Характеристика воспалительных реакций во время интраназальной колонизации стрептококковой пневмонией

Резюме

Описана колонизация муринной носоглотки со стрептококковой пневмонией и последующая экстракция адептичных или завербованных клеток. Этот метод включает в себя промывку носоглотки и сбор жидкости через nares и адаптируется для различных считываний, в том числе дифференциальной количественной оценки клеток и анализа экспрессии мРНК на месте.

Аннотация

Колонизация носоглотки стрептококковой пневмонией является необходимым условием для вторжения в легкие или кровоток¹. Этот организм способен колонизировать слизистую поверхность носоглотки, где он может находиться, размножаться и в конечном итоге преодолевать защитные силы хозяина, чтобы вторгнуться в другие ткани хозяина. Установление инфекции в обычно нижних дыхательных путях приводит к пневмонии. Кроме того, бактерии могут распространяться в кровоток, вызывая бактериемию, которая связана с^{высоким уровнем смертности 2}, или же привести непосредственно к развитию пневмококкового менингита. Понимание кинетики и иммунной реакции на колонизацию носоглотки является важным аспектом моделей инфекции S. pneumoniae.

Наша модель мыши интраназальной колонизации адаптирована из^{человеческих моделей 3} и была использована несколькими исследовательскими группами в изучении реакций хозяина-патогена в носоглотку^4-7. В первой части модели мы используем клинический изолят S. pneumoniae для создания самоограничения бактериальной колонизации, которая похожа на перевозки событий у взрослых людей. Процедура, подробно описанная в настоящем, включает в себя подготовку бактериального инокулума, а затем создание события колонизации путем доставки инокулума через интраназальный маршрут введения. Резидентные макрофаги являются преобладающим типом клеток в носоглотки во время устойчивого состояния. Как правило, Есть несколько лимфоцитов, присутствующих в неинфицированных^{мышей 8}, однако слизистой колонизации приведет к низкой до высококачественной воспаления (в зависимости от вирулентности бактериальных видов и штаммов), что приведет к иммунной реакции и последующего набора иммунных клеток хозяина. Эти клетки могут быть изолированы от лаваж содержимого трахеи через nares, и коррелирует с плотностью бактерий колонизации, чтобы лучше понять кинетику инфекции.

протокол

Прежде чем начать: все шаги сделаны в Biohazard Уровень 2 (BSL2) Биологическая безопасность кабинета (BSC), если не указано иное. Пожалуйста, убедитесь, что вы получили соответствующее разрешение Biohazard для использования инфекционных бактериальных патогенов в соответствии с институциональными руководящими принципами до начала экспериментов. Кроме того, убедитесь, что у вас есть все материалы и реагенты, необходимые для проведения процедуры, подготовленной заранее. Мыши, используемые в этих экспериментах, включали самок мышей C57BL/6 из Лабораторий Джексона, Чарльз Ривер или Таконик и были в возрасте 10-14 недель (хотя мы не обнаружили каких-либо гендерно-зависимых значительных различий в кинетике зазора колонизации носа или инфекции). Все мыши, используемые в этих экспериментах, были выведены и поддерживались в условиях, свободных от конкретных патогенов, и были свободны от распространенных вирусов, (LCMV, MNV, MPV, реовирус ECTV и других) бактерий (например,H. pylori) и паразитов (например, остриц, эктопаразиты) путем тестирования фекальных образцов, а также частой анатомической оценки При проведении этих экспериментов мы рекомендуем использовать контрольных мышей не моложе 10-12 недель и не старше 6 месяцев. Мыши моложе или старше этого возрастного диапазона более восприимчивы к более длительной продолжительности перевозки носоглотки и повышенной вероятности распространения инфекции. Мышь фон является еще одним важным фактором, который может повлиять на результаты эксперимента колонизации, как несколько групп показали, что мыши разного генетического происхождения имеют различные восприимчивости к S. pneumoniae D39 (серотип 2)^{штамм 9,10}. S. Pneumoniae не является естественным патогеном мурина и его единственным естественным резервуаром является носоглотка человека. Передача происходит через дыхательные капли, и, как мыши не производят дыхательных секреций, отдельные мыши не могут передавать бактерии другим мышам, так что нет никакой озабоченности для мыши к мыши^{передачи 11}. Для визуального обзора процедур, описанных в этой рукописи, пожалуйста, обратитесь к рисунку 1.

1. Подготовка культуры С. пневмонии

1. Прививка 5 мл триптического соевого агара для подвесного роста стрептококковой пневмонии.
2. Культура в статических условиях при 37 градусов по Цельсию в 5% CO_{2 до} тех пор, пока бактериальный инокулум не достигнет фазового роста журнала с соответствующей плотностью жидкости 10⁸ CFU/ml, определяемой одометром, установленным до 600 нм. Точное чтение, соответствующее этому CFU будет отличаться в зависимости от конкретного выбранного бактериального штамма; для большинства штаммов S. pneumoniae это соответствует диапазону OD₆₀₀ 0,45-0,55. Как правило, штаммы S. pneumoniae в жидкой культуре вырастут до такой плотности в пределах 1,5-2,5 часа при рекомендуемых условиях, без необходимости подкачения. Культура не должна быть позволена overgrow (за чтением OD 0.75) по мере того как это представляет пункт на котором бактерии no longer в росте фазы журнала и проходят обширный autolysis.
3. Каждая мышь будет привита примерно 10^{7 бактериями.} Таким образом, для каждых 9 мышей, которые будут колонизированы, пипетка 1 мл инокулума в трубку Эппендорф и спина на 15000 х г в течение 1 мин. Беловатые гранулы должны быть видны. Удалите супернатант, будучи осторожным, чтобы не беспокоить гранулы и повторно использовать бактерии в 100 мкл фосфата буферного солевого раствора (PBS), тем самым увеличивая концентрацию до 10⁹ CFU/ml. На данном этапе бактерии должны оставаться жизнеспособными, но не будут легко размножаться.
4. При использовании нескольких aliquots, объединить в одну трубку для контроля для небольших меж образец изменения в бактериальной плотности.
5. Держите бактерии на льду до готовности к прививке, максимум 1 час.
6. Для получения точного бактериального подсчета, выполните журнал-мудрый серийный разбавления серии, начиная с аккуратным бактериальной инокулы. Разбавить последовательно 10 раз, добавив 10 мкл до 90 мл стерильных PBS.
7. Плита из 3 капель 10 йл образцов разбавления 10^-5 - 10^-9, плюс PBS только контроль загрязнения, на отдельно помечены разделы триптического соевого агара (TSA) пластины дополнены 5% крови овец (Рисунок 2). Убедитесь, что пипетки советы меняются для каждого шага разбавления от более высокой концентрации CFU к более низкой концентрации CFU, чтобы избежать переноски избыточных бактерий и повышение изменчивости результатов. Пластины агара крови человека (HBA) также могут быть использованы вместо TSA. Поскольку многие штаммы S. pneumoniae устойчивы к неомицину (от 5-20 мкг/мл), этот антибиотик также может быть добавлен в агарную среду выбора во время фазы подготовки пластины. Это облегчает перечисление, поскольку он устраняет несуществующих бактерий. Чувствительность к антибиотикам каждого штамма должна быть проверена заранее, чтобы определить оптимальную концентрацию антибиотиков для использования для каждого бактериального штамма.
8. Дайте высохнуть в течение 15-30 мин обнаружили, затем покрыть пластины и поместить вверх дном в бактериальный инкубатор установлен на 37 градусов по Цельсию и 5% CO₂. Выращиваем бактериальные колонии на тарелке 24 часа.
9. Определить количество колоний, образующих единицы, и их соответствующую концентрацию. Основываясь на определениях значения OD_600, концентрация должна быть в пределах 1-4 х 10⁹ CFU/ml. S. Пневмония колоний должна появиться как небольшие, круговые колонии желтовато-бежевого цвета, с небольшой депрессией в центре давая им пончик, как внешний вид (Рисунок 3).

2. Мурин интраназальная колонизация

1. Сдерживайте мышей, помещая их в аппарат мизера мыши (модифицированная трубка Сокола 50 мл с кончиком отрезаны для создания диафрагмы) обеспечение их основанием их тела с большим пальцем, так что их носы просто выйти из конической конце аппарата удержатель (Рисунок 4). Использование этого аппарата позволяет иммобилизации головы мыши и сегрегации его nares таким образом, что сводит к минимуму движение, а также препятствует попыткам животного, чтобы мастикулировать кончик пипетки, что позволяет для полной доставки инокулума. Кроме того, мыши могут быть обездвижены через потертости на шее и ручной сдержанности. Мы не рекомендуем анестезию животных до интраназальной прививки. Администрация инокулума животным под наркозом приводит к некоторым из инокулума распространяется на легкие^12,13.
2. Используя P10 или P20 pipette, привить каждую мышь, относя 10 мкл подготовленной культуры, равномерно распределяя ее между обоими нарами (позвольте инокулуму капать в нос, постепенно пульсав прививку, постепенно набирая время для мышей вдыхать инокулум). Для достижения полной доставки инокулума, приостановить администрирование в любой момент мышь начинает двигать носом чрезмерно. Весь инокулум не может быть введен в nares, как мыши могут изгнать некоторые через нос во время выдоха; однако, как изгнанное количество, как правило, мизерные, и инокулум содержит чрезвычайно большое количество бактерий, это не существенно влияет на колонизации бактериальной нагрузки. Кроме того, площадь поверхности, доступной для колонизации слизистой оболочки носоглотки ограничена и, следовательно, мы и другие обнаружили, что рекомендуемая 10^{7 доза достаточна для} получения последовательного уровня бактерий у всех мышей, в результате чего минимальная изменчивость в начальных количествах^{колонизации бактерий 14,15} .
3. Взвешивайте мышей при использовании индикаторов веса в рамках мониторинга конечных тоок. Мониторинг мышей каждые 12-24 часа для клинических симптомов, в том числе вялость, взъерошенный мех и потеря веса. Мыши, как правило, не показывают симптомы болезни до 3-5 дней после колонизации, и они будут предшествовать потере веса, которые могут в среднем около 5% от общей массы тела в день. По мере того как мыши будут все больше и больше более больными они притязают hunched позы и показывают уменьшенную деятельность и уменьшенную отзывчивость к стимуляции, включая регулировать. На данном этапе болезнь, как правило, свидетельствует о сепсисе и/или пневмонии и, вероятно, будет неизлечимой, хотя мышей можно лечить 1 мл подкожного солевого раствора ежедневно для улучшения результатов. Выжившие мыши должны начать показывать улучшение после 7-го дня после колонизации, о чем свидетельствует стабилизация веса с последующим увеличением веса, хотя различные штаммы S. pneumoniae могут вызвать болезнь быстрее и привести к прогрессированию клинических симптомов по другой линии времени. Пожалуйста, смотрите рисунок 5 для репрезентативного результата веса, отслеживаемого у мышей, колонизированных штаммом P1547.

3. Коллекция образцов носовой лавы

Перед началом: подготовить канюли иглы с использованием 1 мл шприцев ограничен 26 3/8 G скошенные иглы. Вырезать 2,5 см кусочки ПОЛИЭТИЛЕНа PE20 трубки с внутренним диаметром 0,38 мм, гарантируя, что каждый конец имеет скошенный кончик. Используя типсы, сдвиньте 2,5 см длинного куска полиэтиленовой трубки PE20 (внутренний диаметр 0,38 мм) на кончик иглы, избегая прокола трубной стороны. Каннюлированные иглы можно хранить в 70% этанола до необходимости.

1. Евтанизировать экспериментальных мышей. Поскольку вывих шейки матки потенциально может повредить трахею, этого метода эвтаназии следует избегать. Наш предпочтительный метод является изофлюран анестезии следуют exsanguination, однако, убедитесь, что вы будете следовать институциональным руководящим принципам при выборе способа эвтаназии.
2. Используя 70% аквозного этанола, стерилизовать супероантерий меха животного, особенно шеи, заботясь, чтобы предотвратить этанол от доступа к nares.
3. Сделайте один продольный разрез вдоль средней линии шеи животного, и два горизонтальных разреза на обоих концах, создавая отверстие, чтобы представить себе трахею.
4. Тщательно очистить кожу спины в обе стороны, выявление шеи ткани под.
5. Трахея должна быть видна, окружена продольными мышцами с обеих сторон. Тщательно отрежьте их, чтобы обеспечить четкое представление о самой трахее, заботясь о том, чтобы не разорвать окружающую сосуды.
6. Если сосуды были сокращены и кровь присутствует, до начала, позволяют кровотечения, чтобы остановить, а затем очистить область несколько раз, распределяя стерильные PBS и с помощью стерильной марли, чтобы мягко впитывать избыток влаги в этом районе.
7. После того, как трахея должным образом подвергается, сделать поперечный, полулунар вырезать в трахее около половины пути вверх (Рисунок 6).
8. Нарисуйте 1000 мкл стерилизованного PBS в ранее подготовленную иглу с каннулированной иглой.
9. Вставьте канюлю в трахею к носу, сохраняя скошенный край, указывающий вниз для удобства вставки (Рисунок 7). После того, как игла на месте, поверните его на 180 ", и осторожно зонд вверх, пока вы не почувствуете светоустойчивость.
10. Место Eppendorf предназначен для сбора образцов прямо под носом мыши.
11. Проверьте правильное размещение иглы, выделив минимальное (20 мкл) количество жидкости PBS лаваж - капля жидкости должна образовываться вокруг нары мыши; если это так, переходите к шагу 3.13).
12. Если тест PBS возникает непосредственно из уст животного, тянуть канюлю назад, и перепозиционировать снова осторожно зондирования вперед, пока очень небольшое сопротивление ощущается - заботиться, чтобы не толкать канюлю слишком далеко мимо этого сопротивления, как вы будете двигаться мимо носового неба и до полости рта.
13. Быстро распределять содержимое иглы, чтобы помочь вытеснить и собрать максимальное количество клеток - содержимое должно вытекать через нары мыши и в коллекторную трубку. Поместите образец сразу на лед.
14. Для сбора образцов для анализа РНК повторите шаги 3.8-3.13) с помощью каннулированной иглы, содержащей 500 мкл буфера РНК-лиза на одной мыши. Это позволит получить лиссат образца из оставшихся популяций клеток, в основном состоит из носоглотки слизистой эпителия, как неадъеренные клетки должны были быть удалены после первоначального PBS лаваж. Пожалуйста, обратите внимание, что буфер РНК-лиза будет денудеть эпителий и уничтожить окружающие ткани, поэтому необходимо позаботиться, чтобы избежать контакта с органами, такими как легкие, если удержание этих тканей желательно. После сбора, поместите образец в буфере РНК-лиза непосредственно на сухой лед, чтобы заморозить. Оказавшись в буфере лиза, образцы могут храниться в соответствии с инструкциями производителя и стабильны, как правило, при -70 градусах Цельсия в течение нескольких месяцев.

4. Определение бактериальной нагрузки в носоглотку

1. Квантитатные бактерии, подготовив серийную серию разбавления для каждого образца промывки носа. В целом, бактериальная нагрузка может быть между 0-10⁴ CFU, поэтому провести три 10-кратное последовательное разбавления. Добавьте 10 мкл аккуратного образца носовой лавы (100 CFU/ml) к первой трубке с концентрацией 10^-1 CFU/ml. Vortex тщательно.
2. Разделите бактериологическую пластину на квадранты и наклеите квадранты каждый с членом серии разбавления (10⁰-10^-3 CFU/ml). Плита из 3 капель 10 образцов 3 разбавления и аккуратный образец на триптических сое агар пластин, дополненных 5% крови овец, как на рисунке 2.
3. Дайте высохнуть в течение 15-30 мин обнаружили, затем покрыть пластины и поместить вверх дном в бактериальный инкубатор с оптимальными условиями для роста бактерий (обычно 37 кк и 5% CO₂).
4. Выращиваем бактериальные колонии на тарелке по 18-24 часа.
5. Определите количество колонизировавных бактерий путем усреднения колоний, образованных на тарелке для каждого разбавления(рисунок 3). Рисунок 8 демонстрирует бактериальную плотность в разные моменты времени, определяемую культурой носовых лав, у мышей, колонизированных с 3 различными штаммами S. pneumoniae на срок до 21 дня.

5. Подготовка образцов для цитометрии потока

Перед началом: Подготовка смеси антител. Для количественной оценки популяций лейкоцитов мы рекомендуем следующую смесь при указанных разбавлениях: PE-Ly6G (клон 1A8, 1 мкг/мл), FITC-Ly6C (клон AL-21,1 мкг/мл), eFluor 450-CD45 (клон 30-F11, 2,67 мкг/мл), БТР-Ф4/80 (клон PM8 RUO, 0,67 мкг/мл), PerCP-Cy5.5-CD11c (клон N418 RUO, 0,5 мкг/мл), PE-Cy7-CD11b (клон M1/70, 0,33 мкг/мл), Alexa Fluor 700-CD3 (клон 1782, 4 мкг/мл), eFluor 605NC-CD4 (клон GK1.5, 6.67 мкг/мл). Обратите внимание, что эта смесь в 2x концентрация (см. шаг 5.5). Все антитела должны быть разбавлены в буфере FACs Wash (0,5% сыворотки теленка плода, 2mM EDTA, 0,1% азида натрия в PBS), который также должен быть подготовлен заранее. В смеси изотипа должны быть подготовлены контрольные антитела, в идеале от того же поставщика, что и помеченные антитела и в тех же концентрациях, что и специфические антитела. Образцы, обработанные антителами контроля изотипа, будут функционировать как отрицательный контроль. Любая флуоресценция, наблюдаемая в образцах, обработанных антителами для контроля изотипа, должна рассматриваться в фоновом режиме.

1. Prechill центрифуга способна вращать 1,5 мл труб Эппендорф до 4 градусов по Цельсию.
2. Образцы носовой лавы центрифуги при 2000 х г в течение 10 мин при 4 градусах Цельсия. Тщательно пипетка из супернатантных и резерва. Примечание: из-за небольшого количества клеток в носоглотки, клеточные гранулы не будут видны, если есть нежелательное загрязнение красных кровяных телец, которые будут ярко-красный. Если это видно, образец должен быть отброшен.
3. Повторное открытие образца в 50 мкл Fc? RIIb/CD16-2 (2.4G2) антитела (который связывает рецепторы Fc и уменьшает неспецифические антитела связывания) в FACs Мыть буфер в концентрации 4 мкг /мл.
4. Инкубационный образец на льду в течение 30 мин.
5. Добавьте в образец 50 мкл предварительной концентрированной смеси флуоресцентных антител 2x. Отложите репрезентативную выборку из каждой экспериментальной группы, чтобы выступать в качестве контроля изотипа. Добавьте смесь изотипных антител в этот образец вместо смеси пятен.
6. Инкубационный образец на льду в течение 1 часа.
7. Образцы центрифуги при 2000 х г в течение 10 мин при 4 градусах Цельсия. Откажитесь от супернатанта и хессенд в 200 мкл PBS.
8. Повторите шаг 5.7.
9. После второй стирки, образцы центрифуги снова при 2000 х г в течение 10 мин при 4 градусов по Цельсию.
10. Resuspend в любом в PBS (если работает образец немедленно) или 2% параформальдегид (если работает образцов 1-3 дней после окрашивания).
11. При проведении цитометрии потока собирают максимальное количество событий на образец или до тех пор, пока весь образец не будет аспирирован. У неинфицированных, здоровых, молодых мышей, это будет всего 1000-2000 общих событий; Во время бактериальной колонизации событие, это число может увеличиться более чем в 2-5 раз зависит от состояния болезни у животных и таких факторов, как возраст и генетический фон. На рисунке 9 показаны репрезентативные результаты цитометрии потока, собранные с 3-лазерного цитометра потока Becton Dickenson LSRII с использованием цитометра Forward Scatter 450 и Side Scatter 300, хотя мы рекомендуем оптимизировать параметры для конкретного цитометра потока, который вы собираетесь использовать до сбора образцов. Примечание: если образец содержит даже следы количества загрязнения крови, общее количество собранных событий будет значительно выше, чем ожидалось, и образец должен быть дисконтирован от анализа.

6. Количественный ПЦР (qPCR) Анализ носовых лаважей

1. Оттепельная клетка лизирует от шага 3.14 комнатной температуры.
2. Следуйте рекомендуемому протоколу, предоставленную предпочтительной добычей РНК по выбору.
3. После завершения процедуры извлечения РНК в соответствии с инструкциями, количественно количество РНК с помощью спектрофотометра или электрофорез на основе метода(рисунок 10). Мы регулярно получаем от 975 до 3250 нг общей РНК на выборку с соотношением 260/280 нм >1,7 или РНК целостности числа (RIN) вокруг, 8,1±0,13.
4. Транскрибировать cDNA с помощью M-MULV Обратная транскриптаза в соответствии с протоколом производителя с 1000 нг РНК (максимум 13 мкл).
5. Разбавить полученные образцы cDNA 8x, и aliquot поровну в 4 отдельно пробки для долгосрочного хранения на -20 или -80 C.
6. Для измерения экспрессии генов по qPCR подготовьте 25 образцов реакций в тройном на льду или холодной глыме, содержащей: 12,5 мл 2x qPCR мастер смеси из комплекта qPCR по вашему выбору, 0,25 мкл эталонного красителя, 2 мкл разбавленной кДНК (шаг 7,5), 1 мл смешанных вперед и обратной грунтовки (400 нм финала), 9,25 мкл свободной воды РНАСЕ-ДНК. Этот протокол представляет 16 методов, опубликованных^ранее.
7. В целом мы находим, что двухшаговое усиление qPCR (95 градусов по Цельсию в течение 10 минут с последующим до 40 циклов х 95 градусов по Цельсию х 15 сек, 60 градусов по Цельсию х 1 мин)) является эффективным(рисунок 11a); однако, каждая грунтовка пара должна быть оптимизирована. Диссоциация (плавление) кривых должна выполняться после усиления, чтобы не было никакого неспецифического усиления. усиление(рисунок 11b)
8. Мы регулярно запускаем стандартные кривые для каждого анализируемого гена, а также стандартный калибровочные (производные от однородного ткани легких или селезенки) для каждой анализируемой пластины на 96 колодец. Относительные объемы транскрипции получены путем первой нормализации значений порога сырьевого цикла (Ct) эталонным красителем и преобразования полученных значений через соответствующие стандартные кривые. Эти относительные количества впоследствии нормализуются до стандартного калибратора и гена домашнего хозяйства, если это применимо.

Результаты

Рисунок 1 представляет собой схему обзора, обобщающая основные этапы протокола. Цифры 2-3 обеспечивают визуализацию микробиологической методологии, присущей описанным в ней протоколам. Рисунок 4 представляет собой правильное позиционирование мыши для выпол?...

Обсуждение

В этом исследовании мы представили подробные методы интраназальной колонизации мышей с использованием клинического изолятного штамма стрептококковой пневмонии и последующей изоляции и характеристики иммунных клеток, набранных в носоглотку в ответ на бактерии. Мы продемонстри?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-Mouse Ly6C FITC	BD Pharmingen	553104
Anti-Mouse Ly6G PE	BD Pharmingen
Anti-Mouse CD45.1 eFluor 450	eBioscience	48-0453-82
Anti-Mouse F4/80 Antigen APC	eBioscience	17-4801-82
Anti-Mouse CD11c PerCP-Cy5.5	eBioscience	45-0114-82
Anti-Mouse CD11b PE-Cy7	eBioscience	25-0112-82
Anti-Mouse CD3 Alexa Fluor 700	eBioscience	56-0032-82
Anti-Mouse CD4 eFluor 605NC	eBioscience	93-0041-42
Intramedic Polyethylene Tubing - PE20	Becton Dickinson	427406
BD 1 ml Syringe	Becton Dickinson	309659
BD 26 G 3/8 Intradermal Bevel	Becton Dickinson	305110
Buffer RLT Lysis Buffer	Qiagen	79216
Difco Tryptic Soy Agar	Becton Dickinson	236950
Defibrinated Sheep Blood	PML Microbiologicals	A0404
RNAqueous-Micro Kit	Ambion	AM1931
M-MuLV Reverse Transcriptase	New England Biolabs	M0253L
GoTaq qPCR Master Mix	Promega	A6001