظهرا يشبه الدونات (الشكل 3).

2. مورين استعمار داخل الشرج

1. كبح جماح الفئران عن طريق وضعها في جهاز ضبط النفس الماوس (تعديل أنبوب فالكون 50 مل مع طرف قطع لخلق فتحة) تأمين لهم من قبل قاعدة الجسم مع الإبهام بحيث أنوفهم تخرج للتو من نهاية مدبب من جهاز التقييد(الشكل 4). استخدام هذا الجهاز يسمح لشل حركة رأس الفأر والفصل من nares لها بطريقة تقلل من الحركة، فضلا عن يعوق محاولات من الحيوان لmasicate طرف ماصة، مما يسمح لتسليم كامل من inoculum. بدلا من ذلك، يمكن شل حركة الفئران عن طريق الشجار في الرقبة وضبط النفس اليدوي. نحن لا نوصي بتخدير الحيوانات قبل التلقيح داخل الجهاز. إدارة inoculum للحيوانات تحت التخدير يؤدي إلى بعض من inoculum تنتشر إلى الرئتين^12,13.
2. باستخدام ماصة P10 أو P20 ، تلقيح كل فأر عن طريق إيداع 10 ميكرولتر من الثقافة المعدة ، وتوزيعها بالتساوي بين كلا nares (اسمح ل inoculum بالتنقيط في الأنف عن طريق نبض التطعيم تدريجيا ، مع أخذ الوقت للفئران لاستنشاق الإكولوم). لتحقيق التسليم الكامل لل inoculum، وقفة الإدارة في أي نقطة الماوس يبدأ في تحريك أنفه بشكل مفرط. قد لا يتم حقن inoculum كامل في nares كما الفئران قد طرد بعض من خلال الأنف أثناء الزفير; ومع ذلك ، حيث أن الكمية المطرودة تميل إلى أن تكون ضئيلة ، ويحتوي inoculum على كمية عالية للغاية من البكتيريا ، فإن هذا لا يؤثر بشكل كبير على الحمل البكتيري المستعمر. بالإضافة إلى ذلك ، فإن المساحة السطحية المتاحة للاستعمار في الغشاء المخاطي الأنفي محدودة وبالتالي وجدنا نحن وآخرون أن الجرعة الموصى بها 10⁷ كافية للحصول على مستويات ثابتة من البكتيريا في جميع الفئران ، مما يؤدي إلى الحد الأدنى من التباين في الكميات الأولية من البكتيريا المستعمرة^14،15 .
3. وزن الفئران إذا استخدام مؤشرات الوزن كجزء من رصد نقطة النهاية الخاصة بك. مراقبة الفئران كل 12-24 ساعة للأعراض السريرية، بما في ذلك الخمول والفراء المكشكش وفقدان الوزن. الفئران عادة لن تظهر أعراض المرض حتى 3-5 أيام بعد الاستعمار، وهذه سوف تسبقها فقدان الوزن الذي قد متوسط حوالي 5٪ من إجمالي وزن الجسم يوميا. كما الفئران تصبح مريضة على نحو متزايد أنها سوف تفترض المواقف حدب وتظهر انخفاض النشاط وانخفاض الاستجابة للتحفيز، بما في ذلك التعامل معها. في هذه المرحلة ، عادة ما يكون المرض مؤشرا على الإنتان و / أو الالتهاب الرئوي ومن المرجح أن يكون عضالا ، على الرغم من أنه يمكن علاج الفئران بمل واحد من المالحة تحت الجلد يوميا لتحسين النتائج. الفئران على قيد الحياة يجب أن تبدأ تظهر تحسنا بعد يوم 7 ما بعد الاستعمار، كما يتضح من تثبيت الوزن تليها زيادة الوزن، على الرغم من سلالات مختلفة من الالتهاب الرئوي S. قد تحفز المرض بسرعة أكبر ويؤدي إلى تطور الأعراض السريرية على طول خط زمني مختلف. يرجى الاطلاع على الشكل 5 للحصول على نتيجة تمثيلية للوزن الذي تم تتبعه في الفئران المستعمرة بسلالة P1547.

3. جمع عينة لافاج الأنف

قبل البداية: إعداد الإبر المعلبة باستخدام 1 مل من المحاقن المتوجة بإبر مشطوفة 26 3/8 G. قطع 2.5 سم قطعة من أنابيب البولي ايثيلين PE20 مع قطر داخلي 0.38 ملم، وضمان أن كل نهاية لديها طرف مشطوف. باستخدام ملقط، الشريحة قطعة 2.5 سم طويلة من أنابيب البولي ايثيلين PE20 (القطر الداخلي 0.38 ملم) على طرف إبرة، وتجنب ثقب الجانب أنابيب. يمكن الاحتفاظ بالإبر المعلبة في الإيثانول بنسبة 70٪ حتى الحاجة.

1. قتل الفئران التجريبية. وبما أن خلع عنق الرحم يمكن أن يضر القصبة الهوائية، يجب تجنب طريقة القتل الرحيم هذه. الطريقة المفضلة لدينا هي تخدير الأيزوفلوران متبوعا بالتخدير الزائد ، ومع ذلك ، تأكد من اتباع المبادئ التوجيهية المؤسسية عند اختيار طريقة القتل الرحيم.
2. باستخدام الإيثانول المائي بنسبة 70٪، قم بتعقيم الفراء الفائق للحيوان، وخاصة الرقبة، مع الحرص على منع الإيثانول من الوصول إلى النرجس.
3. جعل قطع طولية واحدة على طول خط الوسط من عنق الحيوان، واثنين من التخفيضات الأفقية على كلا الطرفين، وخلق فرصة لتصور القصبة الهوائية.
4. قشر بعناية الجلد مرة أخرى إلى أي من الجانبين، والكشف عن أنسجة الرقبة تحت.
5. يجب أن تكون القصبة الهوائية مرئية، وتحيط بها عضلات طولية على كلا الجانبين. قص بعناية هذه لتوفير رؤية واضحة للرغامى نفسها، مع الحرص على عدم قطع الأوعية الدموية المحيطة بها.
6. إذا تم قطع الأوعية الدموية والدم موجود، قبل المتابعة، والسماح للنزيف لوقف، ومن ثم تطهير المنطقة عدة مرات عن طريق الاستغناء عن برنامج تلفزيوني عقيم واستخدام الشاش العقيم لامتصاص الرطوبة الزائدة بلطف في المنطقة.
7. مرة واحدة يتم كشف القصبة الهوائية بشكل صحيح، وجعل عرضية، وقطع semilunar في القصبة الهوائية حوالي منتصف الطريق حتى(الشكل 6).
8. رسم 1000 ميكروغرام من برنامج تلفزيوني معقم في إبرة المعلبة المعدة مسبقا.
9. إدراج قنية في القصبة الهوائية نحو الأنف، والحفاظ على حافة مشطوف مشيرا إلى أسفل لسهولة الإدراج (الشكل 7). مرة واحدة إبرة في مكان، تدويره 180 درجة، والتحقيق بلطف صعودا حتى تشعر مقاومة الضوء.
10. مكان Eppendorf المخصصة لجمع العينات فقط تحت أنف الماوس.
11. اختبار الموضع الصحيح من إبرة عن طريق الاستغناء عن الحد الأدنى (~ 20 ميكرولتر) كمية من السائل lavage PBS - قطرة من السوائل يجب أن تشكل حول nares من الماوس; إذا كان هذا هو الحال، انتقل إلى الخطوة 3.13).
12. إذا كان اختبار برنامج تلفزيوني يخرج مباشرة من فم الحيوان، وسحب القنية مرة أخرى، وإعادة وضع مرة أخرى بلطف التحقيق إلى الأمام حتى يشعر مقاومة طفيفة جدا - الحرص على عدم دفع القنية بعيدا جدا الماضي هذه المقاومة، كما سوف تتحرك عليه الماضي الحنك الأنفي ومن خلال لتجويف الفم.
13. الاستغناء عن محتويات إبرة بسرعة للمساعدة في تشريد وجمع أقصى قدر من الخلايا - محتويات ينبغي أن تتدفق من خلال nares من الماوس وإلى أنبوب جمع. ضع العينة على الجليد مباشرة.
14. لجمع عينات لتحليل الحمض النووي الريبي، كرر الخطوات 3.8-3.13) باستخدام إبرة معلبة تحتوي على 500 ميكرولتر من مخزن تحلل الحمض النووي الريبي على نفس الفأر. وهذا سيسمح بجمع عينة التحلل من مجموعات الخلايا المتبقية، التي تتكون إلى حد كبير من الظهارة المخاطية الأنفية الأنفية، حيث كان ينبغي إزالة الخلايا غير المبشرة بعد اللافاج الأولي لبرنامج تلفزيوني. يرجى ملاحظة أن العازلة تحلل الحمض النووي الريبي سوف تنضح الظهارة وتدمير الأنسجة المحيطة بها، لذلك يجب توخي الحذر لتجنب الاتصال مع أجهزة مثل الرئتين، إذا كان الاحتفاظ بهذه الأنسجة هو المطلوب. مرة واحدة جمعها، ضع عينة في الحمض النووي الريبي تحلل العازلة مباشرة على الجليد الجاف لالتقاط تجميد. مرة واحدة في تحلل العازلة، يمكن تخزين العينات وفقا لتعليمات الشركة المصنعة، ومستقرة عادة في -70 درجة مئوية لعدة أشهر.

4. تحديد الحمل البكتيري في البلعوم الأنفي

1. البكتيريا الكمية عن طريق إعداد سلسلة تخفيف المسلسل لكل عينة المرحاض الأنف مورين. بشكل عام ، يمكن توقع أن يكون الحمل البكتيري بين 0-10⁴ CFU ، وبالتالي إجراء ثلاثة مخففات تسلسلية 10 أضعاف. إضافة 10 ميكرولتر من عينة الحمم الأنفية أنيق (100 CFU /ml) إلى الأنبوب الأول إلى تركيز^10-1 CFU/ml. دوامة جيدا.
2. تقسيم لوحة البكتريولوجية إلى أرباع، وأرباع التسمية مع كل عضو في سلسلة التخفيف (10⁰-10^-3 CFU/ml). لوحة من أصل 3 قطرات من 10 ميكرولتر عينات من 3 التخفيفات وعينة أنيق على لوحات أجار الصويا tryptic تكملها مع دم الأغنام 5٪، كما هو الحال في الشكل 2.
3. السماح لتجف لمدة 15-30 دقيقة كشف، ثم تغطية لوحات ووضع رأسا على عقب في حاضنة البكتيرية مع الظروف المثلى لنمو البكتيريا (عادة 37 درجة مئوية و 5٪ CO₂).
4. يكبر المستعمرات البكتيرية على لوحة لمدة 18-24 ساعة.
5. تحديد عدد البكتيريا المستعمرة عن طريق متوسط المستعمرات التي تشكلت على لوحة لكل تخفيف (الشكل 3). يوضح الشكل 8 الكثافة البكتيرية خلال نقاط زمنية مختلفة ، كما تحددها ثقافة المراحيض الأنفية ، في الفئران المستعمرة ب 3 سلالات مختلفة من الالتهاب الرئوي S. لمدة تصل إلى 21 يوما.

5. إعداد عينات لتدفق الخلايا

قبل البدء: إعداد مزيج من الأجسام المضادة. من أجل تحديد كمي لتجمعات الكريات البيض، نوصي بالمزيج التالي في المخففات المحددة: PE-Ly6G (استنساخ 1A8، 1 ميكروغرام/مل)، FITC-Ly6C (استنساخ AL-21,1 ميكروغرام/مل)، eFluor 450-CD45 (استنساخ 30-F11، 2.67 ميكروغرام/مل)، APC-F4/80 (استنساخ PM8 RUO، 0.67 ميكروغرام/مل)، PerCP-Cy5.5-CD11c (استنساخ N418 RUO، 0.5 ميكروغرام/مل)، PE-Cy7-CD11b (استنساخ M1/70، 0.33 ميكروغرام/مل)، أليكسا فلور 700-CD3 (استنساخ 1782، 4 ميكروغرام/مل)، eFluor 605NC-CD4 (استنساخ GK1.5، 6.67 ميكروغرام/مل). يرجى ملاحظة أن هذا المزيج هو تركيز 2x (انظر الخطوة 5.5). وينبغي تخفيف جميع الأجسام المضادة في FACs غسل العازلة (0.5٪ مصل العجل الجنيني، 2mM EDTA، 0.1٪ azide الصوديوم في برنامج تلفزيوني) والتي ينبغي أيضا أن تكون مستعدة مسبقا. في خليط من isotype مطابقة الأجسام المضادة للسيطرة، من الناحية المثالية من نفس المورد كما الأجسام المضادة المسمى وبنفس تركيزات الأجسام المضادة محددة، ينبغي أن تكون مستعدة. العينات المعالجة بالأجسام المضادة للتحكم بالنمط المتساوي ستعمل كعنصر تحكم سلبي. وينبغي اعتبار أي مضان لوحظ في العينات المعالجة بالأجسام المضادة للتحكم بالنمط المتساوي خلفية.

1. Prechill جهاز طرد مركزي قادر على الغزل 1.5 مل أنابيب Eppendorf إلى 4 درجة مئوية.
2. عينات المراحيض الأنفية الطرد المركزي في 2000 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية. ماصة بعناية من supernatant والاحتياطي. ملاحظة: نظرا لكمية صغيرة من الخلايا داخل البلعوم الأنفي، فإن بيليه الخلية لن تكون مرئية ما لم يكن هناك تلوث خلايا الدم الحمراء غير مرغوب فيه، والتي سوف مشرق الأحمر. إذا كان هذا هو مشاهدة، يجب تجاهل نموذج.
3. عينة ريسوسبند في 50 ميكرولتر من Fc؟ RIIb/CD16-2 (2.4G2) الأجسام المضادة (الذي يربط مستقبلات Fc ويقلل من ربط الأجسام المضادة غير محددة) في FACs غسل العازلة بتركيز 4 ميكروغرام / مل.
4. عينة حضانة على الجليد لمدة 30 دقيقة.
5. إضافة 50 ميكرولتر من 2x preprepared مزيج الأجسام المضادة الفلورية المركزة لعينة. خصص عينة تمثيلية من كل مجموعة تجريبية لتكون بمثابة عنصر تحكم متساوي النمط. إضافة مزيج الأجسام المضادة isotype إلى هذه العينة بدلا من مزيج وصمة عار.
6. عينة حضانة على الجليد لمدة ساعة واحدة.
7. عينات الطرد المركزي عند 2000 × غرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. تجاهل supernatant وإعادة الإنفاق في 200 ميكروغرام من برنامج تلفزيوني.
8. كرر الخطوة 5.7.
9. بعد الغسيل الثاني، عينات الطرد المركزي مرة أخرى في 2000 x ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية.
10. Resuspend في أي من برنامج تلفزيوني (إذا تشغيل العينة على الفور) أو 2٪ paraformaldehyde (إذا كان تشغيل عينات 1-3 أيام بعد تلطيخ).
11. عند إجراء قياس التدفق الخلوي جمع الحد الأقصى من الأحداث لكل عينة أو حتى تم يستنشق العينة بأكملها. في الفئران الصغيرة غير المصابة والصحية ، سيكون هذا أقل من 1000-2000 حدث إجمالي ؛ خلال حدث استعماري بكتيري، قد يزيد هذا العدد أكثر من 2 إلى 5 أضعاف اعتمادا على حالة المرض في الحيوان وعوامل مثل العمر والخلفية الوراثية. يظهر الشكل 9 نتائج قياس التدفق الخلوي التمثيلية التي تم جمعها من مقياس تدفق Becton Dickenson LSRII ثلاثي الليزر باستخدام مبعثر أمامي من 450 و Side Scatter من 300 ، على الرغم من أننا نوصي بتحسين المعلمات لمقياس التدفق الخلوي المحدد الذي تنوي استخدامه قبل جمع العينات. ملاحظة: إذا كانت العينة تحتوي على كميات ضئيلة من تلوث الدم، فإن إجمالي الأحداث التي تم جمعها سيكون أعلى بكثير مما كان متوقعا وينبغي خصم العينة من التحليل.

6. تحليل PCR الكمي (qPCR) لأجهزة غسل الأنف

1. ذوبان lysates الخلية من درجة حرارة الغرفة الخطوة 3.14.
2. اتبع البروتوكول الموصى به المقدم مع استخراج الحمض النووي الريبي المفضل للاختيار.
3. بعد الانتهاء من إجراء استخراج الحمض النووي الريبي وفقا للتعليمات، تحديد كمية الحمض النووي الريبي باستخدام مطياف أو طريقة المستندة إلى الكهربائي(الشكل 10). نحصل بشكل روتيني على ما بين 975 و 3250 نانوغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي لكل عينة بنسبة 260/280 نانومتر من 1.7 > أو رقم سلامة الحمض النووي الريبي (RIN) حول 8.1±0.13.
4. نسخ cDNA باستخدام النسخ العكسي M-MULV وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة مع 1000 نانوغرام من الحمض النووي الريبي (الحد الأقصى 13 ميكرولتر).
5. تمييع الناتجة عينات cDNA 8x، وaliquot بالتساوي في 4 أنابيب منفصلة للتخزين على المدى الطويل في -20 أو -80 درجة مئوية.
6. لقياس التعبير الجيني بواسطة qPCR، قم بإعداد 25 تفاعلات عينات ميكرولتر في ثلاثية البلورات على كتلة جليدية أو باردة تحتوي على: 12.5 ميكرولتر من مزيج qPCR الرئيسي 2x من مجموعة qPCR التي تختارها، 0.25 ميكرولتر صبغة مرجعية، 2 ميكرولتر من cDNA المخفف (الخطوة 7.5)، 1 ميكرولتر من التمهيديات المختلطة إلى الأمام والعكس (400 nM النهائي)، 9.25 ميكروغرام من المياه الحرة RNAse-DNAse. هذا البروتوكول هو التكيف من الأساليب المنشورة سابقا¹⁶.
7. بشكل عام نجد أن التضخيم qPCR خطوتين ( 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة تليها ما يصل إلى 40 دورة × [95 درجة مئوية × 15 ثانية، 60 درجة مئوية × 1 دقيقة]) فعالة (الشكل 11a)؛ ومع ذلك، يجب تحسين كل زوج التمهيدي. يجب إجراء منحنيات التفكك (الذوبان) بعد التضخيم لضمان عدم حدوث تضخيم غير محدد. التضخيم (الشكل 11ب)
8. نحن نقوم بشكل روتيني بتشغيل منحنيات قياسية لكل جين يتم تحليله بالإضافة إلى معايرة قياسية (مشتقة من تجانس الرئة أو الطحال) لكل لوحة من 96 بئرا تم تحليلها. يتم الحصول على مبالغ النسخ النسبية عن طريق تطبيع قيم عتبة الدورة الخام (Ct) أولا بواسطة الصبغة المرجعية وتحويل القيم الناتجة من خلال المنحنى القياسي المعني. ويتم بعد ذلك تطبيع هذه المبالغ النسبية إلى المعايرة القياسية وجين التدبير المنزلي، حسب الاقتضاء.

النتائج

يمثل الشكل 1 نظرة عامة تخطيطية تلخص الخطوات الرئيسية للبروتوكول. وتوفر الأرقام 2-3 تصورا للمنهجية الميكروبيولوجية الملازمة للبروتوكولات الموصوفة هنا. يمثل الشكل 4 تحديد المواقع الصحيحة للفأر لإجراء استعمار داخل الرحم، في حين يصور الشكل 5 عادة التغيرات ...

Discussion

في هذه الدراسة قدمنا أساليب مفصلة للاستعمار داخل الجهاز الداخلي للفئران باستخدام سلالة عزل سريرية من الالتهاب الرئوي العقدي والعزلة اللاحقة وتوصيف الخلايا المناعية المجندة إلى البلعوم الأنفي استجابة للبكتيريا. لقد أظهرنا كيف يمكن زراعة inoculum البكتيرية في وسائل الإعلام الغنية بالم?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-Mouse Ly6C FITC	BD Pharmingen	553104
Anti-Mouse Ly6G PE	BD Pharmingen
Anti-Mouse CD45.1 eFluor 450	eBioscience	48-0453-82
Anti-Mouse F4/80 Antigen APC	eBioscience	17-4801-82
Anti-Mouse CD11c PerCP-Cy5.5	eBioscience	45-0114-82
Anti-Mouse CD11b PE-Cy7	eBioscience	25-0112-82
Anti-Mouse CD3 Alexa Fluor 700	eBioscience	56-0032-82
Anti-Mouse CD4 eFluor 605NC	eBioscience	93-0041-42
Intramedic Polyethylene Tubing - PE20	Becton Dickinson	427406
BD 1 ml Syringe	Becton Dickinson	309659
BD 26 G 3/8 Intradermal Bevel	Becton Dickinson	305110
Buffer RLT Lysis Buffer	Qiagen	79216
Difco Tryptic Soy Agar	Becton Dickinson	236950
Defibrinated Sheep Blood	PML Microbiologicals	A0404
RNAqueous-Micro Kit	Ambion	AM1931
M-MuLV Reverse Transcriptase	New England Biolabs	M0253L
GoTaq qPCR Master Mix	Promega	A6001