Charakterisierung von Entzündungsreaktionen während der intranasalen Kolonisation mit Streptococcus pneumoniae

Zusammenfassung

Die Kolonisation des murinen Nasopharynx mit Streptococcus pneumoniae und die anschließende Extraktion von anhaftenden oder rekrutierten Zellen wird beschrieben. Diese Technik beinhaltet das Spülen des Nasopharynx und die Sammlung der Flüssigkeit durch die Nares und ist anpassungsfähig für verschiedene Auslesungen, einschließlich Differentialzellquantifizierung und Analyse der mRNA-Expression in situ.

Zusammenfassung

Nasopharyngeale Kolonisation durch Streptococcus pneumoniae ist eine Voraussetzung für die Invasion in die Lunge oder Blutkreislauf¹. Dieser Organismus ist in der Lage, die Schleimhautoberfläche des Nasopharynx zu besiedeln, wo er sich aufhalten, sich vermehren und schließlich wirtsabwehren überwinden kann, um in andere Gewebe des Wirts einzudringen. Die Einrichtung einer Infektion in den normalerweise unteren Atemwegen führt zu einer Lungenentzündung. Alternativ können sich die Bakterien in den Blutkreislauf verbreiten und Bakteriämie verursachen, die mit hohen Sterblichkeitsraten verbunden ist², oder direkt zur Entwicklung von Pneumokokken-Meningitis führen. Das Verständnis der Kinetik und immunioniert auf die nasopharyngeale Kolonisation ist ein wichtiger Aspekt der S. pneumoniae-Infektionsmodelle.

Unser Mausmodell der intranasalen Kolonisation ist an die menschlichen Modelle³ angepasst und wurde von mehreren Forschungsgruppen bei der Untersuchung von Wirtspathogen-Antworten im Nasopharynx^4-7verwendet. Im ersten Teil des Modells verwenden wir ein klinisches Isolat von S. pneumoniae, um eine selbstbegrenzende bakterielle Kolonisation zu etablieren, die den Beförderungsereignissen bei menschlichen Erwachsenen ähnelt. Das hier beschriebene Verfahren beinhaltet die Vorbereitung eines bakteriellen Inokulums, gefolgt von der Etablierung eines Kolonisationsereignisses durch Lieferung des Inokulums über einen intranasalen Verabreichungsweg. Residente Makrophagen sind der vorherrschende Zelltyp im Nasopharynx während des stationären Zustands. Typischerweise gibt es nur wenige Lymphozyten in nicht infizierten Mäusen⁸, aber Schleimhautbesieonisation führt zu niedrigen bis hohen Grad Entzündungen (abhängig von der Virulenz der bakteriellen Arten und Stamm), die zu einer Immunantwort und der anschließenden Rekrutierung von Wirtsimmunzellen führen. Diese Zellen können durch eine Lavage des Trachealinhalts durch die Nares isoliert werden und korrelieren mit der Dichte von Besiedlungsbakterien, um die Kinetik der Infektion besser zu verstehen.

Protokoll

Bevor Sie beginnen: Alle Schritte werden in einem Biohazard Level 2 (BSL2) Biological Safety Cabinet (BSC) durchgeführt, sofern nicht anders angegeben. Bitte stellen Sie sicher, dass Sie vor Beginn der Experimente die entsprechende Biohazard-Zulassung für die Verwendung infektiöser bakterieller Krankheitserreger gemäß den institutionellen Richtlinien erhalten haben. Bitte stellen Sie außerdem sicher, dass Sie alle Materialien und Reagenzien haben, die für die Durchführung des Verfahrens im Voraus erforderlich sind. Mäuse, die in diesen Experimenten verwendet wurden, haben weibliche C57BL/6-Mäuse aus Jackson Laboratories, Charles River oder Taconic aufgenommen und waren 10-14 Wochen alt (obwohl wir keine geschlechtsabhängigen signifikanten Unterschiede in der Kinetik der nasalen Kolonisation Clearance oder Infektion gefunden haben). Alle in diesen Experimenten verwendeten Mäuse wurden unter spezifisch pathogenfreien Bedingungen gezüchtet und gepflegt und waren frei von häufigen Viren (LCMV, MNV,MPV, Reovirus ECTV und andere) Bakterien(z. B. H. pylori)und Parasiten(z. B. Pinworm, Ektoparasiten) durch Fäkalienprobentests sowie häufige anatomische Beurteilung von Sentinelmäusen, die in ihren Einrichtungen untergebracht sind. Bei der Durchführung dieser Experimente empfehlen wir die Verwendung von Kontrollmäusen, die nicht jünger als 10-12 Wochen und nicht älter als 6 Monate sind. Mäuse, die jünger oder älter als diese Altersgruppe sind anfälliger für längere nasopharyngeale Beförderungsdauer und erhöhte Wahrscheinlichkeit der Verbreitung von Infektionen. Maushintergrund ist eine weitere wichtige Überlegung, die die Ergebnisse eines Kolonisationsexperiments beeinflussen kann, da mehrere Gruppen gezeigt haben, dass Mäuse unterschiedlicher genetischer Herkunft unterschiedliche Anfälligkeiten für den S. pneumoniae D39 (Serotyp 2) Stamm^9,10haben. S. pneumoniae ist kein natürlich vorkommender muriner Erreger und sein einziges natürliches Reservoir ist der menschliche Nasopharynx. Die Übertragung erfolgt über Atemtröpfchen, und da Mäuse keine Atemsekrete produzieren, können einzelne Mäuse das Bakterium nicht auf andere Mäuse übertragen, so dass es keine Bedenken für die Maus-zu-Maus-Übertragung^{gibt 11}. Eine visuelle Übersicht über die in diesem Manuskript beschriebenen Verfahren finden Sie in Abbildung 1.

1. Vorbereitung der S. pneumoniae Kultur

1. Impfen Sie 5 ml tryptische soja Agar für die Suspension Wachstum von Streptococcus pneumoniae.
2. Kultur unter statischen Bedingungen bei 37 °C bei 5%_CO2, bis das bakterielle Inokulum das Wachstum der Logphase mit einer entsprechenden Flüssigkeitsdichte von 10⁸ KBE/ml erreicht, wie durch einen auf 600 nm eingestellten Kilometerzähler bestimmt. Der genaue Messwert entsprechend dieser KBE unterscheidet sich je nach dem spezifischen ausgewählten Bakterienstamm; für die meisten Stämme von S. pneumoniae entspricht dies einem OD₆₀₀ Bereich von 0,45-0,55. Typischerweise wachsen S. pneumoniae Stämme in flüssiger Kultur innerhalb von 1,5-2,5 Stunden unter den empfohlenen Bedingungen auf diese Dichte an, ohne dass eine Subkultivierung erforderlich ist. Die Kultur sollte nicht überwachsen (jenseits eines OD-Wertes von 0,75), da dies den Punkt darstellt, an dem die Bakterien nicht mehr im Logphasenwachstum sind und einer umfassenden Autolyse unterzogen werden.
3. Jede Maus wird mit etwa 10⁷ Bakterien geimpft. Daher für jede 9 zu kolonisierte Maus pipette 1 ml Inokulum in ein Eppendorf-Rohr und drehen sie bei 15.000 x g für 1 min. Ein weißliches Pellet sollte sichtbar sein. Entfernen Sie den Überstand, achten Sie darauf, das Pellet nicht zu stören und die Bakterien in 100 l Phosphat gepufferter Saline (PBS) wieder auszusetzen, wodurch die Konzentration auf 10⁹ KBE/ml erhöht wird. In diesem Stadium sollten die Bakterien lebensfähig bleiben, aber nicht ohne weiteres replizieren.
4. Wenn Sie mehrere Aliquots verwenden, kombinieren Sie in einem Rohr, um leichte Variationen der Bakteriendichte zwischen Proben zu kontrollieren.
5. Halten Sie Bakterien auf Eis, bis sie zur Impfung bereit sind, für maximal 1 Stunde.
6. Um eine genaue Bakterienzahl zu erhalten, führen Sie log-weise serielle Verdünnungsserien durch, die mit ordentlichem bakteriellem Inokulum beginnen. Seriell 10-fach verdünnen und 10 l bis 90 l steriles PBS hinzufügen.
7. Ausbanden Sie 3 Tropfen mit 10 l Proben von Verdünnungen 10^-5 - 10^-9,plus eine PBS-kontaminationskontrolle, auf separat beschriftete Abschnitte der tryptischen Soja-Agar -Platte (TSA), ergänzt durch 5% Schafsblut (Abbildung 2). Stellen Sie sicher, dass Pipettenspitzen für jeden Schritt geändert werden, der von einer höheren KBE-Konzentration auf eine niedrigere KBE-Konzentration verdünnt wird, um zu vermeiden, dass überschüssige Bakterien übertragen werden und die Variabilität der Ergebnisse erhöht wird. Menschliche Blutagar (HBA) Platten können auch anstelle von TSA verwendet werden. Da viele Stämme von S. pneumoniae resistent gegen Neomycin sind (von 5-20 g/ml), kann dieses Antibiotikum auch während der Plattenvorbereitungsphase dem Agarmedium der Wahl zugesetzt werden. Dies erleichtert die Aufzählung, da es nicht resistente Bakterien eliminiert. Die Antibiotika-Empfindlichkeit jedes Stammes muss im Voraus getestet werden, um die optimale Konzentration von Antibiotika für jeden Bakterienstamm zu bestimmen.
8. 15-30 min unbedeckt trocknen lassen, dann Platten abdecken und kopfüber in bakteriellen Inkubator auf 37 °C und 5%_CO2legen. Wachsen Sie Bakterienkolonien auf dem Teller für 24 Stunden.
9. Bestimmen Sie die Anzahl der koloniebildenden Einheiten und ihre entsprechende Konzentration. Basierend auf Denseraten des OD_600-Wertes sollte die Konzentration im Bereich von 1-4 x 10⁹ KBE/ml liegen. S. pneumoniae Kolonien sollten als kleine, kreisförmige Kolonien in gelblich-beige Farbe erscheinen, wobei eine kleine Depression in der Mitte ihnen ein donutartiges Aussehen verleiht (Abbildung 3).

2. Murine intranasale Kolonisation

1. Bremsen Sie Mäuse, indem Sie sie in ein Maus-Restrainer-Gerät legen (ein modifiziertes 50 ml Falcon-Rohr mit abgeschnittener Spitze, um eine Öffnung zu erzeugen), um sie durch die Basis ihres Körpers mit Daumen zu sichern, so dass ihre Nasen einfach aus dem verjüngten Ende des Retrainerapparates auftauchen (Abbildung 4). Die Verwendung dieses Geräts ermöglicht die Immobilisierung des Mauskopfes und die Segregation seiner Nares in einer Weise, die die Bewegung minimiert und Versuche des Tieres behindert, die Pipettenspitze zu masticate, so dass eine vollständige Lieferung des Inoculums ermöglicht. Alternativ können Mäuse durch Abschürfungen am Hals und manuelle Zurückhaltung immobilisiert werden. Wir empfehlen keine Anästhesie der Tiere vor der intranasalen Impfung. Die Verwaltung des Inokulums an Tiere unter Anästhesie führt dazu, dass sich einige der Inokulume auf die Lunge ausbreiten^12,13.
2. Mit einer P10- oder P20-Pipette, impfen Sie jede Maus, indem Sie 10 l der vorbereiteten Kultur ablagern, sie gleichmäßig zwischen beiden Nares verteilen (lassen Sie Inokulum in die Nase tropfen, indem Sie die Impfung allmählich pulsieren, und nehmen Sie sich Zeit, damit Mäuse Inoculum einatmen). Um die vollständige Lieferung des Inokulums zu erreichen, pausieren Sie die Verwaltung an jedem Punkt, an dem die Maus beginnt, ihre Nase übermäßig zu bewegen. Das gesamte Inokulum darf nicht in die Nares injiziert werden, da die Mäuse während des Ausatmens einige durch die Nase vertreiben können; Da die vertriebene Menge jedoch in der Regel winzig ist und das Inokulum eine extrem hohe Menge an Bakterien enthält, wirkt sich dies nicht signifikant auf die besiedelnde bakterielle Belastung aus. Darüber hinaus ist die für die Besiedlung in der Nasopharyngealschleimhaut verfügbare Oberfläche begrenzt und folglich haben wir und andere festgestellt, dass die empfohlene Dosis von 10⁷ ausreicht, um bei allen Mäusen konsistente Bakterienwerte zu erhalten, was zu einer minimalen Variabilität in den Anfangsmengen von besiedelnden Bakterien^14,15 führt.
3. Wiegen Sie Mäuse, wenn Sie Gewichtsindikatoren als Teil Ihrer Endpunktüberwachung verwenden. Überwachen Sie Mäuse alle 12-24 Stunden auf klinische Symptome, einschließlich Lethargie, Rüschenfell und Gewichtsverlust. Mäuse zeigen in der Regel erst 3-5 Tage nach der Kolonisation Krankheitssymptome, und diesen wird Gewichtsverlust vorausgehen, der durchschnittlich etwa 5% des gesamten Körpergewichts pro Tag betragen kann. Wenn die Mäuse zunehmend krank werden, nehmen sie geknickte Haltungen an und zeigen eine verminderte Aktivität und eine verminderte Reaktionsfähigkeit auf Stimulation, einschließlich der Handhabung. In diesem Stadium ist Krankheit in der Regel ein Hinweis auf Sepsis und/oder Lungenentzündung und wird wahrscheinlich tödlich sein, obwohl Mäuse mit 1 ml subkutaner Saline täglich behandelt werden können, um die Ergebnisse zu verbessern. Überlebende Mäuse sollten nach Tag 7 nach der Kolonisierung eine Verbesserung zeigen, wie durch Gewichtsstabilisierung gefolgt von Gewichtszunahme belegt wird, obwohl verschiedene Stämme von S. pneumoniae Krankheiten schneller induzieren und zu einem Fortschreiten der klinischen Symptome entlang einer anderen Zeitlinie führen können. Abbildung 5 für ein repräsentatives Ergebnis des Gewichts, das bei Mäusen verfolgt wird, die mit dem P1547-Stamm kolonisiert sind.

3. Nasal Lavage Probensammlung

Vor Beginn: Konserven mit 1 ml Spritzen zubereiten, die mit 26 3/8 G abgeschrägten Nadeln gekrönt sind. Schneiden Sie 2,5 cm Stück PE20 Polyethylenrohre mit einem Innendurchmesser von 0,38 mm, so dass jedes Ende eine abgeschrägte Spitze hat. Schieben Sie mit Zangen ein 2,5 cm langes Stück PE20-Polyethylenschlauch (Innendurchmesser 0,38 mm) auf die Nadelspitze, um zu vermeiden, dass die Schlauchseite unterbrochen wird. Kanülierte Nadeln können bis zum Bedarf in 70% Ethanol aufbewahrt werden.

1. Euthanisieren Sie versuchsexperimentelle Mäuse. Da zervikale Dislokation entha möglicherweise die Luftröhre schädigen kann, muss diese Methode der Euthanasie vermieden werden. Unsere bevorzugte Methode ist isoflurane Anästhesie gefolgt von Exsanguination, jedoch stellen Sie sicher, dass Sie institutionelle Richtlinien bei der Auswahl der Art der Euthanasie zu folgen.
2. Mit 70% wässrigem Ethanol sterilisieren Sie das superoanterioröse Fell des Tieres, insbesondere den Hals, und achten Sie darauf, dass Ethanol nicht auf die Nares zugreift.
3. Machen Sie einen einzigen Längsschnitt entlang der Mittellinie des Halses des Tieres, und zwei horizontale Schnitte an beiden Enden, wodurch eine Öffnung, um die Luftröhre vorzustellen.
4. Schälen Sie die Haut vorsichtig auf beiden Seiten zurück und enthüllen Sie das Darunter des Halsgewebes.
5. Trachea sollte sichtbar sein, umgeben von Längsmuskeln auf beiden Seiten. Schnippchen Sie diese sorgfältig, um einen klaren Blick auf die Luftröhre selbst zu bieten, wobei darauf zu achten ist, dass die umgebende Vaskulatur nicht abtrennung.
6. Wenn die Gefäße geschnitten wurde und Blut vorhanden ist, vor dem Fortfahren, lassen Sie Blutungen aufhalten, und reinigen Sie dann den Bereich mehrmals durch die Abgabe sterilen PBS und mit steriler Gaze, um sanft überschüssige Feuchtigkeit in der Gegend aufzusaugen.
7. Sobald die Luftröhre richtig belichtet ist, machen Sie einen quer, semilunaren Schnitt in der Luftröhre etwa auf halbem Weg nach oben (Abbildung 6).
8. Ziehen Sie 1.000 l sterilisierte SPBS in zuvor vorbereitete Kanülennadeln.
9. Legen Sie Kanüle in die Luftröhre in Richtung der Nase, halten Sie die abgeschrägte Kante nach unten zeigen für eine einfache Einfügung (Abbildung 7). Sobald die Nadel an Ort und Stelle ist, drehen Sie es um 180°, und sonden Sie vorsichtig nach oben, bis Sie Lichtwiderstand spüren.
10. Platzieren Sie Eppendorf für die Probensammlung direkt unter der Nase der Maus.
11. Testen Sie die korrekte Platzierung der Nadel, indem Sie eine minimale Menge an PBS-Lavageflüssigkeit (ca. 20 ,l) abgeben - Flüssigkeitstropfen sollte sich um die Nares der Maus bilden; wenn dies der Fall ist, fahren Sie mit Schritt 3.13 fort).
12. Wenn Test PBS tritt direkt aus dem Mund des Tieres, ziehen Sie die Kanüle zurück, und neu positionieren, indem Sie wieder sanft nach vorne, bis sehr leichte Widerstand gefühlt wird - achten Sie darauf, Kanüle nicht zu weit über diesen Widerstand zu schieben, wie Sie es am Nasengaumen vorbei und durch die Mundhöhle bewegen.
13. Inhalt der Nadel schnell zu verdrängen und maximale Menge an Zellen zu sammeln - Inhalt sollte durch die Nares der Maus und in Sammelrohr fließen. Probe sofort auf Eis legen.
14. Um Proben für die RNA-Analyse zu sammeln, wiederholen Sie die Schritte 3.8-3.13) mit einer kanülierten Nadel, die 500 l RNA-Lysepuffer auf derselben Maus enthält. Dies ermöglicht die Entnahme von Lysatproben aus den verbleibenden Zellpopulationen, die größtenteils aus dem nasopharyngealen Schleimhautepithel bestehen, da nicht haftende Zellen nach der ersten PBS-Lava hätten entfernt werden müssen. Bitte beachten Sie, dass der RNA-Lysepuffer das Epithel denudet und umgebendes Gewebe zerstört, daher ist darauf zu achten, dass der Kontakt mit Organen wie der Lunge vermieden wird, wenn eine Retention dieser Gewebe gewünscht wird. Nach der Entnahme die Probe in den RNA-Lysepuffer direkt auf Trockeneis legen, um zu frieren. Einmal im Lysepuffer können Proben gemäß den Anweisungen des Herstellers gelagert werden und sind in der Regel mehrere Monate bei -70 °C stabil.

4. Bestimmung der bakteriellen Belastung im Nasopharynx

1. Quantitieren Sie Bakterien, indem Sie eine serielle Verdünnungsserie für jede murine Nasenspülprobe vorbereiten. Im Allgemeinen ist mit einer bakteriellen Belastung zwischen 0-10⁴ KBE zu rechnen, daher führen Sie drei 10-fache serielle Verdünnungen durch. 10 l der ordentlichen Nasenspülprobe (100 KBE/ml) in die erste Röhre mit einer Konzentration von 10^-1 CFU/ml geben.
2. Dividieren Sie die bakteriologische Platte in Quadranten und beschriften Quadranten jeweils mit einem Mitglied der Verdünnungsreihe (10⁰-10^-3 CFU/ml). Verkleben Sie 3 Tropfen von 10 l Proben der 3 Verdünnungen und die saubere Probe auf Tryptic Soja-Agar-Platten, ergänzt mit 5% Schafsblut, wie in Abbildung 2.
3. 15-30 min unbedeckt trocknen lassen, dann Platten abdecken und kopfüber in bakteriellen Inkubator mit optimalen Bedingungen für das Bakterienwachstum (typischerweise 37 °C und 5% CO₂₎platzieren.
4. Wachsen Sie Bakterienkolonien auf dem Teller für 18-24 Stunden.
5. Bestimmen Sie die Anzahl der besiedelnden Bakterien, indem Sie die auf der Platte gebildeten Kolonien für jede Verdünnung durchschnittlich bestimmen (Abbildung 3). Abbildung 8 zeigt die bakterielle Dichte während verschiedener Zeitpunkte, wie durch die Kultur der Nasenspülungen bestimmt, bei Mäusen, die mit 3 verschiedenen Stämmen von S. pneumoniae für bis zu 21 Tage kolonisiert sind.

5. Vorbereitung von Proben für Durchflusszytometer

Vor Beginn: Bereiten Sie eine Mischung von Antikörpern vor. Für die Quantifizierung von Leukozytenpopulationen empfehlen wir folgende Mischung an den angegebenen Verdünnungen: PE-Ly6G (Klon 1A8, 1 g/ml), FITC-Ly6C (Klon AL-21,1 g/ml), eFluor 450-CD45 (Klon 30-F11, 2,67 g/ml), APC-F4/80 (Klon PM8 RUO, 0,67 g/ml), PerCP-Cy5.5-CD11c (Klon N418 RUO, 0,5 g/ml), PE-Cy7-CD11b (Klon M1/70, 0,33 g/ml), Alexa Fluor 700-CD3 (Klon 1782, 4 g/ml), eFluor 605NC-CD4 (Klon GK1,5, 6,67 g/ml). Bitte beachten Sie, dass es sich bei dieser Mischung um eine 2-fache Konzentration handelt (siehe Schritt 5.5). Alle Antikörper sollten im FACs Wash Puffer (0,5% fetales Kalbsserum, 2mM EDTA, 0,1% Natriumazid in PBS) verdünnt werden, die ebenfalls vorher zubereitet werden sollten. In einer Mischung aus isotypübereinstimmenden Kontrollantikörpern, idealerweise vom gleichen Lieferanten wie die markierten Antikörper und in den gleichen Konzentrationen wie die spezifischen Antikörper, sollte hergestellt werden. Die mit den Isotypkontrollantikörpern behandelten Proben funktionieren als Negativkontrolle. Jede Fluoreszenz, die in den proben beobachtet wurde, die mit den Isotypkontrollantikörpern behandelt wurden, sollte als Hintergrund betrachtet werden.

1. Eine Zentrifuge vorgeben, die 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen auf 4 °C drehen kann.
2. Zentrifugen-Nasenspülproben bei 2.000 x g für 10 min bei 4 °C. Sorgfältig Pipette aus Überstand und Reserve. Hinweis: Aufgrund der geringen Menge an Zellen innerhalb des Nasopharynx ist das Zellpellet nur sichtbar, wenn es eine unerwünschte Kontamination der roten Blutkörperchen gibt, die rot rot wird. Wenn dies beobachtet wird, sollte die Probe verworfen werden.
3. Probe in 50 l fc resuspendieren? RIIb/CD16-2 (2.4G2) Antikörper (der Fc-Rezeptoren bindet und unspezifische Antikörperbindung reduziert) im FACs Wash Buffer in einer Konzentration von 4 g/ml.
4. Inkubationsprobe auf Eis für 30 min.
5. Fügen Sie der Probe 50 l vorvorbereiteten 2x konzentrierten fluoreszierenden Antikörpermix hinzu. Legen Sie eine repräsentative Probe aus jeder Versuchsgruppe beiseite, um als Isotypkontrolle zu fungieren. Fügen Sie diese Probe anstelle der Fleckenmischung den Isotyp-Antikörpermix hinzu.
6. Inkubationsprobe auf Eis für 1 Stunde.
7. Zentrifugenproben bei 2.000 x g für 10 min bei 4 °C. Überstand entsorgen und in 200 l PBS resuspendieren.
8. Wiederholen Sie Schritt 5.7.
9. Nach der zweiten Wäsche proben zentrifugen proben wieder bei 2.000 x g für 10 min bei 4 °C.
10. Resuspend in entweder in PBS (wenn probe sofort läuft) oder 2% Paraformaldehyd (wenn Proben 1-3 Tage nach der Färbung laufen).
11. Bei der Durchführung der Durchflusszytometrie sammeln Sie die maximale Anzahl von Ereignissen pro Probe oder bis die gesamte Probe angesaugt wurde. Bei nicht infizierten, gesunden, jungen Mäusen werden dies nur 1.000-2.000 Gesamtereignisse sein; Während eines bakteriellen Besiedlungsereignisses kann diese Zahl um mehr als das 2-zu-5-fache steigen, abhängig vom Krankheitsstatus bei Tieren und Faktoren wie Alter und genetischem Hintergrund. Abbildung 9 zeigt repräsentative Durchflusszytometrieergebnisse, die aus einem 3-Laser-Becton-Dickenson-LSRII-Durchflusszytometer mit einem Vorwärtsstreu von 450 und einer Seitenstreuung von 300 gesammelt wurden, obwohl wir empfehlen, die Parameter für das spezifische Durchflusszytometer zu optimieren, das Sie vor der Probenentnahme verwenden möchten. Hinweis: Wenn eine Probe gleichmäßige Spuren von Blutkontamination enthält, werden die insgesamt erfassten Ereignisse deutlich höher sein als erwartet, und die Probe sollte von der Analyse ausgeschlossen werden.

6. Quantitative PCR (qPCR) Analyse von Nasenlavages

1. Tauzelle lysiert ab Schritt 3.14 Raumtemperatur.
2. Befolgen Sie das empfohlene Protokoll, das mit der bevorzugten RNA-Extraktion Ihrer Wahl versehen ist.
3. Nach Abschluss des RNA-Extraktionsverfahrens wie angewiesen, quantifizieren Sie die Menge der RNA mit einem Spektralphotometer oder einer elektrophoresebasierten Methode (Abbildung 10). Wir erhalten routinemäßig zwischen 975 und 3.250 ng Gesamt-RNA pro Probe mit einem Verhältnis von 260/280 nm von >1,7 oder einer RNA-Integritätsnummer (RIN) um 8,1±0,13.
4. Transkribieren CDNA mit der M-MULV Reverse Transcriptase nach dem Herstellerprotokoll mit 1.000 ng RNA (maximal 13 l).
5. Verdünnen Sie die resultierenden cDNA-Proben 8x und aliquot gleichmäßig in 4 separate Rohre für die Langzeitlagerung bei -20 oder -80 °C.
6. Um die Genexpression nach qPCR zu messen, Bereiten Sie 25 l Probenreaktionen in Dreifacharbeit auf Eis oder Kalteblock vor, die: 12,5 l 2x qPCR-Master-Mix aus qPCR-Kit Ihrer Wahl, 0,25 l Referenzfarbstoff, 2 l verdünnter cDNA (Schritt 7,5), 1 l gemischte Vorwärts- und Rückwärtsgrundierung (400 nM Endwasser), 9,25 l RNAse-DNAse-freies Wasser enthalten. Dieses Protokoll ist eine Anpassung der zuvor veröffentlichten Methoden¹⁶.
7. Im Allgemeinen stellen wir fest, dass eine zweistufige qPCR-Verstärkung ( 95 °C für 10 min gefolgt von bis zu 40 Zyklen x [95 °C x 15 sec, 60 °C x 1 min]) wirksam ist (Abbildung 11a); Allerdings muss jedes Primerpaar optimiert werden. Dissoziationskurven (Schmelzen) müssen nach der Verstärkung durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass keine unspezifische Verstärkung aufgetreten ist. Verstärkung (Abbildung 11b)
8. Wir führen routinemäßig Standardkurven für jedes analysierte Gen sowie einen Standardkalibrator (abgeleitet aus Lungen- oder Milzhomogenat) für jede analysierte 96-Well-Platte durch. Relative Transkriptsmengen werden durch die erste Normalisierung der Rohzyklusschwellenwerte (Ct) durch den Referenzfarbstoff und die Transformation der resultierenden Werte durch die jeweilige Standardkurve ermittelt. Diese relativen Mengen werden anschließend auf den Standardkalibrator und ein Haushaltsgen normalisiert.

Ergebnisse

Abbildung 1 stellt eine Übersichtschaltplan mit den wichtigsten Schritten des Protokolls dar. Die Abbildungen 2-3 enthalten eine Visualisierung der mikrobiologischen Methodik, die den hier beschriebenen Protokollen innewohnt. Abbildung 4 stellt die richtige Positionierung einer Maus dar, um eine intranasale Kolonisation durchzuführen, während Abbildung 5 typischerweise Gewichtsänderungen von Mäusen zeigt, die mit dem S. pneumoniae-Stamm P15...

Diskussion

In dieser Studie präsentierten wir detaillierte Methoden für die intranasale Besiedlung von Mäusen unter Verwendung eines klinischen Isolatestamms von Streptococcus pneumoniae und die anschließende Isolierung und Charakterisierung der Immunzellen, die als Reaktion auf die Bakterien an Nasopharynx rekrutiert wurden. Wir demonstrierten, wie ein bakterielles Inokulum in nährstoffreichen Medien kultiviert werden kann und verwendet werden, um ein Kolonisationsereignis bei Mäusen zu etablieren, das zunächst auf...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-Mouse Ly6C FITC	BD Pharmingen	553104
Anti-Mouse Ly6G PE	BD Pharmingen
Anti-Mouse CD45.1 eFluor 450	eBioscience	48-0453-82
Anti-Mouse F4/80 Antigen APC	eBioscience	17-4801-82
Anti-Mouse CD11c PerCP-Cy5.5	eBioscience	45-0114-82
Anti-Mouse CD11b PE-Cy7	eBioscience	25-0112-82
Anti-Mouse CD3 Alexa Fluor 700	eBioscience	56-0032-82
Anti-Mouse CD4 eFluor 605NC	eBioscience	93-0041-42
Intramedic Polyethylene Tubing - PE20	Becton Dickinson	427406
BD 1 ml Syringe	Becton Dickinson	309659
BD 26 G 3/8 Intradermal Bevel	Becton Dickinson	305110
Buffer RLT Lysis Buffer	Qiagen	79216
Difco Tryptic Soy Agar	Becton Dickinson	236950
Defibrinated Sheep Blood	PML Microbiologicals	A0404
RNAqueous-Micro Kit	Ambion	AM1931
M-MuLV Reverse Transcriptase	New England Biolabs	M0253L
GoTaq qPCR Master Mix	Promega	A6001