אפיון של תגובות דלקתיות במהלך קולוניזציה תוך-אפית עם דלקת ריאות סטרפטוקוקוס

Summary

קולוניזציה של nasopharynx מורין עם דלקת ריאות סטרפטוקוקוס ואת החילוץ הבא של תאים חסידיים או מגויסים מתואר. טכניקה זו כרוכה בשטיפת nasopharynx ואיסוף של הנוזל דרך nares והוא מסתגל לקריאות שונות, כולל כימות תאים דיפרנציאלי וניתוח של ביטוי mRNA באתרו.

Abstract

קולוניזציה Nasopharyngeal על ידי דלקת ריאות סטרפטוקוקוס הוא תנאי מוקדם לפלישה לריאות או למחזור הדם¹. אורגניזם זה מסוגל ליישב את פני השטח הריריים של האף, שם הוא יכול להתגורר, להתרבות ובסופו של דבר להתגבר על הגנות מארח לפלוש לרקמות אחרות של המארח. הקמת זיהום בדרכי הנשימה התחתונות בדרך כלל גורמת לדלקת ריאות. לחלופין, החיידקים יכולים להפיץ למחזור הדם גרימת bacteraemia, אשר קשורה שיעורי תמותה גבוהים², או אחר להוביל ישירות להתפתחות של דלקת קרום המוח פנאומוקוקית. הבנת הקינטיקה של, ותגובות חיסוניות, קולוניזציה האף הוא היבט חשוב של S. מודלים זיהום דלקת ריאות.

מודל העכבר שלנו של קולוניזציה תוך-אפית מותאם ממודלים אנושיים³ ומשמש קבוצות מחקר מרובות במחקר של תגובות מארח-פתוגן ב nasopharynx^4-7. בחלק הראשון של המודל, אנו משתמשים בבידוד קליני של דלקת ריאות S. כדי להקים קולוניזציה חיידקית המגבילה את עצמה הדומה לאירועי כרכרה אצל מבוגרים אנושיים. ההליך המפורט בזאת כרוך בהכנת אינוקולום חיידקי, ואחריו הקמת אירוע קולוניזציה באמצעות מסירת האינוקולום באמצעות מסלול פנימי של הממשל. מקרופאגים מקומיים הם סוג התא השולט ב nasopharynx במהלך המצב היציב. בדרך כלל, יש מעט לימפוציטים נוכחים בעכברים לא מושפעים⁸, אולם קולוניזציה הרירית תוביל לדלקת בדרגה נמוכה עד גבוהה (בהתאם לארסיות של מיני החיידקים והזן) שתביא לתגובה חיסונית ולגיוס הבא של תאי חיסון מארחים. תאים אלה יכולים להיות מבודדים על ידי שטיפת תכולת קנה הנשימה דרך nares, בקורלציה לצפיפות של חיידקי קולוניזציה כדי להבין טוב יותר את הקינטיקה של הזיהום.

Protocol

לפני שתתחיל: כל השלבים נעשים בקבינט בטיחות ביולוגית ברמה Biohazard רמה 2 (BSL2) (BSC) אלא אם צוין אחרת. אנא ודא כי קיבלת את האישור Biohazard המתאים לשימוש של פתוגנים חיידקיים זיהומיות לפי הנחיות מוסדיות לפני תחילת הניסויים. בנוסף, אנא ודא כי יש לך את כל החומרים והריאגנטים הדרושים כדי לנהל את ההליך שהוכן מראש. עכברים המשמשים בניסויים אלה כללו עכברי C57BL/6 נקבות ממעבדות ג'קסון, צ'ארלס ריבר או טאקוניק והיו בני 10-14 שבועות (אם כי לא מצאנו הבדלים משמעותיים תלויי מגדר בקינטיקה של סיווג קולוניזציה באף או זיהום). כל העכברים ששימשו בניסויים אלה היו bred ומתוחזק בתנאים ספציפיים-פתוגן חינם, והיו חופשיים של וירוסים נפוצים, (LCMV, MNV, MPV, reovirus ECTV, ועוד) חיידקים(למשל H. pylori)וטפילים(למשל תולעי סיכה, ectoparasites) על ידי בדיקות מדגם צואה, כמו גם הערכה אנטומית תכופה של עכברי זקיף cohoused בתוך חדרי המתקן שלהם. בעת ביצוע ניסויים אלה, אנו ממליצים להשתמש בעכברי בקרה שגילם אינו עולה על 10-12 שבועות ולא מעל גיל 6 חודשים. עכברים צעירים או מבוגרים מטווח גילאים זה רגישים יותר למשך ארוך יותר של הובלת האף והסיכוי המוגבר להפצת זיהום. רקע העכבר הוא שיקול חשוב נוסף שעשוי להשפיע על התוצאות של ניסוי קולוניזציה, כמו מספר קבוצות הוכיחו כי עכברים מרקעים גנטיים שונים יש רגישויות שונות S. דלקת ריאות D39 (סרוטיפ 2)^{זן 9,10}. S. דלקת ריאות אינה פתוגן מורין המתרחשים באופן טבעי והמאגר הטבעי היחיד שלה הוא nasopharynx האנושי. התמסורת מתרחשת באמצעות טיפות נשימה, וכיוון שעכברים אינם מייצרים הפרשות נשימה, עכברים בודדים אינם יכולים להעביר את החיידק לעכברים אחרים, ולכן אין חשש להעברת עכבר-לעכבר¹¹. לסקירה חזותית של ההליכים המתוארים בכתב יד זה, עיין באיור 1.

1. הכנת תרבות דלקת ריאות S.

1. לחסן 5 מ"ל של אגר סויה טריפטי לצמיחה ההשעיה של דלקת ריאות סטרפטוקוקוס.
2. תרבות בתנאים סטטיים ב 37 °C ב 5% CO₂ עד inoculum חיידקי מגיע צמיחת שלב יומן עם צפיפות נוזלית מקבילה של 10⁸ CFU / מיליליטר כפי שנקבע על ידי מד מרחק מוגדר 600 ננומטר. הקריאה המדויקת המתאימה ל- CFU זה תשתנה בהתאם לזן החיידקי הנבחר הספציפי; עבור רוב הזנים של S. דלקת ריאות זה מתאים לטווח OD₆₀₀ של 0.45-0.55. בדרך כלל, S. זני דלקת ריאות בתרבות נוזלית יגדלו לצפיפות זו בתוך 1.5-2.5 שעות בתנאים המומלצים, ללא צורך subculturing. אין לאפשר לתרבות לגדול יתר על המידה (מעבר לקריאת OD של 0.75) שכן הדבר מייצג את הנקודה שבה החיידקים כבר לא נמצאים בצמיחה בשלב יומן ועוברים אוטוליזה נרחבת.
3. כל עכבר יהיה מחוסן עם כ 10^{7 חיידקים.} לכן, עבור כל 9 עכברים להתיישב, פיפטה 1 מ"ל של אינוקולום לתוך צינור Eppendorf ולהסתובב ב 15,000 x g במשך 1 דקות. גלולה לבנבן צריך להיות גלוי. הסר את supernatant, נזהר לא להפריע גלולה ו resuspend החיידקים ב 100 μl של מלוחים אגירה פוספט (PBS), ובכך להגדיל את הריכוז ל 10⁹ CFU / מיליליטר. בשלב זה, החיידקים צריכים להישאר קיימא, אבל לא בקלות לשכפל.
4. אם אתם משתמשים ב aliquots מרובים, לשלב לתוך צינור אחד כדי לשלוט על וריאציות בין מדגם קל בצפיפות חיידקית.
5. שמור חיידקים על הקרח עד מוכן לחיסון, לכל היותר 1 שעה.
6. כדי להשיג ספירת חיידקים מדויקת, בצע סדרת דילול סדרתית מבחינת יומן החל באינוקולום חיידקי מסודר. לדלל באופן סדרתי 10-פי, הוספת 10 μl של עד 90 μl של PBS סטרילי.
7. צלחת החוצה 3 טיפות של 10 μl דגימות של דילול 10^-5 - 10^-9, בתוספת בקרת זיהום PBS בלבד, על קטעים מסומנים בנפרד של צלחת אגר סויה טריפטי (TSA) בתוספת 5% דם כבשים (איור 2). ודא כי טיפים פיפטה משתנים עבור כל שלב דילול מריכוז CFU גבוה יותר לריכוז CFU נמוך יותר, כדי למנוע נשיאת חיידקים עודפים והגברת השונות של תוצאות. צלחות אגר דם אנושי (HBA) ניתן להשתמש גם במקום TSA. מאז זנים רבים של S. דלקת ריאות עמידים neomycin (מ 5-20 מיקרוגרם / מיליליטר), אנטיביוטיקה זו עשויה להתווסף גם למדיום אגר של בחירה במהלך שלב הכנת הצלחת. זה מקל על הספירה כפי שהוא מבטל חיידקים שאינם נוגדי עניין. הרגישות לאנטיביוטיקה של כל זן חייבת להיבדק מראש כדי לקבוע את הריכוז האופטימלי של אנטיביוטיקה לשימוש עבור כל זן חיידקי.
8. אפשר להתייבש במשך 15-30 דקות חשופות, ולאחר מכן לכסות צלחות ומניחים במהופך באינקובטור חיידקי להגדיר 37 °C (70 °F) ו 5% CO₂. לגדל מושבות חיידקים על צלחת במשך 24 שעות.
9. לקבוע את מספר יחידות יוצרות המושבה ואת הריכוז המתאים להן. בהתבסס על קביעות של ערך OD_600, הריכוז צריך להיות בטווח של 1-4 x 10⁹ CFU /ml. מושבות דלקת ריאות S. צריך להופיע כמו מושבות קטנות, מעגליות בצבע צהבהב בז ', עם דיכאון קטן במרכז נותן להם מראה דמוי סופגנייה (איור 3).

2. קולוניזציה תוך-אפית של מורין

1. רסנו עכברים על ידי הצבתם במנגנון מרסן עכברים (צינור פלקון שונה של 50 מ"ל עם קצה חתוך כדי ליצור פתח) המאבטח אותם בבסיס גופם באגודל, כך שהאף שלהם פשוט יוצא מקצה מחודד של מנגנון המרסן (איור 4). השימוש במנגנון זה מאפשר שיתוק של ראש העכבר והפרדה של nares שלה באופן שממזער את התנועה, כמו גם מעכב ניסיונות מן החיה כדי לשעשע את קצה פיפטה, המאפשר מסירה מלאה של inoculum. לחלופין, עכברים יכולים להיות משותקים באמצעות שפשוף בצוואר וריסון ידני. איננו ממליצים על הרדמה של בעלי החיים לפני חיסון תוך-אנלתי. ניהול האינוקולום לבעלי חיים תחת הרדמה גורם לחלק מהאינוקולום להתפשט לריאות^12,13.
2. באמצעות P10 או P20 פיפטה, לחסן כל עכבר על ידי הפקדת 10 μl של התרבות המוכנה, להפיץ אותו באופן שווה בין שני nares (לאפשר אינוקולום לטפטף לתוך האף על ידי פועם החיסון בהדרגה, לוקח זמן לעכברים לשאוף inoculum). כדי להשיג מסירה מלאה של אינוקולום, להשהות את הממשל בכל נקודה העכבר מתחיל להזיז את אפו יתר על המידה. האינוקולום כולו לא יכול להיות מוזרק לתוך nares כמו העכברים עלולים לגרש כמה דרך האף במהלך הנשיפה; עם זאת, כמו הסכום מגורש נוטה להיות זעיר, ואת inoculum מכיל כמות גבוהה מאוד של חיידקים, זה לא משפיע באופן משמעותי על עומס חיידקי קולוניזציה. בנוסף, שטח הפנים הזמין עבור קולוניזציה ברירית האף הוא מוגבל וכתוצאה מכך אנחנו ואחרים מצאנו כי המינון המומלץ 10 7 מספיק כדי להשיג רמות עקביות של^{חיידקים} בכל העכברים, וכתוצאה מכך שונות מינימלית בכמויות הראשוניות של חיידקים קולוניזציה^14,15 .
3. לשקול עכברים אם ניצול אינדיקטורים משקל כחלק ניטור נקודת הקצה שלך. לפקח על עכברים כל 12-24 שעות עבור תסמינים קליניים, כולל עייפות, פרווה פרועה וירידה במשקל. עכברים בדרך כלל לא יראו סימפטומים של מחלה עד 3-5 ימים לאחר הקולוניזציה, ואלה יהיו קדמו ירידה במשקל אשר עשוי ממוצע סביב 5% ממשקל הגוף הכולל ביום. ככל שהעכברים נעשים חולים יותר ויותר הם יניחו תנוחות רכון ויציגו ירידה בפעילות וירידה בהיענות לגירוי, כולל טיפול. בשלב זה, מחלה היא בדרך כלל מעידה על אלח דם ו / או דלקת ריאות וסביר להניח להיות סופני, אם כי עכברים עשויים להיות מטופלים עם 1 מ"ל של מלוחים תת עוריים מדי יום כדי לשפר את התוצאות. עכברים ששרדו צריכים להתחיל להראות שיפור לאחר יום 7 לאחר הקולוניזציה, כפי שמעיד ייצוב המשקל ואחריו עלייה במשקל, אם כי זנים שונים של S. דלקת ריאות עלול לגרום למחלה מהר יותר לגרום להתקדמות של תסמינים קליניים לאורך קו זמן שונה. ראו איור 5 לקבלת תוצאה מייצגת של משקל במעקב בעכברים המתיישבים עם זן P1547.

3. אוסף דגימות שטיפת האף

לפני ההתחלה: להכין מחטים משומרות באמצעות 1 מ"ל מזרקים כתרים עם 26 3/8 G מחטים משופע. חותכים 2.5 ס"מ חתיכות של צינורות פוליאתילן PE20 בקוטר פנימי 0.38 מ"מ, להבטיח כי כל קצה יש קצה משופע. באמצעות מלקחיים, להחליק חתיכה באורך 2.5 ס"מ של צינורות פוליאתילן PE20 (קוטר פנימי 0.38 מ"מ) על קצה המחט, הימנעות ניקוב בצד צינורות. מחטים קנוליטיות ניתן לשמור 70% אתנול עד הצורך.

1. המתת חסד לעכברים ניסיוניים. כמו נקע בצוואר הרחם עלול לגרום נזק קנה הנשימה, שיטה זו של המתת חסד יש להימנע. השיטה המועדפת עלינו היא הרדמה isoflurane ואחריו exsanguination, עם זאת, הקפד לעקוב אחר ההנחיות המוסדיות בעת בחירת מצב המתת חסד.
2. באמצעות 70% אתנול מימית, לעקר את הפרווה superoanterior של החיה, במיוחד את הצוואר, דואג למנוע אתנול גישה nares.
3. בצע חתך אורך יחיד לאורך קו האמצע של הצוואר של החיה, ושני חתכים אופקיים משני קצות, יצירת פתח לדמיין את קנה הנשימה.
4. בזהירות לקלף את העור בחזרה לשני הצדדים, חושף רקמת הצוואר מתחת.
5. קנה הנשימה צריך להיות גלוי, מוקף שרירי האורך משני הצדדים. בזהירות לצלוך אלה כדי לספק תצוגה ברורה של קנה הנשימה עצמו, נזהר לא לנתק את כלי הדם שמסביב.
6. אם כלי הדם נחתכו והדם קיים, לפני שתמשיך, אפשר לדימום להפסיק, ולאחר מכן לנקות את האזור מספר פעמים על ידי חלוקת PBS סטרילי ושימוש גזה סטרילית כדי לספוג בעדינות לחות עודפת באזור.
7. לאחר שקנה הנשימה נחשף כראוי, בצעו חתך רוחבי למחצה בקנה הנשימה בערך בחצי הדרך למעלה (איור 6).
8. צייר 1,000 μl של PBS מעוקר לתוך מחט קנול שהוכן בעבר.
9. הכנס את הצינור לקנה הנשימה לכיוון האף, תוך שמירה על הקצה המשופע המצביע כלפי מטה כדי להקל על הכניסה (איור 7). לאחר המחט במקום, לסובב אותו 180 מעלות, בעדינות לחקור כלפי מעלה עד שאתה מרגיש עמידות לאור.
10. מניחים את Eppendorf המיועד לאוסף מדגם ממש מתחת לאף של העכבר.
11. בדוק מיקום נכון של מחט על ידי חלוקת כמות מינימלית (~ 20 μl) של נוזל שטיפת PBS - טיפת נוזל צריך להיווצר סביב nares של העכבר; במקרה כזה, המשך לשלב 3.13).
12. אם הבדיקה PBS עולה ישירות מהפה של החיה, למשוך את הצינורית בחזרה, ולמקם מחדש על ידי שוב בעדינות חיטוט קדימה עד התנגדות קלה מאוד מורגשת - להיזהר לא לדחוף קנולה רחוק מדי בעבר התנגדות זו, כפי שאתה תעביר אותו בעבר חיך האף דרך לחלל הפה.
13. לוותר על התוכן של מחט במהירות כדי לעזור לעקור ולאסוף כמות מקסימלית של תאים - התוכן צריך לזרום החוצה דרך nares של העכבר לתוך צינור איסוף. מניחים דגימה מיד על קרח.
14. כדי לאסוף דגימות לניתוח RNA, חזור על שלבים 3.8-3.13) באמצעות מחט קנולק המכילה 500 μl של מאגר תמוגה RNA על אותו עכבר. זה יאפשר איסוף של מדגם lysate מאוכלוסיות התאים הנותרים, מורכב בעיקר אפיתל רירית האף, כמו תאים לא מתים היה צריך להיות מוסר בעקבות שטיפת PBS הראשונית. שים לב כי מאגר תמוגה RNA יהיה denude אפיתל ולהרוס את הרקמה שמסביב, ולכן יש לנקוט כדי למנוע מגע עם איברים כגון הריאות, אם שמירה על רקמות אלה רצוי. לאחר איסוף, מניחים מדגם במאגר תמוגה RNA ישירות על קרח יבש כדי להקפיא. פעם אחת במאגר תמוגה, דגימות ניתן לאחסן לפי הוראות היצרן, והם יציבים בדרך כלל ב -70 °C (70 °F) במשך מספר חודשים.

4. קביעת עומס חיידקי ב Nasopharynx

1. כמות חיידקים על ידי הכנת סדרת דילול סדרתי עבור כל דגימת שטיפת האף מורין. באופן כללי, עומס חיידקי צפוי להיות בין 0-10⁴ CFU, ולכן לנהל שלושה דילולים סדרתיים פי 10. הוסף 10 μl של דגימת שטיפת האף מסודר (100 CFU / מיליליטר) לצינור הראשון לריכוז של 10^-1 CFU / מיליליטר. וורטקס ביסודיות.
2. מחלקים את הלוח הבקטריולוגי לרבעים, ומתייגים רבעים כל אחד עם חבר בסדרת הדילול (10⁰-10^-3 CFU/ml). מוציאים 3 טיפות של 10 דגימות μl של 3 הדילולים ואת המדגם המסודר על צלחות אגר סויה טריפטי בתוספת 5% דם כבשים, כמו באיור 2.
3. אפשר להתייבש במשך 15-30 דקות חשופות, ולאחר מכן לכסות צלחות ומניחים במהופך באינקובטור חיידקי עם תנאים אופטימליים לצמיחת חיידקים (בדרך כלל 37 °C (37 °C (5% CO₂).
4. לגדול מושבות חיידקים על צלחת במשך 18-24 שעות.
5. קבעו את מספר החיידקים המתיישבים על ידי ממוצע המושבות שנוצרו על הלוח לכל דילול (איור 3). איור 8 מדגים צפיפות חיידקים בנקודות זמן שונות, כפי שנקבע על ידי תרבות של שטיפה באף, בעכברים המתיישבים עם 3 זנים שונים של דלקת ריאות S. במשך עד 21 ימים.

5. הכנת דגימות עבור ציטומטר זרימה

לפני שתתחיל: הכינו תערובת של נוגדנים. לכימות אוכלוסיות לויקוציטים, אנו ממליצים על התמהיל הבא בדילול שצוין: PE-Ly6G (שיבוט 1A8, 1 מיקרוגרם/מיליליטר), FITC-Ly6C (שיבוט AL-21,1 מיקרוגרם/מיליליטר), eFluor 450-CD45 (שיבוט 30-F11, 2.67 מיקרוגרם/מ"ל), APC-F4/80 (שיבוט PM8 RUO, 0.67 מיקרוגרם/מ"ל), PerCP-Cy5.5-CD11c (שיבוט N418 RUO, 0.5 מיקרוגרם/מ"ל), PE-Cy7-CD11b (שיבוט M1/70, 0.33 מיקרוגרם/מ"ל), אלקסה פלואור 700-CD3 (שיבוט 1782, 4 מיקרוגרם/מ"ל), eFluor 605NC-CD4 (שיבוט GK1.5, 6.67 מיקרוגרם/מיליליטר). אנא שימו לב כי תמהיל זה הוא ריכוז של פי 2 (ראו שלב 5.5). כל הנוגדנים צריכים להיות מדוללים במאגר שטיפת FACs (0.5% סרום עגל עוברי, 2mM EDTA, 0.1% נתרן אזיד ב- PBS) אשר צריך גם להיות מוכן מראש. בתערובת של נוגדני בקרה תואמי איזוטיפ, באופן אידיאלי מאותו ספק כמו הנוגדנים המסומנים ובאותם ריכוזים כמו הנוגדנים הספציפיים, יש להכין. הדגימות שטופלו בנוגדני בקרת האיזוטיפ יתפקדו כבקרה השלילית. כל פלואורסצנטיות שנצפתה בדגימות שטופלו בנוגדני בקרת האיזוטיפ צריכה להיחשב כרקע.

1. Prechill צנטריפוגה המסוגלת לסובב צינורות Eppendorf 1.5 מ"ל ל 4 מעלות צלזיוס.
2. דגימות שטיפת האף צנטריפוגה ב 2,000 x גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. בזהירות פיפטה החוצה על טבעי ומילואים. הערה: בשל כמות קטנה של תאים בתוך nasopharynx, גלולת התא לא יהיה גלוי אלא אם כן יש זיהום תא דם אדום לא רצוי, אשר יהיה אדום בוהק. אם זה נראה, יש למחוק את הדגימה.
3. דגימת resuspend ב 50 μl של Fc? RIIb / CD16-2 (2.4G2) נוגדן (אשר קושר קולטני Fc ומפחית מחייב נוגדנים לא ספציפיים) במאגר שטיפת FACs בריכוז של 4 מיקרוגרם / מיליליטר.
4. דגימת דגירה על קרח במשך 30 דקות.
5. מוסיפים 50 μl של תערובת נוגדנים פלואורסצנטית מרוכזת 2x מוכנה לדגימה. הקצה מדגם מייצג מכל קבוצת ניסוי כדי לפעול כפקד איזוטיפ. מוסיפים את תערובת הנוגדנים של isotype לדגימה זו במקום תערובת כתמים.
6. דגימת דגירה על קרח במשך שעה.
7. דגימות צנטריפוגה ב 2,000 x g במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. השלך supernatant ו resuspend ב 200 μl של PBS.
8. חזור על שלב 5.7.
9. לאחר הכביסה השנייה, דגימות צנטריפוגה שוב ב 2,000 x g במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
10. התמלא מחדש ב- PBS (אם אתה מפעיל דגימה באופן מיידי) או ב- 2% paraformaldehyde (אם הפעלת דגימות 1-3 ימים לאחר הכתמה).
11. בעת ביצוע cytometry זרימה לאסוף את הכמות המרבית של אירועים לכל מדגם או עד המדגם כולו כבר שאיפה. בעכברים צעירים ולא מושפעים, בריאים, זה יהיה מעט כמו 1,000-2,000 אירועים בסך הכל; במהלך אירוע קולוניזציה חיידקית, מספר זה עשוי להגדיל יותר מפי 2 עד 5 בהתאם למצב המחלה בבעלי חיים וגורמים כגון גיל ורקע גנטי. איור 9 מציג תוצאות סיטומטריית זרימה מייצגת שנאספו מסיטומטר זרימה של 3 לייזרים של Becton Dickenson LSRII באמצעות פיזור קדימה של 450 ופיזור צדדי של 300, אם כי אנו ממליצים למטב פרמטרים עבור ציטומטר הזרימה הספציפי שבכוונתך להשתמש בו לפני איסוף הדגימה. הערה: אם מדגם מכיל אפילו כמויות זעירות של זיהום דם, סך האירועים שנאספו יהיה גבוה משמעותית מהצפוי ואת המדגם צריך להיות מוזל מניתוח.

6. ניתוח PCR כמותי (qPCR) של שטיפת האף

1. תאי הפשרה נובעים מטמפרטורת החדר בשלב 3.14.
2. בצע את הפרוטוקול המומלץ המצורף להפקת ה- RNA המועדפת.
3. לאחר השלמת הליך מיצוי RNA כפי שהונחה, לכמת את כמות RNA באמצעות ספקטרופוטומטר או שיטה מבוססת אלקטרופורזה (איור 10). אנו משיגים באופן שגרתי בין 975 ו 3,250 ng הכולל RNA לכל מדגם עם יחס 260/280 ננומטר של >1.7 או מספר שלמות RNA (RIN) סביב, 8.1±0.13.
4. לתמלל cDNA באמצעות M-MULV הפוך Transcriptase על פי פרוטוקול היצרן עם 1,000 ng של RNA (מקסימום 13 μl).
5. לדלל דגימות cDNA וכתוצאה מכך 8x, ו aliquot באופן שווה לתוך 4 צינורות נפרדים לאחסון longterm ב -20 או -80 מעלות צלזיוס.
6. כדי למדוד ביטוי גנים על ידי qPCR, להכין 25 μl דגימות תגובות טריפליקט על קרח או בלוק קר המכיל: 12.5 μl של 2x qPCR מאסטר לערבב מתוך ערכת qPCR על פי בחירתך, 0.25 μl הפניה צבע, 2 μl של cDNA מדולל (שלב 7.5), 1 μl של פרייומרים קדימה והפוך מעורב (400 nM הסופי), 9.25 μl של מים RNAse-DNAse חינם. פרוטוקול זה הוא התאמה של שיטות שפורסמו בעבר¹⁶.
7. באופן כללי אנו מוצאים כי הגברה דו-שלבית של qPCR (95 °C (95 °C למשך 10 דקות ואחריו עד 40 מחזורים x [95 °C x 15 שניות, 60 °C X 1 דקות]) יעילה(איור 11a); עם זאת, יש למטב כל זוג פריימר. עקומות דיסוציאציה (התכה) חייבות להתבצע לאחר הגברה כדי להבטיח שלא התרחשה הגברה לא ספציפית. הגברה (איור 11b)
8. אנו מפעילים באופן שגרתי עקומות סטנדרטיות עבור כל גן מנותח, כמו גם קליברטור סטנדרטי (נגזר ריאות או טחול הומוגנט) עבור כל צלחת 96-well מנותח. כמויות תעתיק יחסי מתקבלות על-ידי נרמול ערכי סף מחזור גולמי (Ct) על-ידי צבע ההפניה ושינוי הערכים הנובעים מכך באמצעות העקומה הסטנדרטית המתאימה. כמויות יחסיות אלה מנורמלות לאחר מכן לקליברטור הסטנדרטי ולגן משק הבית, לפי העניין.

תוצאות

איור 1 מייצג סכמת מבט כולל המסכמת את השלבים העיקריים של הפרוטוקול. איורים 2-3 מספקים הדמיה של המתודולוגיה המיקרוביולוגית הטבועה בפרוטוקולים המתוארים בזאת. איור 4 מייצג מיקום נכון של עכבר לביצוע קולוניזציה תוך-אפית, ואילו איור 5 מתאר בדרך כלל שינויים במשק...

Discussion

במחקר זה הצגנו שיטות מפורטות עבור הקולוניזציה התוך-אפית של עכברים באמצעות זן מבודד קליני של דלקת ריאות סטרפטוקוקוס ואת הבידוד והאפיון הבאים של תאי החיסון שגויסו nasopharynx בתגובה לחיידקים. הדגמנו כיצד אינוקולום חיידקי יכול להיות מתורבת במדיה עשירה בחומרים מזינים ומשמש להקמת אירוע קולו?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-Mouse Ly6C FITC	BD Pharmingen	553104
Anti-Mouse Ly6G PE	BD Pharmingen
Anti-Mouse CD45.1 eFluor 450	eBioscience	48-0453-82
Anti-Mouse F4/80 Antigen APC	eBioscience	17-4801-82
Anti-Mouse CD11c PerCP-Cy5.5	eBioscience	45-0114-82
Anti-Mouse CD11b PE-Cy7	eBioscience	25-0112-82
Anti-Mouse CD3 Alexa Fluor 700	eBioscience	56-0032-82
Anti-Mouse CD4 eFluor 605NC	eBioscience	93-0041-42
Intramedic Polyethylene Tubing - PE20	Becton Dickinson	427406
BD 1 ml Syringe	Becton Dickinson	309659
BD 26 G 3/8 Intradermal Bevel	Becton Dickinson	305110
Buffer RLT Lysis Buffer	Qiagen	79216
Difco Tryptic Soy Agar	Becton Dickinson	236950
Defibrinated Sheep Blood	PML Microbiologicals	A0404
RNAqueous-Micro Kit	Ambion	AM1931
M-MuLV Reverse Transcriptase	New England Biolabs	M0253L
GoTaq qPCR Master Mix	Promega	A6001