富亮氨酸的代谢标记重复激酶1和2与放射性磷酸盐

摘要

富含亮氨酸的重复激酶1和2（LRRK1和LRRK2）是多结构域蛋白，其编码GTP酶都和激酶结构域和它们磷酸化的细胞中。在这里，我们提出了一个协议，以^32磷正磷酸盐标记LRRK1和LRRK2的细胞，从而提供衡量其整体的细胞磷酸化水平的一种手段。

摘要

富含亮氨酸的重复激酶1和2（LRRK1和LRRK2）是旁系同源物共享一个类似的结构域组织，包括丝氨酸 - 苏氨酸激酶结构域，复杂的蛋白质结构域的RAS（ROC），ROC域（COR）的C-末端，和富含亮氨酸和锚蛋白样重复的N-末端。 LRRK1和LRRK2的确切蜂窝作用还没有被阐明，但LRRK1有牵连的酪氨酸激酶受体信号^1,2，而LRRK2被牵连在帕金森病^3,4的发病机制。在这份报告中，我们提出了一个协议来标记LRRK1和LRRK2的蛋白质在细胞中与^32磷正磷酸盐，从而提供测量这些2蛋白在细胞中的整体磷酸化水平的一种手段。简言之，亲和标签的LRRK蛋白被表达在HEK293T细胞暴露于含³² P-正磷酸盐介质。的³² P-正磷酸盐的细胞之后被吸收只有几孵化小时，在含有磷酸盐在细胞的所有分子，从而放射性标记。通过亲和标签（3XFLAG）的LRRK蛋白通过免疫沉淀从其它细胞组分中分离。免疫沉淀，然后通过SDS-PAGE分离，印迹到PVDF膜上，并掺入的磷酸盐的分析是通过放射自显影对印迹的蛋白质^{（32 p}信号）和western检测（蛋白信号）进行的。该协议可以很容易地适于监测磷酸化，可以在细胞中表达和分离免疫沉淀的任何其他蛋白质。

引言

富含亮氨酸重复激酶1和2（LRRK1和LRRK2）是多域的旁系同源共享一个类似的结构域组织。这两个蛋白编码GTP酶的序列类似的Ras家族GTP酶（的Ras复合物的蛋白质，或者ROC）的以及ROC域（COR）的C-末端，从而有效地划分这两种蛋白的ROCO蛋白家族^5,6。中华民国-COR域串联的N端，这两个蛋白编码一个富含亮氨酸重 ​​复结构域以及一个锚蛋白样结构域，而只有LRRK2基因编码一个额外的犰狳domein ^6-8。 ROC-COR的C-末端，这两个蛋白共享一个丝氨酸-苏氨酸激酶结构域，而只有LRRK2编码的C-末端区⁸一WD40结构域。 LRRK1和LRRK2的确切蜂窝作用还没有被阐明，但LRRK1有牵连的酪氨酸激酶受体信号^1,2，而遗传证据表明，对LRRK2在帕金森病^3,4的发病机制中的作用。

蛋白质的磷酸化是细胞中一种常见的监管机制。例如，磷酸化可能是必需的酶的活化或蛋白质的募集到信令复杂。 LRRK2的细胞磷酸化已被广泛表征和phosphosite映射已经表明大多数的细胞磷酸化位点发生在锚蛋白重复和富亮氨酸重 ​​复结构域^9-11之间的集群。虽然LRRK1细胞磷酸化位点还没有被映射，利用免疫沉淀LRRK1蛋白质印迹的磷蛋白染色从COS7细胞的研究的证据表明，LRRK1蛋白被磷酸化的细胞^12。

本文提供了一个基本协议，使用代谢标记与³² P-正磷酸盐测定LRRK1和LRRK2的总体磷酸化水平的细胞系。总体战略是直截了当的。亲和标记LRRK保护制服插件均以HEK293T细胞，这些细胞暴露于含³² P-正磷酸盐媒体。的³² P-正磷酸盐的细胞只有几个小时的潜伏期和在含磷酸盐的小区中的所有分子之后被吸收，从而被放射性标记。亲和标签（3XFLAG），然后用于通过免疫沉淀来分离从其它细胞组分的LRRK蛋白质。免疫沉淀，然后通过SDS-PAGE分离，印迹到PVDF膜上，并掺入的磷酸盐的分析是通过放射自显影对印迹的蛋白质^{（32 p}信号）和western检测（蛋白信号）进行的。

研究方案

本协议使用的放射性³² P标记的磷酸盐遵循LRRK2的细胞磷酸化。承担重要的是记住，使用放射性试剂的所有操作，应使用适当的防护措施，尽量减少放射性辐射暴露于操作者和环境下进行。该发射电离辐射的含同位素化合物可能是有害的在制度和国家层面控制它们的使用对人类健康和严格的许可证制度和法规。在此协议中的实验进行了以下培训开源辐射利用在天主教鲁汶大学（KU鲁汶），并按照健康，安全和环境部门在大学所提供的良好实验室实践指南。在我们的协议几个步骤被广泛部署，如细胞培养，SDS-PAGE电泳，免疫印迹和这里给出的是协议的细节，应用在我们的实验室。它should指出的是，精确的实验条件变化从实验室到实验室，因此具体措施，以确保放射性物质的适当的处理应适应每个新的实验室环境中。

使用开源的辐射是须事先监管部门的批准，并负责实验室研究开源辐射监管机构各不相同，从国家到国家。用户应以确保程序符合法规和地方性法规与制度辐射安全主任咨询。对监管机构的信息可以发现：在比利时，联邦核管制局（ http://www.fanc.fgov.be ，网站在法国或荷兰），在英国，健康与安全执行局（ HTTP： / / www.hse.gov.uk /辐射/电离/的index.htm ），在美国国统会李尔监督管理委员会（ http://www.nrc.gov/materials/miau/regs-guides-comm.html ），在加拿大加拿大核安全委员会（ http://nuclearsafety.gc.ca/eng/ ），和在德国达斯Bundesamt献给Strahlenschutz（ http://www.bfs.de/de/bfs ）。有关该协议的安全防范措施已经注意到的文字，突出了放射性的三叶符号（ ）。

1。细胞的代谢标记

1. 准备细胞进行标记。
   1. 根据标准培养条件下培养转染HEK293T细胞系（37℃，5％CO _2）的DMEM中，用8％胎牛血清和庆大霉素。
   2. 充分扩大细胞获得每个样品至少为1×10 ⁶个细胞来测试。
   3. 胰蛋白酶消化细胞和积垢到6孔培养板（直径为35毫米）以10 ⁶个细胞/孔。
   4. 镀出细胞后24小时，通过转染或慢病毒载体介导的转导表达3XFLAG-LRRK2蛋白。
      1. 对于转染，每样品4微克DNA（pCHMWS-3XFLAG-LRRK2质粒^13-15或pCHMWS-3XFLAG-LRRK1质粒^15）和8微升的线性聚乙烯亚胺（PEI线性，1毫克/毫升）至80μl的DMEM中混合（不加）。允许复杂的15-30分钟，然后通过混合早已进入介质存在，加上复杂的细胞。
      2. 对于慢病毒载体介导的转导，稀慢病毒载体编码3XFLAG-LRRK1或-2（LV-3XFLAG-LRRK1，LV-3XFLAG-LRRK2，作为一个经验法则，转导与两倍的传感单元， 即功能性载体颗粒数，慢病毒的，因为有细胞）到培养基中。对产品的描述 LV-3XFLAG-LRRK1 / 2的离子先前已经描述的^15。
   5. 当细胞是80-100％汇合（约48小时转染或转导后），冲洗细胞用预热（37℃）的DMEM不含磷酸盐。
2. 标签的细胞用³² P-正磷酸盐。
   1. 放射工作时保持在安全性心态一般原则。
      1. 执行所有操作，用³² P在指定的辐射区。
      2. 合适的个人防护装备应戴 - 根据本实验室的标准操作程序其中包括实验室外套，双层手套和护目镜。
      3. G“SRC =”/ files/ftp_upload/50523/50523rad1.jpg“/>用³² P所有的工作应该从用户屏蔽6mm的有机玻璃屏幕，以减少风险。
      4. 个人监测装置应始终使用 - KUL内所有经认证的开放源码的辐射用户佩戴贴在白大褂在实验过程中，监察辐射暴露的上衣口袋电影徽章。
      5. 所有实验表面应使用盖革计数器使用前后进行评估放射性。
      6. 所有可能受到污染的消耗品应严格遵守对RA机构准则加以处置dioactive废物处理。
   2. 在层流，每6孔板细胞的准备猎鹰管2.1毫升的DMEM不含磷酸盐（预热至37℃）的标签。
      1. 例如，为了标记细胞在6孔板的各孔中，制备12.6毫升介质（= 6×2.1）。这是为每细胞的6孔培养板孔中使用具有5％过量的体积为2ml培养基中。
   3. 准备在它与电离辐射的实验将进行替补。工作空间覆盖有溢出垫赖以吸收材料的保护衬垫被放置。如果您使用的是内胆具有一个防水的表面，将其与吸收剂的一面朝上。
   4. 还提供了在工作​​空间中的有机玻璃罐，并放置无磷培养基的试管中它。
   5. 带头容器内衬以³² P标记的正磷酸盐的小瓶从冰箱中取出，并把它的放射性板凳。监测容器用盖革计数器外部放射性污染。
   6. 稀释³² P标记的正磷酸盐成的DMEM管子不含磷酸盐在24微居里/ ml的浓度。
      1. 注意：在每6孔板加入2ml良好的细胞，这对应于5微居里³²培养细胞的P标记的正磷酸盐/厘米^2。
      2. 保持该管在有机玻璃罐子。
   7. 关闭容器与³² P标记的正磷酸盐的剩余部分，并取代在冰箱里。
   8. 用细胞从放射性长凳上的培养箱和地方标记取出6孔板中。
   9. 去除培养基上清液并丢弃。加入2毫升磷酸盐的培养基中含有³² P标记的正磷酸盐/孔。
   10. 将培养板成有机玻璃框，然后监视容器FOR外部放射性污染用盖革计数器。
   11. 与细胞转移的有机玻璃框，真核细胞培养箱致力于同位素代谢标记。
   12. 在5％CO ₂孵育1-20小时，在37℃。
       1. 在一般情况下，3小时或更多的时间内制建议。最佳孵育时间可通过时间过程实验为每个特定的蛋白质随意进行评估。
   13. 可选：治疗细胞的化合物。
       1. 在用化合物治疗（如激酶抑制剂）的实验中，化合物处理步骤包括一个在后免除expat原始温育时间而不化合物，以允许标记。后所需的温育时间，含有该培养板的有机玻璃盒从培养箱中取出，并提请放射性台上。
       2. 标签介质被移走，并用预热的磷酸盐培养基到其中的化合物稀释成期望的浓度。在50ml管中收集废物被放置在有机玻璃罐丢弃培养基。
       3. 细胞被取代的有机玻璃箱并放置在细胞培养箱中培养所需的接触时间。
3. 收集拉贝的裂解液导致细胞。
   1. 从细胞中除去培养基，并丢弃到被放置在有机玻璃罐废液收集管。
   2. 漂洗细胞2倍用冰冷的TBS液（Tris 50mM的，氯化钠150毫米，pH值为7.4，将2ml /漂洗），废弃清洗液导入废液收集管放置在有机玻璃罐子。
   3. 添加0.5冰冷的免疫沉淀（IP）的裂解缓冲液到每个孔中，并通过移液裂解物上下以松开所有溶解的细胞裂解物中收集。
      1. 备的IP裂解缓冲液（0.5毫升/样品加5％过量）的时间提前了所需体积，加入蛋白酶抑制剂和磷酸抑制剂混合物使用前新鲜。
      2. 裂解缓冲液的组成为的Tris 20mM的pH值为7.5，NaCl的150mM的，EDTA 1mM的，加入Triton 1％，甘油10％，蛋白酶抑制剂混合物和磷酸酶抑制剂混合物。
   4. 溶胞产物转移到微量离心管中并在冰上孵育至少10分钟。
   5. 离心机在微量离心裂解物在> 5000×g离心10分钟。
   6. 其中存储的背后有机玻璃防护罩专用垃圾箱处置放射性废物。

2。分析利息的蛋白质标记

1. 通过免疫纯化（IP）隔离感兴趣的蛋白质。
   1. 转的离心管中离心裂解液回冰和吸取上清液到含有的平衡旗M2琼脂糖珠10微升床体积的离心管。
      1. 准备用管平衡标志-M2琼脂糖提前珠。
      2. 为此，吸移管对应于每个样品10μl的床体积加5％的过量旗M2琼脂糖浆的体积。
         1. 通常，珠的10微升床体积相当于20微升浆料。请参阅产品数据表更多的细节。
      3. 通过在IP裂解缓冲液10体积（相对于床体积）漂洗3次平衡珠。
      4. 均匀分布平衡珠在10微升床体积/管进入尽可能多管，因为有样本。标签的试管与标识符对于每个样品。
   2. 转移的微量离心管中，以50ml试管（约6个离心tubes/50毫升管）标记有放射性​​的三叶符号并保持在冰上。
   3. 样品转移到后面的有机玻璃防护罩在了年底，在4℃下搅拌1-20小时的冷室端的指定区域中的旋转装置。
   4. 转移样品在冰上指定的工作空间。
   5. 50523rad1highres.jpg“的src =”/ files/ftp_upload/50523/50523rad1.jpg“/>降速在微量离心（1,000×g离心，1分钟）的约束旗M2琼脂糖珠蛋白，弃上清到废物收集管。
   6. 通过重新悬浮于1ml的IP洗涤缓冲液洗蛋白结合旗M2琼脂糖珠。
      1. 知识产权洗涤缓冲液组成：三25 mM的pH值为7.5，氯化钠400毫米，海卫1％。这是推荐还包括蛋白酶和磷酸酶抑制剂的蛋白质通过共纯化的蛋白酶或去磷酸化通过共纯化的磷酸酶的降解敏感的洗涤缓冲液。
      2. 降速在微量蛋白结合的标志-M2琼脂糖珠（1,000×g离心，1分钟），弃上清到一个废集电极料管。
      3. 重复洗涤步骤3倍。
   7. 在洗涤后，重悬珠在1ml的IP漂洗缓冲液（Tris 25mM的pH为7.5，MgCl ₂的10mM的二硫苏糖醇（DTT）的2毫米，加入Triton 0.02％，β-甘油磷酸的5mM，钠₃ VO ₄ 0.1毫摩尔）。
   8. 降速在微量蛋白结合的标志-M2琼脂糖珠（1,000×g离心，1分钟），弃上清到一个垃圾收集管中。去除所有多余的缓冲区。
   9. 重悬珠到40＆Mü;升的IP样品的SDS上样缓冲液（Tris-盐酸160毫pH为6.8，SDS 2％，DTT的0.2M，甘油40％，溴酚蓝2毫克/毫升）。
      1. 样品可以立即分析或​​存储在-20℃下冷冻险恶分析。
         1. 对于样品储存在-20℃下，放置样品中在一个专门储存放射性样品的放射性的三叶符号标记的冰柜的有机玻璃箱管夹持器或盒。
   10. 其中存储的背后有机玻璃防护罩专用垃圾箱处置放射性废物。
2. 通过SDS-PAGE和BLO解析IP样本吨至PVDF膜。
   1. 在加样缓冲液的样品热到95℃持续2分钟并离心在> 1,000 XG以沉淀珠1分钟。
   2. 准备后面的有机玻璃屏幕的放射性板凳上的蛋白质凝胶电泳模块。
   3. 负载样品到3-8％Tris-醋酸SDS-PAGE凝胶。
      1. 这种类型的凝胶适合于解决高分子量（HMW）的蛋白质。其他类型的凝胶，也可以适用，如4-20％双 - 甲基甘氨酸凝胶或的Tris-甘氨酸4-20％的凝胶。
      2. 包括分子量标记物是适合于辨别HMW蛋白的大小。
   4. 进行电泳在150V 1小时。
   5. 电泳后，从其塑胶外壳中取出凝胶，凝胶转移至与Western印迹转印缓冲液的容器。
      1. Western印迹转印缓冲液的组成：三50毫米，甘氨酸40毫米，SDS 0.04％，甲醇20％。
      2. 切断而伸出，如井分离器和该伸出的凝胶底部凝胶的部位。
   6. 每凝胶制备1聚偏二氟乙烯（PVDF）膜浸渍在甲醇中，持续1分钟，然后放置在转移缓冲液。
      1. 膜切到S火焰大小的凝胶加为3mm的余量。
   7. 将半干印迹模块的放射性板凳上，取下盖板和上部电极板。
   8. 制备半干印迹模块的表面上的印迹三明治。
      1. 湿额外的厚（2.5毫米厚，7.5×10厘米大的）上的印迹模块底板印迹过滤器在转印缓冲液和地点。
      2. 放置在印迹过滤器的预湿PVDF膜上。
      3. 小心地将凝胶上的PVDF膜，并移除任何气泡。
      4. 523/50523rad1highres.jpg“SRC =”/ files/ftp_upload/50523/50523rad1.jpg“/>通过对印迹模块的底板润湿的超厚印迹过滤器在转印缓冲液和地点完成的印迹三明治。移除所有的空气最终出现在印迹夹层气泡。
         请注意，这里给出的描述中是使用BioRad公司反式印迹SD系统，其中的电极是这样的蛋白质向下迁移到膜相容。其他印迹系统也与细微调整，例如那些最终需要考虑另外印迹方向，或在罐印迹，额外废液以同样的方式与上述电泳缓冲液，以进行处置的情况下，这些步骤兼容。
   9. 去除所有多余的缓冲液与吸收剂组织和放置在顶板和半D的盖 RY印迹模块。
   10. 转移蛋白在15 V为1-2小时。
   11. 在此期间，清理电泳模块。
       1. 其中存储的背后有机玻璃防护罩专用垃圾箱处置放射性废物。
       2. 冲洗电泳模块用蒸馏水（AD），丢弃该冲洗水的放射性废液容器。
   12. 0523/50523rad1.jpg“/>转让后，取出PVDF膜从印迹模块印迹蛋白质。
   13. 可选：执行印迹蛋白质可视化蛋白质的丽春红S染色。
       1. 印迹转移到含有丽春红液浅印迹孵化器和孵化5分钟。
       2. 在公元迅速冲洗2倍。
   14. 干燥该膜。
3. / files/ftp_upload/50523/50523rad1.jpg“/>进行放射自显影。
   1. 揭露膜磷光板1-5天。
   2. 阅读32P关闭使用一个风暴840磷光扫描仪或等同的暴露磷光板和图像保存为高分辨率TIFF。
4. 通过免疫检测检测蛋白水平。
   1. 通过短暂浸泡成甲醇水化膜，然后转移到用PBS浅印迹孵化器。
   2. 阻止在PBS-T膜（PBS，0.1％的Triton）含有5％的牛奶。
   3. 孵育抗LRRK2抗体^13,16或用适当的洗涤步骤和二抗孵育抗旗抗体和工艺进一步的印迹。
   4. 进行化学发光检测，以确认LRRK2的相对蛋白水平。
5. 量化^32磷在LRRK2注册成立。
   1. 进行条带的密度分析使用适当的软件，如ImageJ的软件，在全国INSTIT提供一个免费程序的杂交放射自显影和免疫反应健康网站茨（ http://rsbweb.nih.gov/ij/ ）。
   2. 计算磷酸盐掺入量为放射自显影信号的过度免疫反应性水平的比率。

结果

为了在细胞中比较LRRK1和LRRK2的总体磷酸化水平，3XFLAG标签LRRK1和LRRK2的表达在HEK293T细胞^15。细胞培养在6孔板中，并用³² P标记和上述协议中的文本所描述的分析， 图1示出了代表性的结果为LRRK1和LRRK2的HEK293T细胞代谢标记。放射性磷酸并入观察到两个LRRK1和LRRK2。经³² P水平归一化到如通过用抗flag抗体免疫检测的光密度分析测定的蛋白质水平的定量分析，结果...

讨论

本文提供了一个基本协议，使用代谢标记与³² P-正磷酸盐测定LRRK1和LRRK2的总体磷酸化水平的细胞系。总体战略是直截了当的。亲和标签的LRRK蛋白被表达在HEK293T细胞暴露于含³² P-正磷酸盐介质。的³² P-正磷酸盐的细胞只有几个小时的潜伏期和在含磷酸盐的小区中的所有分子之后被吸收，从而被放射性标记。亲和标签（3XFLAG），然后用于通过免疫沉淀来分离从其它细胞组分的L...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phosphorus-32 Radionuclide, 1 mCi, buffer disodiumphosphate in 1 ml water	Perkin Elmer	NEX011001MC
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (D-MEM) (1X), liquid (high glucose)	Invitrogen	11971-025	This medium contains no phosphates
Anti Flag M2 affiinty gel	Sigma	A2220	For an equivalent product with red colored gel (useful to more easily visualize the beads), use cat. No. F2426.
Extra thick blotting filter	Bio-Rad	1703965
Ponceau S solution	Sigma	P7170