JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يسين الغنية تكرار تحركات 1 و 2 (LRRK1 وLRRK2) هي بروتينات متعددة المجالات التي ترميز كل من GTPase والمجالات كيناز والتي هي فسفرته في الخلايا. هنا، نقدم بروتوكول لتسمية LRRK1 وLRRK2 في الخلايا مع 32 P الفوسفاتية، وبالتالي توفير وسيلة لقياس مستويات الشاملة phophorylation الخلوية.

Abstract

يسين الغنية تكرار تحركات 1 و 2 (LRRK1 وLRRK2) هي paralogs التي تشترك في تنظيم المجال مماثلة، بما في ذلك مجال كيناز سيرين ثريونين، وهو رأس من البروتينات المعقدة المجال (ROC)، لC-محطة المجال ROC (مجلس النواب)، ويسين الغنية ويكرر مثل ankyrin في N-محطة. أدوار الخلوية الدقيقة للLRRK1 وLRRK2 لم يتم بعد توضيح، ولكن LRRK1 وقد تورط في التيروزين كيناز مستقبلات إشارات 1،2، بينما هو متورط LRRK2 في التسبب في مرض باركنسون 3،4. في هذا التقرير، نقدم بروتوكول لتسمية LRRK1 وLRRK2 البروتينات في الخلايا مع 32 P الفوسفاتية، وبالتالي توفير وسيلة لقياس مستويات الفسفرة العام لهذه البروتينات في الخلايا 2. باختصار، الموسومة تقارب يتم التعبير عن البروتينات في الخلايا LRRK HEK293T التي يتعرض لها والمتوسطة التي تحتوي على 32 P-الفوسفاتية. يتم استيعابهم في 32 P-الفوسفاتية من قبل الخلايا بعد سوى عدد قليلوصفت بذلك بالإشعاع ساعة من الحضانة وجميع الجزيئات في الخلايا التي تحتوي على الفوسفات. عبر العلامة تقارب (3xflag) يتم عزل البروتينات LRRK من المكونات الخلوية الأخرى التي مناعي. ثم يتم فصل Immunoprecipitates عبر SDS-PAGE، نشف لأغشية PVDF وتحليل الفوسفات أدرجت يتم تنفيذها بواسطة تصوير الإشعاع الذاتي (32 P إشارة) والكشف الغربية (إشارة البروتين) من البروتينات على البقع. يمكن بسهولة أن تتكيف بروتوكول لمراقبة الفسفرة من أي البروتين الأخرى التي يمكن التعبير عنها في الخلايا وعزلها مناعي.

Introduction

يسين الغنية تكرار تحركات 1 و 2 (LRRK1 وLRRK2) هي paralogs متعددة المجالات التي تشترك في تنظيم المجال مماثلة. كل من البروتينات ترميز سلسلة GTPase أقرب إلى الأسرة من رأس GTPases (رأس من البروتينات المعقدة، أو ROC) فضلا عن C-محطة المجال ROC (مجلس النواب) وتصنيفها على نحو فعال على حد سواء البروتينات للبروتين الأسرة ROCO 5،6. N-محطة من جنبا إلى جنب مجال ROC-النواب، سواء البروتينات ترميز تكرار المجال يسين الغنية فضلا عن المجال مثل ankyrin، في حين LRRK2 فقط يشفر المدرع اضافية domein 6-8. C-محطة من ROC-النواب، سواء البروتينات مشاركة سيرين ثريونين كيناز-المجال أثناء LRRK2 فقط بترميز مجال WD40 في المنطقة C-محطة 8. أدوار الخلوية الدقيقة للLRRK1 وLRRK2 لم يتم بعد توضيح، ولكن LRRK1 وقد تورط في التيروزين كيناز مستقبلات إشارات 1،2، في حين تشير الأدلة الوراثية إلى دور للLRRK2 في التسبب في مرض باركنسون 3،4.

الطبقة = "jove_content"> والفسفرة من البروتينات هو آلية تنظيمية مشتركة في الخلايا. على سبيل المثال، يمكن أن الفسفرة من الضروري لتفعيل الانزيمات أو لتوظيف البروتينات إلى مجمع الإشارة. الفسفرة الخلوية من LRRK2 تميزت على نطاق واسع وأظهرت الخرائط phosphosite غالبية مواقع الفسفرة الخلوية أن تحدث في كتلة بين تكرار ankyrin ويسين تكرار المجالات الغنية 9-11. على الرغم من LRRK1 مواقع الفسفرة الخلوية لديها حتى الآن ليتم تعيينها، أدلة من الدراسات باستخدام بروتين فسفوري؛ فسوبروتين تلطيخ البقع من immunoprecipitated البروتين LRRK1 من خلايا COS7 تشير إلى أن البروتين هو LRRK1 فسفرته في الخلايا 12.

تقدم هذه الورقة بروتوكول الأساسية لمعايرة مستوى الفسفرة العام للLRRK1 وLRRK2 في خطوط الخلايا باستخدام وضع العلامات الأيضية مع 32 P-الفوسفاتية. الاستراتيجية الشاملة واضح ومباشر. تقارب الموسومة LRRK المتواجدوأعرب الإضافية في الخلايا HEK293T التي يتعرض لها والمتوسطة التي تحتوي على 32 P-الفوسفاتية. يتم استيعابهم في 32 P-الفوسفاتية من قبل الخلايا بعد ساعات قليلة فقط من الحضانة وجميع الجزيئات في الخلايا التي تحتوي على الفوسفات وصفت بذلك بالإشعاع. ثم يتم استخدام العلامة تقارب (3xflag) لعزل البروتينات LRRK من المكونات الخلوية الأخرى التي مناعي. ثم يتم فصل Immunoprecipitates عبر SDS-PAGE، نشف لأغشية PVDF وتحليل الفوسفات أدرجت يتم تنفيذها بواسطة تصوير الإشعاع الذاتي (32 P إشارة) والكشف الغربية (إشارة البروتين) من البروتينات على البقع.

Protocol

يستخدم هذا البروتوكول المشعة 32 ف المسمى الفوسفاتية لمتابعة الفسفرة الخلوية من LRRK2. من المهم أن نضع في الاعتبار أن جميع العمليات مع الكواشف الإشعاعية ينبغي أن يقوم باستخدام تدابير وقائية مناسبة للحد من التعرض للإشعاع المشعة للمشغل والبيئة. المركبات التي تحتوي على النظائر التي تنبعث منها الإشعاعات المؤينة يمكن أن تكون ضارة على صحة الإنسان والترخيص واللوائح الصارمة في عنصر تحكم المؤسسي والوطني مستوى استخدامها. وأجريت التجارب في هذا البروتوكول في أعقاب التدريب على استخدام الإشعاع مفتوحة المصدر في الجامعة الكاثوليكية في لوفين (KU لوفين) وتمشيا مع المبادئ التوجيهية الممارسة المخبرية الجيدة التي تقدمها وزارة الصحة والسلامة والبيئة في الجامعة. وينتشر العديد من الخطوات في بروتوكول لدينا على نطاق واسع مثل زراعة الخلايا، SDS-PAGE، النشاف الغربية وتعطى هنا تفاصيل البروتوكول كما هو مطبق في مختبرنا. كانت لياليالجدير بالذكر أن hould معها ظروف تجريبية دقيقة تختلف من مختبر الى مختبر، وينبغي بالتالي أن تتكيف تدابير محددة لضمان التعامل السليم مع المواد المشعة إلى كل إعداد مختبر جديد.

استخدام الإشعاع مفتوحة المصدر يخضع لموافقة الجهات الرقابية المسبقة والهيئة التنظيمية المسؤولة عن الإشعاع المصدر المفتوح في البحوث المختبرية يختلف من بلد إلى آخر. يجب على المستخدمين استشارة المؤسسية ضابط السلامة من الإشعاع الخاصة بهم من أجل ضمان أن تكون إجراءات تتوافق مع القواعد واللوائح المحلية. معلومات عن الهيئات التنظيمية يمكن العثور: في بلجيكا، والوكالة الاتحادية للرقابة النووية ( http://www.fanc.fgov.be ، موقع باللغة الفرنسية أو الهولندية)، في المملكة المتحدة، والصحة والسلامة بالمملكة المتحدة ( HTTP: / / www.hse.gov.uk / الإشعاع / المؤينة / index.htm ملاحظات )، في الولايات المتحدة للمجلس التوحيد الوطنىاللجنة التنظيمية لير ( http://www.nrc.gov/materials/miau/regs-guides-comm.html )، في كندا لجنة السلامة النووية الكندية ( http://nuclearsafety.gc.ca/eng/ )، و في ألمانيا داس الاتحادي للFÜR Strahlenschutz ( http://www.bfs.de/de/bfs ). ولوحظ وجود احتياطات السلامة ذات الصلة لهذا البروتوكول في النص، وأبرزت مع رمز البرسيم المشعة ( figure-protocol-2407 ).

1. وصفها التمثيل الغذائي للخلايا

  1. إعداد الخلايا لوصفها.
    1. خطوط الخلايا الثقافة HEK293T وفقا لظروف ثقافة القياسية (37 درجة مئوية، 5٪ CO 2) في DMEM مع 8٪ مصل العجل الجنين والجنتاميسين.
    2. توسيع الخلايا بما فيه الكفاية لالحصول على ما لا يقل عن 1 × 10 6 خلايا لكل عينة لاختبار.
    3. يعرض للتريبسين الخلايا وخروج الى لوحة 6 لوحات جيدة (35 مم) في 10 6 خلية / جيدا.
    4. 24 ساعة بعد الطلاء خارج الخلايا، والتعبير عن بروتين 3xflag-LRRK2 عبر ترنسفكأيشن أو ناقلات lentiviral بوساطة تنبيغ.
      1. لترنسفكأيشن، مزيج لكل عينة 4 ميكروغرام الحمض النووي (pCHMWS-3xflag LRRK2 البلازميد 13-15 أو pCHMWS-3xflag LRRK1 البلازميد 15) و 8 ميكرولتر من polyethyleneimine الخطية (PEI الخطية، 1 ملغ / مل) في 80 ميكرولتر DMEM (بدون إضافات ). السماح لمجمع ل15-30 دقيقة ثم تضاف إلى الخلايا المعقدة عن طريق خلط جيدا في الوقت الحاضر المتوسطة.
      2. لناقلات lentiviral بوساطة تنبيغ، وتمييع lentiviral ناقلات ترميز 3xflag-LRRK1 أو -2 (LV-3xflag-LRRK1، LV-3xflag-LRRK2، وكقاعدة عامة من الإبهام، كما تنبيغ مع العديد من وحدات transducing مرتين، أي عدد جزيئات النواقل وظيفية، من lentivector كما أن هناك خلايا) في ثقافة المتوسط. وصف المنتج وقد سبق وصفها أيون من LV-3xflag-LRRK1 / 2 15.
    5. عندما الخلايا هي 80-100٪ متموجة (حوالي 48 ساعة بعد ترنسفكأيشن أو تنبيغ)، وشطف الخلايا مع prewarmed (37 درجة مئوية) DMEM دون الفوسفات.
  2. خلايا التسمية مع 32-P-أورثو فوسفات.
    1. نأخذ في الاعتبار المبادئ العامة للسلامة عند العمل مع الإشعاع.
      1. figure-protocol-4809 أداء جميع العمليات مع 32 P في منطقة الإشعاع المعينة.
      2. figure-protocol-5044 يجب ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة - بموجب إجراءات التشغيل القياسية في مختبرنا وتشمل هذه معطف المختبر، والقفازات ونظارات واقية مزدوجة.
      3. ز "سرك =" / files/ftp_upload/50523/50523rad1.jpg "/> كل عمل مع 32 P يجب أن تكون محمية من المستخدمين عن طريق شاشات 6 مم البرسبيكس لتقليل التعرض.
      4. figure-protocol-5561 وينبغي دائما أجهزة الرصد الشخصية استخدامها - ضمن KUL كل شهادة المستخدم الإشعاع مفتوحة المصدر يرتدي شارة الفيلم تعلق على الجيب الأمامي للصدر من معطف المختبر لمراقبة التعرض للإشعاع أثناء التجارب.
      5. figure-protocol-5926 ينبغي تقييم جميع الأسطح تجريبية لالإشعاعي قبل وبعد الاستعمال مع عداد جيجر.
      6. figure-protocol-6172 يجب التخلص من جميع المواد الاستهلاكية يحتمل أن تكون ملوثة من في الالتزام الصارم بالمبادئ التوجيهية المؤسسية لراالتخلص من النفايات dioactive.
    2. تحت تدفق الصفحي، وإعداد أنبوب فالكون مع 2.1 مل من DMEM دون الفوسفات (prewarmed إلى 37 درجة مئوية) في لوحة 6 جيدا من الخلايا لالتسمية.
      1. على سبيل المثال، إلى خلايا التسمية في جميع الآبار من لوحة 6 جيدا، وإعداد 12.6 مل المتوسطة (= 6 × 2.1). هذا هو لتوفير 2 مل المتوسطة لاستخدامها في 6 جيدا لوحة جيدا من الخلايا الزائدة مع 5٪ من حيث الحجم.
    3. figure-protocol-6978 إعداد مقاعد البدلاء التي سيتم تنفيذ التجارب مع الإشعاعات المؤينة. يتم تغطية مساحة العمل التي حصيرة التسرب الذي تقوم عليه يتم وضع بطانة واقية من مادة ماصة. في حال كنت تستخدم بطانة مع سطح ماء واحد، وضعه مع الجانب ماصة تصل.
    4. figure-protocol-7370 توفر أيضا لجرة البرسبيكس على مساحة العمل ووضع أنبوب من الفوسفات المتوسطة حرة في ذلك.
    5. figure-protocol-7626 اتخاذ الحاوية اصطف الرصاص مع القارورة من 32 الفوسفاتية P المسمى من الثلاجة وجعله على مقاعد البدلاء النشاط الإشعاعي. مراقبة الحاويات عن التلوث الإشعاعي الخارجي باستخدام عداد جيجر.
    6. figure-protocol-7987 تمييع 32 P المسمى الفوسفاتية في أنبوب من DMEM دون الفوسفات بتركيز 24 μCi / مل.
      1. ملاحظة: في 2 مل لكل لوحة 6 جيدا جيدا من الخلايا، وهذا يتوافق مع 5 μCi 32 P المسمى الفوسفاتية / سم 2 من الخلايا المستزرعة.
      2. figure-protocol-8481 احتفظأنبوب في جرة البرسبيكس.
    7. figure-protocol-8691 إغلاق الحاوية مع ما تبقى من 32 ف المسمى الفوسفاتية واستبدال في الثلاجة.
    8. figure-protocol-8945 إزالة 6 لوحات جيدة مع الخلايا ليكون المسمى من الحاضنة ومكان على مقاعد البدلاء النشاط الإشعاعي.
    9. figure-protocol-9211 إزالة طاف المتوسطة وتجاهل. إضافة 2 مل من المتوسط ​​خالية من الفوسفات التي تحتوي على 32 P المسمى الفوسفاتية / جيد.
    10. figure-protocol-9507 وضع لوحات الثقافة في مربع البرسبيكس ثم مراقبة الحاويات FOص التلوث الإشعاعي الخارجي باستخدام عداد جيجر.
    11. figure-protocol-9781 نقل مربع البرسبيكس مع الخلايا إلى حاضنة خلية حقيقية النواة مخصص لوضع العلامات الأيضية النظائر.
    12. figure-protocol-10047 احتضان لمدة 1-20 ساعة عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2.
      1. بشكل عام، ينصح الوقت إدماج 3 ساعة أو أكثر. يمكن تقييم فترة حضانة الأمثل من خلال التجارب بالطبع الوقت لكل بروتين معين كما تريد.
    13. figure-protocol-10507 اختياري: علاج الخلايا مع المجمع.
      1. في التجارب مع العلاج المركب (مثل مثبط كيناز)، يتم تضمين خطوة العلاج المركب بعد فيitial فترة حضانة دون مركب للسماح لوضع العلامات. بعد فترة حضانة المطلوب، يتم إزالة مربع البرسبيكس تحتوي على لوحات ثقافة من الحاضنة وتقديمهم إلى مقاعد البدلاء النشاط الإشعاعي.
      2. figure-protocol-11055 تتم إزالة وسم المتوسطة والاستعاضة عنها prewarmed المتوسطة حرة الفوسفات الذي يتم تخفيفه المجمع في التركيز المطلوب. تجاهل المتوسطة في أنبوب 50 مل لجمع النفايات التي يتم وضعها في جرة البرسبيكس.
      3. figure-protocol-11417 يتم استبدال الخلايا في مربع البرسبيكس وضعها في حاضنة الخلية للمرة الاسم المطلوب.
  3. figure-protocol-11689 جمع لست] من ابيخلايا بقيادة الولايات المتحدة.
    1. figure-protocol-11945 إزالة متوسطة من الخلايا وتجاهل في أنبوب جمع النفايات التي يتم وضعها في جرة البرسبيكس.
    2. figure-protocol-12202 شطف الخلايا 2X مع الثلج الباردة TBS (50 ملي تريس، 150 ملي مول كلوريد الصوديوم، ودرجة الحموضة 7.4، 2 مل / شطف)، ونبذ الحل شطف في أنبوب جمع النفايات وضعت في جرة البرسبيكس.
    3. figure-protocol-12543 إضافة 0.5 مل من الجليد الباردة مناعي (IP) تحلل العازلة إلى كل بئر وجمع المحللة من قبل pipetting المحللة صعودا وهبوطا من أجل تخفيف جميع الخلايا هي lysed.
      1. إعداد حجم المطلوب من IP تحلل العازلة (0.5 مل / عينة بالإضافة إلى 5٪ الزائدة) في وقت مبكر، مضيفا كوكتيل البروتياز المانع والفوسفاتيزالمانع الكوكتيل الطازجة فقط قبل الاستخدام.
      2. تكوين تحلل العازلة هو 20 ملي تريس درجة الحموضة 7.5، 150 ملي مول كلوريد الصوديوم، EDTA 1 ملم، تريتون 1٪، الجلسرين 10٪، مثبط البروتياز الكوكتيل والفوسفاتيز المانع كوكتيل.
    4. figure-protocol-13359 نقل المحللة إلى أنبوب microcentrifuge واحتضان على الجليد لمدة 10 دقيقة على الأقل.
    5. figure-protocol-13612 الطرد المركزي لست] في microcentrifuge في> 5،000 x ج لمدة 10 دقيقة.
    6. figure-protocol-13850 التخلص من النفايات المشعة في حاويات النفايات المخصصة التي يتم تخزينها وراء الدروع البرسبيكس.

2. تحليل وصفها من البروتينات الهامة

  1. figure-protocol-14276 عزل بروتين من الفائدة بمقدار immunopurification (IP).
    1. figure-protocol-14540 نقل أنابيب microcentrifuge مع بالطرد المركزي لست] إلى الجليد وماصة طاف في أنبوب microcentrifuge تحتوي على 10 ميكرولتر حجم سرير من معايرتها الخرز الاغاروز العلم-M2.
      1. إعداد أنابيب مع العلم معايرتها-M2 الخرز الاغاروز في وقت مبكر.
      2. لهذا، ماصة وبلغ حجم التداول العلم-M2 الطين الاغاروز الموافق 10 ميكرولتر حجم سرير لكل عينة، بالإضافة إلى فائض بنسبة 5٪.
        1. عموما، حجم السرير 10 ميكرولتر من الخرز يتوافق مع 20 ميكرولتر الطين. الرجوع إلى ورقة بيانات المنتج لمزيد من التفاصيل.
      3. تتوازن حبات من قبل الشطف 3X في 10 مجلدات (نسبة إلى حجم السرير) من تحلل العازلة IP.
      4. توزيع حبات معايرتها بالتساوي في 10 ميكرولتر حجم السرير / أنبوب في العديد من الأنابيب كما أن هناك عينات. تسمية أنابيب مع معرف لكل عينة.
    2. figure-protocol-15745 نقل أنابيب microcentrifuge إلى 50 مل أنابيب (حوالي 6 ميكروسنتريفوج tubes/50 أنبوب مل) المسمى مع رمز البرسيم المشعة والحفاظ على الجليد.
    3. figure-protocol-16051 عينات نقل إلى جهاز الدوران وراء درع البرسبيكس في مجال معين من غرفة باردة لأكثر من نهاية نهاية الاختلاط في 4 درجات مئوية لمدة 1-20 ساعة.
    4. figure-protocol-16358 نقل العينات إلى مساحة العمل المعينة على الجليد.
    5. 50523rad1highres.jpg "سرك =" / files/ftp_upload/50523/50523rad1.jpg "/> تدور باستمرار البروتين ملزمة الخرز الاغاروز-M2 العلم في microcentrifuge (1،000 x ج، 1 دقيقة) وتجاهل طاف في أنبوب جمع النفايات.
    6. figure-protocol-16825 غسل البروتين ملزمة العلم-M2 الخرز الاغاروز عن طريق إعادة التعليق في 1 غسل العازلة مل IP.
      1. تكوين غسل العازلة IP: 25 ملي تريس درجة الحموضة 7.5، كلوريد الصوديوم 400 ملم، تريتون 1٪. فمن المستحسن أن تشمل أيضا البروتيني والفوسفاتيز مثبطات في غسل العازلة للبروتينات حساسة للتدهور من قبل البروتياز شارك في تنقية أو لنزع الفسفات بواسطة phosphatases شارك في تنقية.
      2. figure-protocol-17439 تدور باستمرار البروتين ملزمة العلم-M2 الخرز الاغاروز في microcentrifuge (1،000 x ج، 1 دقيقة) وتجاهل طاف في جامعي النفاياتنشوئها الأنبوب.
      3. figure-protocol-17747 كرر الخطوة غسل 3X.
    7. figure-protocol-17947 بعد يغسل، resuspend والخرز في 1 مل IP شطف العازلة (تريس 25 ملم ودرجة الحموضة 7.5، MgCl 2 10 ملي، dithiothreitol (DTT) 2 مم، 0.02٪ تريتون، بيتا جليسروفوسفات 5 ملم، نا 3 VO 4 0.1 ملم).
    8. figure-protocol-18334 تدور باستمرار البروتين ملزمة الخرز الاغاروز-M2 العلم في microcentrifuge (1،000 x ج، 1 دقيقة) وتجاهل طاف في أنبوب جمع النفايات. إزالة كافة العازلة الزائدة.
    9. figure-protocol-18660 Resuspend الخرز في 40 م وش، ل IP من عينة العازلة SDS التحميل (تريس، حمض الهيدروكلوريك 160 ملم ودرجة الحموضة 6.8، SDS 2٪، 0.2 M DTT، الجلسرين 40٪، برموفينول الأزرق 2 ملغ / مل).
      1. ويمكن تحليل عينات مباشرة أو تخزينها في الفريزر -20 درجة مئوية لتحليل خفية.
        1. figure-protocol-19210 لتخزين العينات في -20 درجة مئوية، ومكان العينات في أصحاب أنبوب أو مربعات في مربع البرسبيكس في الفريزر رمزا البرسيم المشعة وصفت مخصصة لتخزين العينات المشعة.
    10. figure-protocol-19557 التخلص من النفايات المشعة في حاويات النفايات المخصصة التي يتم تخزينها وراء الدروع البرسبيكس.
  2. figure-protocol-19831 لحل عينات IP عبر SDS-PAGE وBLOر إلى غشاء PVDF.
    1. figure-protocol-20088 عينات الحرارة في المخزن التحميل إلى 95 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في> 1،000 x ج لتكوير الخرز.
    2. figure-protocol-20385 تحضير هلام بروتين حدة الكهربائي على مقاعد البدلاء النشاط الإشعاعي وراء حجاب البرسبيكس.
    3. figure-protocol-20643 عينات تحميل الصعود إلى 3-8٪ خلات تريس المواد الهلامية SDS-PAGE.
      1. يناسب هذا النوع من الجل لحسم عالية الوزن الجزيئي (HMW) البروتينات. ويمكن أيضا أن تكون مناسبة أنواع الجل أخرى، مثل 4-20٪ مكرر Tricine هلام أو تريس، جليكاين 4-20٪ المواد الهلامية.
      2. وتشمل علامة الوزن الجزيئي الذي هو مناسبة لتبين أحجام البروتينات HMW.
      4. <لى> figure-protocol-21236 أداء الكهربائي عند 150 V لمدة 1 ساعة.
    4. figure-protocol-21445 بعد الكهربائي، إزالة هلام من غلاف من البلاستيك ونقل الجل إلى حاوية مع ويسترن العازلة نقل النشاف.
      1. تكوين الغربية العازلة نقل النشاف: 50 ملي تريس، جليكاين 40 ملم، 0.04٪ SDS، الميثانول 20٪.
      2. figure-protocol-21891 قطع أجزاء من الهلام التي يلتزم بها مثل الفواصل جيدا والجزء السفلي من هلام التي تتمسك بها.
    5. إعداد واحد فلوريد البولي فينيل (PVDF) الغشاء في هلام عن طريق غمس في الميثانول لمدة 1 دقيقة، ثم وضع في المخزن نقل.
      1. يتم قطع الأغشية إلى ليالي حجم AME مثل هلام زائد هامش 3 مم.
    6. وضع وحدة النشاف شبه الجافة على مقاعد البدلاء النشاط الإشعاعي وإزالة الغطاء العلوي من لوحة والقطب.
    7. figure-protocol-22638 إعداد شطيرة النشاف على سطح وحدة النشاف شبه الجافة.
      1. الرطب اضافية سميكة (2.5 مم، 7.5 × 10 سم كبيرة) مرشح النشاف في المخزن نقل ووضعت على لوحة أسفل وحدة النشاف.
      2. figure-protocol-23055 وضع غشاء PVDF ما قبل الرطب على مرشح النشاف.
      3. figure-protocol-23270 وضع بعناية الجل على الغشاء PVDF وإزالة أي فقاعات الهواء.
      4. 523/50523rad1highres.jpg "سرك =" / files/ftp_upload/50523/50523rad1.jpg "/> أكمل شطيرة صمة عار اضافية عن طريق تبليل عامل تصفية النشاف سميكة عازلة في نقل ومكان على لوحة أسفل وحدة النشاف. إزالة كل الهواء فقاعات الحالية في نهاية المطاف في شطيرة النشاف.
        يرجى ملاحظة أن الوصف الوارد هنا هو متوافق مع BIORAD عبر صمة عار نظام SD حيث الأقطاب الكهربائية هي تلك التي البروتينات تهاجر نحو الأسفل على الغشاء. نظم النشاف الأخرى هي أيضا متوافقة مع هذه الخطوات مع تعديلات طفيفة مثل تلك المطلوبة في نهاية المطاف إلى أن تأخذ في الاعتبار اتجاه آخر النشاف، أو في حالة النشاف دبابات، والنفايات السائلة اضافية ليتم التخلص منها في نفس الطريقة كما العازلة الكهربائي أعلاه.
    8. figure-protocol-24214 إزالة كافة العازلة الزائدة مع الأنسجة ماصة ووضع لوحة أعلى وغطاء شبه د راي النشاف وحدة.
    9. figure-protocol-24478 نقل البروتينات في 15 V لمدة 1-2 ساعة.
    10. figure-protocol-24687 خلال هذا الوقت، وتنظيف وحدة الكهربائي.
      1. figure-protocol-24936 التخلص من النفايات المشعة في حاويات النفايات المخصصة التي يتم تخزينها وراء الدروع البرسبيكس.
      2. figure-protocol-25200 شطف وحدة الكهربائي مع الماء المقطر (AD) وتجاهل ماء الشطف في حاوية النفايات المشعة السائلة.
    11. 0523/50523rad1.jpg "/> بعد نقل، وإزالة الغشاء PVDF مع البروتينات نشف من وحدة النشاف.
    12. figure-protocol-25613 اختياري: إجراء تلطيخ الشقائقية S من البروتينات نشف لتصور البروتينات.
      1. figure-protocol-25892 نقل وصمة عار لسفينة الحضانة وصمة عار الضحلة التي تحتوي على الشقائقية S حل واحتضان لمدة 5 دقائق.
      2. figure-protocol-26159 شطف 2X بسرعة في م.
    13. figure-protocol-26359 يجف الغشاء.
  3. / files/ftp_upload/50523/50523rad1.jpg "/> إجراء تصوير الإشعاع الذاتي.
    1. figure-protocol-26711 تعرض الغشاء إلى لوحة تفسفر لمدة 1-5 أيام.
    2. figure-protocol-26924 قراءة 32P الخروج من لوحة تفسفر يتعرض باستخدام العاصفة 840 تفسفر الماسح الضوئي أو ما يعادلها وحفظ الصورة باعتبارها عالية الدقة شجار.
  4. figure-protocol-27237 الكشف عن مستويات البروتين عبر مناعي.
    1. figure-protocol-27484 ترطيب الأغشية عن طريق غمس منهم لفترة وجيزة في الميثانول، ثم نقل إلى الضحلة وصمة عار سفينة الحضانة مع برنامج تلفزيوني.
    2. figure-protocol-27774 منع الأغشية في برنامج تلفزيوني-T (PBS مع 0.1٪ تريتون) التي تحتوي على الحليب 5٪.
    3. figure-protocol-28025 احتضان البقع مع المضادة للLRRK2 الأجسام المضادة أو مكافحة 13،16 الضد العلم وعملية أخرى مع الخطوات المناسبة وغسل الحضانة الضد الثانوية.
    4. figure-protocol-28342 تنفيذ الكشف لمعان كيميائي للتأكد من مستويات البروتين النسبية LRRK2.
  5. تحديد إدماج 32 P في LRRK2.
    1. إجراء تحليل الكثافة من العصابات على autoradiograms وصمة عار وتفاعلية مناعية باستخدام البرمجيات المناسبة مثل يماغيج البرمجيات، وبرنامج مجاني متوفر على Instit الوطنية[أوتس الصحة الانترنت ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ ).
    2. حساب مستويات التأسيس الفوسفات كما أن نسبة إشارة autoradiographic على مستوى مناعية.

النتائج

من أجل مقارنة مستويات الفسفرة العام للLRRK1 وLRRK2 في الخلايا، الموسومة 3xflag LRRK1 وأعرب عن LRRK2 في الخلايا HEK293T 15. كانت الخلايا المستزرعة في 6 لوحات جيدة والمسمى مع 32 P وتحليلها كما هو موضح أعلاه في نص البروتوكول. الشكل 1 يبين نتائج ممثلة لوضع العلامات الأيضي?...

Discussion

تقدم هذه الورقة بروتوكول الأساسية لمعايرة مستوى الفسفرة العام للLRRK1 وLRRK2 في خطوط الخلايا باستخدام وضع العلامات الأيضية مع 32 P-الفوسفاتية. الاستراتيجية الشاملة واضح ومباشر. الموسومة تقارب يتم التعبير عن البروتينات في الخلايا LRRK HEK293T التي يتعرض لها والمتوسطة الت...

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgements

ونحن ممتنون أيضا لمؤسسة فوكس J. مايكل دعم هذه الدراسة. نشكر مؤسسة أبحاث - فلاندرز FWO (مشروع FWO G.0666.09، وكبار الزمالة الباحث إلى فريق الرصد المشترك)، وIWT SBO/80020 المشروع العصبية الهدف، وجامعة لوفين الكاثوليكية (OT/08/052A وIOF-KP/07 / 001) لدعمهم. وأيد هذا البحث أيضا في جزء من صندوق Druwé-Eerdekens تدار من قبل مؤسسة الملك بودوان لفريق الرصد المشترك.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Phosphorus-32 Radionuclide, 1 mCi, buffer disodiumphosphate in 1 ml waterPerkin ElmerNEX011001MC
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (D-MEM) (1X), liquid (high glucose)Invitrogen11971-025This medium contains no phosphates
Anti Flag M2 affiinty gelSigmaA2220For an equivalent product with red colored gel (useful to more easily visualize the beads), use cat. No. F2426.
Extra thick blotting filterBio-Rad1703965
Ponceau S solutionSigmaP7170

References

  1. Hanafusa, H. Leucine-rich repeat kinase LRRK1 regulates endosomal trafficking of the EGF receptor. Nat Commun. 2, 158 (2011).
  2. Titz, B., et al. The proximal signaling network of the BCR-ABL1 oncogene shows a modular organization. Oncogene. 29, 5895-5910 (2010).
  3. Cookson, M. R. The role of leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) in Parkinson's disease. Nat Rev Neurosci. 11, 791-797 (2010).
  4. Taymans, J. M., Cookson, M. Mechanisms of dominant parkinsonism; the toxic triangle of LRRK2, alpha-synuclein and tau. Bioessays. 32, 227-235 (2010).
  5. Lewis, P. A. The function of ROCO proteins in health and disease. Biol Cell. 101, 183-191 (2009).
  6. Marin, I., van Egmond, W. N., van Haastert, P. J. The Roco protein family: a functional perspective. FASEB J. 22, 3103-3110 (2008).
  7. Marin, I. The Parkinson disease gene LRRK2: evolutionary and structural insights. Mol.Biol.Evol. 23, 2423-2433 (2006).
  8. Marin, I. Ancient origin of the Parkinson disease gene LRRK2. J Mol Evol. 67, 41-50 (2008).
  9. Lobbestael, E., Baekelandt, V., Taymans, J. M. Phosphorylation of LRRK2: from kinase to substrate. Biochem Soc Trans. 40, 1102-1110 (2012).
  10. Gloeckner, C. J., et al. Phosphopeptide Analysis Reveals Two Discrete Clusters of Phosphorylation in the N-Terminus and the Roc Domain of the Parkinson-Disease Associated Protein Kinase LRRK2. J Proteome Res. 9, 1738-1745 (2010).
  11. Nichols, R. J., et al. 14-3-3 binding to LRRK2 is disrupted by multiple Parkinson's disease-associated mutations and regulates cytoplasmic localization. Biochem J. 430, 393-404 (2010).
  12. Greggio, E., et al. Mutations in LRRK2/dardarin associated with Parkinson disease are more toxic than equivalent mutations in the homologous kinase LRRK1. J.Neurochem. 102, 93-102 (2007).
  13. Taymans, J. M. LRRK2 Kinase Activity Is Dependent on LRRK2 GTP Binding Capacity but Independent of LRRK2 GTP Binding. PLoS One. 6, 23207-23 (2011).
  14. Daniëls, V. Insight into the mode of action of the LRRK2 Y1699C pathogenic mutant. J Neurochem. 116, 304-315 (2011).
  15. Civiero, L. Biochemical characterization of highly purified leucine-rich repeat kinases 1 and 2 demonstrates formation of homodimers. PLoS One. 7, e43472 (2012).
  16. Taymans, J. M., Van den Haute, C., Baekelandt, V. Distribution of PINK1 and LRRK2 in rat and mouse brain. J.Neurochem. 98, 951-961 (2006).
  17. Lewis, P. A. Assaying the kinase activity of LRRK2 in vitro. J Vis Exp. , (2012).
  18. Lobbestael, E. Immunohistochemical detection of transgene expression in the brain using small epitope tags. BMC Biotechnol. 10, 16 (2010).
  19. Davies, P., et al. Comprehensive Characterization and Optimization of Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) Monoclonal Antibodies. Biochem J. , (2013).
  20. West, A. B. Parkinson's disease-associated mutations in LRRK2 link enhanced GTP-binding and kinase activities to neuronal toxicity. Hum.Mol.Genet. 16, 223-232 (2007).
  21. Sheng, Z., et al. Ser1292 autophosphorylation is an indicator of LRRK2 kinase activity and contributes to the cellular effects of PD mutations. Sci Transl Med. 4, 164ra161 (2012).
  22. Li, X., et al. Phosphorylation-dependent 14-3-3 binding to LRRK2 is impaired by common mutations of familial Parkinson's disease. PLoS One. 6, e17153 (2011).
  23. Dzamko, N., et al. Inhibition of LRRK2 kinase activity leads to dephosphorylation of Ser(910)/Ser(935), disruption of 14-3-3 binding and altered cytoplasmic localization. Biochem J. 430 (910), 405-413 (2010).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

79 LRRK1 LRRK2 32P

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved