JoVE Logo
著者
お問い合わせ

サインイン

このコンテンツを視聴するには、JoVE 購読が必要です。 サインイン又は無料トライアルを申し込む。

この記事について

  • 要約
  • 要約
  • 概要
  • プロトコル
  • 結果
  • ディスカッション
  • 開示事項
  • 謝辞
  • 資料
  • 参考文献
  • 転載および許可

要約

ロイシンリッチリピートキナーゼ1および2（LRRK1およびLRRK2）は、GTPアーゼおよびキナーゼドメインの両方をコードし、細胞内でリン酸化されたマルチドメインタンパク質である。ここでは、それによってその全体的なセルラphophorylationレベルを測定する手段を提供する、32 Pオルトリン酸を用いて細胞内LRRK1とLRRK2を標識するためのプロトコルを提示する。

要約

ロイシンリッチリピートキナーゼ1および2（LRRK1およびLRRK2）は、セリン - スレオニンキナーゼドメイン、複合タンパク質ドメインのラス（ROC）、ROCドメイン（COR）のC-末端を含め、同様のドメイン構成を共有パラログであるおよびロイシンリッチとN末端にアンキリン様​​リピート。 LRRK2は、パーキンソン病3,4の病因に関与している間LRRK1およびLRRK2の正確な細胞の役割は、しかしLRRK1は、1,2シグナリングチロシンキナーゼ受容体に関与しているまだ解明されてきた。本稿では、それによって細胞におけるこれら2タンパク質の全体的なリン酸化レベルを測定する手段を提供し、32 Pオルトリンを持つ細胞にLRRK1とLRRK2タンパク質を標識するためのプロトコルを提示する。簡潔には、親和性はLRRKタ ​​ンパク質は32 P-オルトリン酸を含有する培地に曝露されたHEK293T細胞において発現されるタグ付き。 32 P-オルトリンはわずか後の細胞に同化されているインキュベーション時間およびリン酸塩を含有する細胞内の全ての分子は、それによって放射性標識されている。親和性タグを介して（3XFLAG）LRRKタンパク質は免疫沈降により、他の細胞成分から単離される。免疫沈降物をSDS-PAGEによって分離し、PVDF膜および組み込まれたリン酸塩の分析にブロットは、ブロット上のタンパク質のオートラジオグラフィー（32 P信号）およびウエスタン検出（タンパク質シグナル）によって行われる。プロトコルは、容易に細胞内で発現され、免疫沈降によって単離することができる任意の他のタンパク質のリン酸化を監視するように適合させることができる。

概要

ロイシンリッチリピートキナーゼ1および2（LRRK1およびLRRK2）は、同様のドメイン構成を共有するマルチドメインパラログである。両タンパク質は、効果的ROCOタンパク質ファミリー5,6に両方のタンパク質を分類、分子量GTPase（複合体タンパク質のRasは、またはROC）のRasファミリーだけでなく、ROCドメイン（COR）のC末端に似アーゼ配列をコードする。 ROC-CORドメインタンデムのN末端 ​​のみLRRK2は、余分なアルマジロdomein 6-8をコードしている間、両 ​​方のタンパク質は、ロイシンリッチリピートドメインだけでなく、アンキリン様ドメインをコードする。 ROC-CORのC末端のみLRRK2がC末端領域8のWD40ドメインをコードしながら、両方のタンパク質は、セリン-トレオニンキナーゼドメインを共有する。 LRRK1およびLRRK2の正確な細胞の役割は、しかしLRRK1 1,2シグナリングチロシンキナーゼ受容体に関係している、解明されていたが、パーキンソン病の3,4の病因にLRRK2の役割への遺伝的証拠を指しています。

タンパク質のリン酸化は、細胞内での一般的な制御機構である。例えば、リン酸化は、酵素の活性化またはシグナル伝達複合体へのタンパク質の動員に必須であることができる。 LRRK2の細胞のリン酸化は広範に特徴付けされており、phosphositeマッピングはアンキリンリピートとロイシンリッチリピートドメイン間でクラスタ9月11日で発生する細胞のリン酸化部位の大部分を示している。 LRRK1細胞のリン酸化部位をマッピングするには至っていないものの、COS7細胞から免疫沈降LRRK1タンパク質のブロットのリンタンパク質染色を用いた研究からの証拠は、LRRK1タンパク質が細胞12内のリン酸化されていることを示唆している。

本論文では、32 P-オルトリンで代謝標識を使用した細胞株において、LRRK1とLRRK2の一般的なリン酸化レベルを測定するための基本的なプロトコルを提供します。全体的な戦略は簡単です。親和性はLRRK proteタグインは、32 P-オルトリン酸を含有する培地に曝露されたHEK293T細胞において発現される。 32 P-オルトリンインキュベーションのわずか数時間後に細胞に同化され、リン酸塩を含有する細胞内の全ての分子は、それによって放射性標識されている。親和性タグ（3XFLAG）を次に免疫沈降によって他の細胞成分からLRRKタンパク質を単離するために使用される。免疫沈降物をSDS-PAGEによって分離し、PVDF膜および組み込まれたリン酸塩の分析にブロットは、ブロット上のタンパク質のオートラジオグラフィー（32 P信号）およびウエスタン検出（タンパク質シグナル）によって行われる。

プロトコル

この議定書は、LRRK2の細胞のリン酸化に従うことを放射性32 P標識オルトリンを使用しています。これは、放射性の試薬ですべての操作は、オペレータおよび環境への放射性放射線の被ばくを最小限にするために、適切な保護措置を使用して実行する必要があることを念頭に置くことが重要です。電離放射線は、制度的、国家レベルで人の健康と厳格なライセンスおよび規制に害を及ぼす可能性が発する同位元素を含む化合物は、その使用を制御します。このプロトコルでの実験は、カトリック大学ルーベン（KUルーベン）でのオープンソースの放射線使用中の訓練に従い、大学の健康、安全、環境部門が提供する優れた実験室での実践ガイドラインに従って実施した。我々のプロトコルのいくつかのステップが広く、細胞培養、SDS-PAGE、ウェスタンブロッティングとして展開され、ここで与えられている私たちの研究室で適用されるプロトコルの詳細です。それは、Shouldは、正確な実験条件は、実験室からの研究室ごとに異なる​​ことに注意されているため、放射性物質の適正な取扱いを確保するための具体的な対策は、それぞれの新しい実験室環境に適合させる必要があります。

オープンソースの放射線の使用は、従来、規制当局の承認の対象であり、実験室での研究におけるオープンソースの放射線を担当する規制機関は国によって異なります。ユーザーは、そのプロシージャがローカルルールや規制に準拠していることを確認するために、その制度上の放射線安全管理者に相談してください。規制機関に関する情報が記載されています。ベルギーで、原子力制御用、連邦局（ http://www.fanc.fgov.beフランス語やオランダ語で、ウェブサイト）、イギリスでは、健康と安全エグゼクティブ（ HTTP： / / www.hse.gov.uk /放射線/イオン/ index.htmを ）、米国でのNucリア規制委員会（ http://www.nrc.gov/materials/miau/regs-guides-comm.html ）、カナダのカナダ原子力安全委員会（ http://nuclearsafety.gc.ca/eng/ ）、およびドイツダスBundesamtエリーゼStrahlenschutz中（ http://www.bfs.de/de/bfs ）。このプロトコルに関連する安全上の注意は、テキストに記載されているが、（放射性三つ葉マークで強調figure-protocol-1437 ）。

1。細胞の代謝標識

  1. 標識に細胞を準備します。
    1. 培養HEK293T細胞株を8％ウシ胎児血清及びゲンタマイシンを含むDMEM中で標準の培養条件（37℃、5％CO 2）に記載の方法。
    2. 十分に細胞を拡大テストするためのサンプルあたり少なくとも1×10 6個の細胞を得る。
    3. 細胞をトリプシン処理し、十分に10 6細胞/ 6ウェルプレート（直径35mm）にプレートアウト。
    4. 24時間後、細胞をプレーティングした後、トランスフェクションまたはレンチウイルスベクター媒介形質導入を通じて3XFLAG-LRRK2タンパク質を発現する。
      1. トランスフェクションのために、追加することなく、（サンプル4μgのDNAを（pCHMWS-3XFLAG-LRRK2プラスミド13〜15またはpCHMWS-3XFLAG-LRRK1プラスミド15）と80μlのDMEM中にリニアポリエチレン（直鎖PEI、1 mg / ml）を、8μLあたりミックス）。 15〜30分間、複雑にできるようにして存在する媒体にうまく混合することにより、細胞へのコンプレックスを追加します。
      2. レンチウイルスベクター媒介形質導入のために、レンチウイルスベクターのエンコーディング3XFLAG-LRRK1を希釈または-2（LV-3XFLAG-LRRK1、LV-3XFLAG-LRRK2は、経験則として、倍の数の変換ユニットと伝達する、機能的なベクター粒子のすなわち数、レンチベクターの培養培地への細胞）が存在するように製品の説明 LV-3XFLAG-LRRK1 / 2のイオン15は、以前に記載されている。
    5. 細胞が80％〜100％コンフルエント（トランスフェクションまたは形質導入後約48時間）である場合には、リン酸塩ずに温めておいた（37℃）DMEMで細胞を洗浄してください。
  2. 32 P-オルト-リン酸とラベル細胞。
    1. 放射線を扱う際の安全性の心の一般的な原則に留めておく。
      1. figure-protocol-2616指定された放射領域に32 Pですべての操作を実行します。
      2. figure-protocol-2784適切な個人用保護具を着用する必要があります - 私たちの研究室での標準操作手順の下で、これらは、白衣、二重手袋、保護眼鏡が含まれています。
      3. 32 PとG "SRC =" / files/ftp_upload/50523/50523rad1.jpg "/>すべての作業は、露出を最小限にするために6ミリメートルパースペックスの画面で、ユーザーからシールドする必要があります。
      4. figure-protocol-3119個人的な監視装置が常に使用されるべきである - KUL内のすべての認定を受け、オープンソースの放射線ユーザーは、実験中に放射線被ばくを監視するために白衣の胸ポケットに装着フィルムバッジを身に着けている。
      5. figure-protocol-3350全ての実験表面はガイガーカウンターで使用する前と後の放射能を評価​​すべきである。
      6. figure-protocol-3520すべての汚染された可能性の消耗品は、RAのための制度的なガイドラインを厳守で処分する必要がありますdioactive廃棄物処理。
    2. 層流の下で、ラベルに細胞の6ウェルプレート当たり（37℃に予熱）リン酸塩を含まないDMEMの2.1ミリリットルでファルコンチューブを準備します。
      1. 例えば、6ウェルプレートの全てのウェル中の標識細胞に12.6 mlの培地（2.1 X = 6）を調製。これを2mlの培地体積の5％過剰の細胞の6ウェルプレートのウェルあたりに使用されるために提供することである。
    3. figure-protocol-3929電離放射線を用いた実験が実行される時にベンチを用意します。作業スペースは、吸収性材料の保護ライナが配置される時にスピルマットで覆われている。あなたは1防水面でライナーを使用している場合には、吸収面を上にして置きます。
    4. figure-protocol-4166また、提供ワークスペース上のパースペックスジャー、その中にリン酸塩を含まない培地のチューブを配置します。
    5. figure-protocol-4347冷蔵庫から32 Pラベルされたオルトリンのバイアルをリード並ぶコンテナを取り、放射能ベンチにそれを持って来る。ガイガーカウンターを使用して外部放射能汚染のための容器を監視します。
    6. figure-protocol-4576 24μCiの/ mlの濃度でリン酸塩を含まないDMEMのチューブに32 Pラベルされたオルトリン希釈する。
      1. 注：Pは、培養細胞のオルトリン/ cm 2のラベルが付い μCiの32 5への細胞の6ウェルプレート当たり2ミリリットルで、これは対応しています。
      2. figure-protocol-4885キープパースペックスジャーチューブ。
    7. figure-protocol-5042 32 Pラベルされたオルトリンの残りの部分と、容器を閉じ、冷蔵庫に交換してください。
    8. figure-protocol-5225放射能ベンチでインキュベーターと場所からの標識される細胞で6ウェルプレートを取り外します。
    9. figure-protocol-5399メディア上清を除去し、廃棄します。 32 Pを含むリンを含まない培地の2ミリリットルを追加するだけでなく/オルトリンラベル。
    10. figure-protocol-5601パースペックスボックスに培養プレートを配置し、コンテナFOを監視ガイガーカウンターを使用してR外部放射能汚染。
    11. figure-protocol-5785同位体代謝標識専用の真核細胞の培養器に細胞とパースペックスボックスを転送します。
    12. figure-protocol-5954 5％CO 2中37℃で1-20時間インキュベートする。
      1. 一般的には、3時間以上の取り込み時間が勧められる。所望に応じて最適なインキュベーション時間は、各特定のタンパク質の経時変化実験を介して評価することができる。
    13. figure-protocol-6219オプション：化合物で細胞を処理。
      1. （例えば、キナーゼ阻害剤など）、化合物処理を用いた実験では、化合物処理工程においては、後に含まれているラベル付けを可能にする化合物を含まないitialインキュベーション時間。所望のインキュベーション時間の後、培養プレートを含むパースペックスボックスをインキュベーターから取り出し、放射能をベンチにした。
      2. figure-protocol-6525標識培地は、化合物を所望の濃度に希釈されその中に温めておいたリン酸塩を含まない培地で取り外して交換されている。パースペックスジャーに入れている廃棄物の収集のための50mlチューブに培地を捨てる。
      3. figure-protocol-6751細胞を、パースペックスボックス内で置換し、所望の接触時間のための細胞インキュベーター中に入れる。
  3. figure-protocol-6948ラベの溶解物を収集LEDセル。
    1. figure-protocol-7091細胞から培地を除去し、パースペックスジャーに入れている廃棄物収集チューブに捨てる。
    2. figure-protocol-7261細胞はパースペックスジャーに入れ廃棄物収集チューブにリンス液を廃棄し、氷冷TBS（50mMのトリス、150mMのNaCl、pH7.4で、2ミリリットル/リンス）で2回すすいでください。
    3. figure-protocol-7482各ウェルに、氷冷​​免疫沈降（IP）の溶解緩衝液0.5ミリリットルを追加し、すべて溶解した細胞を緩めるために、上下に溶解液をピペットで溶解液を収集します。
      1. プロテアーゼ阻害剤カクテルおよびホスファターゼを添加し、事前にIP溶解緩衝液（0.5ミリリットル/試料+5％過剰）の必要量を調製使用直前に新鮮な阻害剤カクテル。
      2. 溶解緩衝液の組成は、20mMトリスpH7.5の、150mMのNaCl、1mMのEDTA、1％トリトン、10％グリセロール、プロテアーゼ阻害剤カクテルおよびホスファターゼ阻害剤カクテルである。
    4. figure-protocol-7892マイクロ遠心チューブにライセートを移し、少なくとも10分間氷上でインキュベートする。
    5. figure-protocol-8063 10分間> 5000×gで微量での溶解物を遠心分離する。
    6. figure-protocol-8221パースペックスシールドの後ろに格納されている専用のゴミ箱に放射性廃棄物の処分。

2。目的のタンパク質の標識を分析

  1. figure-protocol-8451免疫精製（IP）によって目的のタンパク質を分離します。
    1. figure-protocol-8606戻って氷を遠心分離溶解物とのマイクロチューブを転送し、平衡化FLAG-M2アガロースビーズ10μlのベッド容量を含むマイクロ遠心チューブに上清をピペットで。
      1. 事前に平衡化FLAG-M2アガロースビーズとチューブを準備します。
      2. このために、10μlのサンプルあたりのベッドボリュームプラス5％過剰に対応するフラグ-M2アガローススラリーの量をピペット。
        1. 一般的には、ビーズの10μlのベッド容量は20μlでスラリーに対応している。詳細は、製品データシートを参照してください。
      3. のIP溶解緩衝液10容（床容量に対して）で3回洗浄することによってビーズを平衡化させます。
      4. サンプルがあると同数のチューブに10μlのベッド容量/チューブに均等に平衡化したビーズを配布します。各サンプルの識別子で、チューブにラベルを付けます。
    2. figure-protocol-9162放射性三つ葉記号で標識された50ミリリットルのチューブ（約6マイクロ遠心tubes/50 mlのチューブ）にマイクロチューブを移し、氷上に保つ。
    3. figure-protocol-9363 1月20日時間4℃で混合末に比べ終わりのための低温室の指定領域内のパースペックスシールドの背後にある回転装置に転送するサンプル。
    4. figure-protocol-9557氷の上で指定された作業スペースにサンプルを転送します。
    5. 50523rad1highres.jpg "SRC =" / files/ftp_upload/50523/50523rad1.jpg "/>マイクロ遠心（1,000×gで、1分）にFLAG-M2アガロースビーズに結合したタンパク質をスピンダウンし、廃棄物収集チューブに上清を捨てる。
    6. figure-protocol-9865 1ミリリットルのIP洗浄緩衝液中に再懸濁することによりFLAG-M2アガロースビーズに結合したタンパク質を洗浄します。
      1. IP洗浄緩衝液の組成：トリス25mMのpH7.5の400mMのNaClを、1％トリトン。また、同時精製プロテアーゼによるまたは同時精製ホスファターゼによる脱リン酸化による劣化に敏感なタンパク質のための洗浄緩衝液中のプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤が含まれることをお勧めします。
      2. figure-protocol-10205微量タンパク質結合されたFLAG-M2アガロースビーズ（1,000×gで、1分）をスピンダウンし、廃棄物のコレクション1に上澄みを捨てるTiONからチューブ。
      3. figure-protocol-10413洗浄ステップを3回繰り返します。
    7. figure-protocol-10568洗浄後、1ミリリットルIPリンス緩衝液（トリス25mMのpH7.5のMgCl 2を 10mMのジチオスレイトール（DTT）、2mMの、トリトン0.02％、β-グリセロリン酸、5mMの、のNa 3 VO 4、0.1mMの）中にビーズを再懸濁する。
    8. figure-protocol-10852マイクロ遠心（1,000×gで、1分）でのタンパク質結合されたFLAG-M2アガロースビーズをスピンダウンし、廃棄物収集チューブに上清を捨てる。すべての余分なバッファを削除します。
    9. figure-protocol-11071 40＆Mへの再懸濁ビーズuは、IP試料のSDSローディングバッファーlの（トリス-HCl 160mMのpH6.8の、2％SDS、0.2 M DTT、40％グリセロール、ブロモフェノールブルー2 mg / mlで）。
      1. サンプルは直ちに分析又は不純な分析のために-20°Cの冷凍庫に保存することができる。
        1. figure-protocol-11358 -20℃でのサンプルの保存のため、放射性試料の保管専用の冷凍庫のラベルが付いた放射性三つ葉シンボル内のパースペックスボックス内チューブホルダーやボックス内の場所のサンプル。
    10. figure-protocol-11594パースペックスシールドの後ろに格納されている専用のゴミ箱に放射性廃棄物の処分。
  2. figure-protocol-11772 SDS-PAGEおよびBLOを介してIPサンプルを解決PVDF膜へのt。
    1. figure-protocol-11937ビーズを沈殿させる>千×​​gで1分間、2分間遠心95℃まで負荷バッファーでの熱のサンプル。
    2. figure-protocol-12112パースペックス画面の背後にある放射能ベンチでタンパク質ゲル電気泳動モジュールを準備します。
    3. figure-protocol-12286 3から8パーセントトリス - アセテートSDS-PAGEゲルにロードしたサンプル。
      1. このタイプのゲルは、高分子量（HMW）タンパク質を分離するのに適している。他のゲル型はまた、4〜20％ビス - トリシンゲル又はトリス - グリシン4〜20％ゲルとして、適し得る。
      2. HMWタンパク質の大きさを識別するのに適した分子量マーカーが含まれる。
      4. <李> figure-protocol-12613 1時間150 Vで電気泳動を行う。
    4. figure-protocol-12760電気泳動後、そのプラスチックケースからジェルを取り外して、ウェスタンブロッティングトランスファーバッファーの入った容器にゲルを移す。
      1. ウェスタンブロットトランスファーバッファーの組成：50mMのトリス、40mMのグリシン、0.04％SDS、20％メタノール。
      2. figure-protocol-13026このような井戸セパレータやはみ出しゲルの底部分としてはみ出すゲルの部分を切り取ります。
    5. 1分間メタノールに浸漬してゲルごとに1つのポリフッ化ビニリデンを調製（PVDF）膜、次に転写緩衝液中に置く。
      1. 膜はSに切断されるジェルプラス3ミリメートルのマージンとしてAMEサイズ。
    6. 放射能ベンチにセミドライブロッティングモジュールを置き、カバーと上部電極板を取り外します。
    7. figure-protocol-13390セミドライブロッティングモジュールの表面にブロッティングサンドイッチを準備します。
      1. ブロッティングモジュールの底板上に転写バッファーと場所でフィルタをブロッティング（厚さ2.5mm、7.5×10cmのラージ）エキストラ厚いを濡らす。
      2. figure-protocol-13643ブロッティングフィルター上のプリウェットPVDF膜を置きます。
      3. figure-protocol-13803慎重にPVDF膜上にゲルを置き、気泡を除去する。
      4. 523/50523rad1highres.jpg "SRC =" / files/ftp_upload/50523/50523rad1.jpg "/>ブロッティングモジュールの底板上に転写バッファーと場所に余分な厚いブロッティングフィルターを濡らすことでブロットサンドイッチを完成させます。全ての空気を削除ブロッティングサンドイッチ最終的に存在する泡。
        ここでの説明は、電極は、タンパク質が膜上に下向きに移動するようなものであるバイオラッドトランスブロットSDシステムと互換性があることに注意してください。その他ブロッティングシステムはまた、最終的には考慮に入れ、他のブロッティング方向や、タンクブロッティングの場合には、上記の電気泳動緩衝液と同じ方法で処分することに余分な液体廃棄物を取るために必要なものなど軽微な改造での手順と互換性があります。
    8. figure-protocol-14356吸収性ティッシュですべての余分なバッファを削除して、天板を配置し、半Dのカバー RYブロッティングモジュール。
    9. figure-protocol-14546 1〜2時間、15Vでタンパク質を転送します。
    10. figure-protocol-14698この間、電気モジュールをクリーンアップ。
      1. figure-protocol-14846パースペックスシールドの後ろに格納されている専用のゴミ箱に放射性廃棄物の処分。
      2. figure-protocol-15014蒸留水（AD）との電気モジュールをすすぎ、放射性液体廃棄物容器内の洗浄水を捨てます。
    11. 0523/50523rad1.jpg "/>転送後、ブロッティングモジュールからブロッティングしたタンパク質とのPVDF膜を取り除く。
    12. figure-protocol-15279オプション：タンパク質を可視化するためにブロットしたタンパク質のポンソーS染色を行う。
      1. figure-protocol-15450ポンソーS溶液を含有する浅いブロットインキュベーション容器にブロットを移し、5分間インキュベートする。
      2. figure-protocol-15630 ADで素早く2Xを洗い流す。
    13. figure-protocol-15784膜を乾燥させます。
  3. / files/ftp_upload/50523/50523rad1.jpgは "/>オートラジオグラフィーを行ってください。
    1. figure-protocol-16004 1-5日間燐光板に膜を公開します。
    2. figure-protocol-16151ストーム840りん光スキャナまたは同等を使用して公開される燐光プレートのオフ32Pを読んで、高解像度のTIFFなどの画像を保存します。
  4. figure-protocol-16357免疫検出を介してタンパク質レベルを検出する。
    1. figure-protocol-16507メタノールに簡単にそれらを浸漬することにより、膜を再水和、次いでPBSで浅いブロットのインキュベーション容器に移す。
    2. figure-protocol-16695 5％ミルクを含有するPBS-T（0.1％トリトンを含むPBS）で膜をブロックする。
    3. figure-protocol-16866適切な洗浄工程および二次抗体のインキュベーションをさらに抗LRRK2抗体13,16または抗FLAG抗体およびプロセスでブロットをインキュベートします。
    4. figure-protocol-17081 LRRK2の相対的なタンパク質レベルを確認するために、化学発光検出を実行します。
  5. LRRK2における32 Pの取り込みを定量化する。
    1. このようなImageJソフトウェア、国立Institで提供フリーウェアプログラムとして適切なソフトウェアを使用してブロットオートラジオグラムと免疫反応性でバンドの濃度分析を行う健康ウェブサイトのユート族（ http://rsbweb.nih.gov/ij/ ）。
    2. 免疫反応性のレベルを超えるオートラジオグラフィーシグナルの比としてリン酸を組み込む濃度を計算します。

結果

細胞においてLRRK1とLRRK2全体のリン酸化レベルを比較するために、3XFLAGはLRRK1タグとLRRK2をHEK293T細胞で発現させた15。細胞を、6ウェルプレートで培養し、32 Pで標識し、プロトコル·テキストで上記のように分析した。 図1は、HEK293T細胞におけるLRRK1およびLRRK2の代謝標識のための代表的な結果を示す。放射性リン酸取り込みはLRRK1およびLRRK2の両方で観察される?...

ディスカッション

本論文では、32 P-オルトリンで代謝標識を使用した細胞株において、LRRK1とLRRK2の一般的なリン酸化レベルを測定するための基本的なプロトコルを提供します。全体的な戦略は簡単です。親和性はLRRKタ ​​ンパク質は32 P-オルトリン酸を含有する培地に曝露されたHEK293T細胞において発現されるタグ付き。 32 P-オルトリンインキュベーションのわずか数時間後に細胞に?...

開示事項

著者らは、開示することは何もありません。

謝辞

我々はまた、この研究をサポートしているマイケル·J·フォックス財団に感謝しています。フランダースFWO（FWOプロジェクトG.0666.09、JMTの主任研究員フェローシップ）、IWT SBO/80020プロジェクト神経ターゲットKUルーベン（OT/08/052AとIOF-KP/07 / 001） - 私たちは、研究財団に感謝彼らのサポートのため。この研究はまた、JMTにキングボードウィン財団が運営するファンドDruwé-Eerdekensによって部分的にサポートされていました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Phosphorus-32 Radionuclide, 1 mCi, buffer disodiumphosphate in 1 ml waterPerkin ElmerNEX011001MC
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (D-MEM) (1X), liquid (high glucose)Invitrogen11971-025This medium contains no phosphates
Anti Flag M2 affiinty gelSigmaA2220For an equivalent product with red colored gel (useful to more easily visualize the beads), use cat. No. F2426.
Extra thick blotting filterBio-Rad1703965
Ponceau S solutionSigmaP7170

参考文献

  1. Hanafusa, H. Leucine-rich repeat kinase LRRK1 regulates endosomal trafficking of the EGF receptor. Nat Commun. 2, 158 (2011).
  2. Titz, B., et al. The proximal signaling network of the BCR-ABL1 oncogene shows a modular organization. Oncogene. 29, 5895-5910 (2010).
  3. Cookson, M. R. The role of leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) in Parkinson's disease. Nat Rev Neurosci. 11, 791-797 (2010).
  4. Taymans, J. M., Cookson, M. Mechanisms of dominant parkinsonism; the toxic triangle of LRRK2, alpha-synuclein and tau. Bioessays. 32, 227-235 (2010).
  5. Lewis, P. A. The function of ROCO proteins in health and disease. Biol Cell. 101, 183-191 (2009).
  6. Marin, I., van Egmond, W. N., van Haastert, P. J. The Roco protein family: a functional perspective. FASEB J. 22, 3103-3110 (2008).
  7. Marin, I. The Parkinson disease gene LRRK2: evolutionary and structural insights. Mol.Biol.Evol. 23, 2423-2433 (2006).
  8. Marin, I. Ancient origin of the Parkinson disease gene LRRK2. J Mol Evol. 67, 41-50 (2008).
  9. Lobbestael, E., Baekelandt, V., Taymans, J. M. Phosphorylation of LRRK2: from kinase to substrate. Biochem Soc Trans. 40, 1102-1110 (2012).
  10. Gloeckner, C. J., et al. Phosphopeptide Analysis Reveals Two Discrete Clusters of Phosphorylation in the N-Terminus and the Roc Domain of the Parkinson-Disease Associated Protein Kinase LRRK2. J Proteome Res. 9, 1738-1745 (2010).
  11. Nichols, R. J., et al. 14-3-3 binding to LRRK2 is disrupted by multiple Parkinson's disease-associated mutations and regulates cytoplasmic localization. Biochem J. 430, 393-404 (2010).
  12. Greggio, E., et al. Mutations in LRRK2/dardarin associated with Parkinson disease are more toxic than equivalent mutations in the homologous kinase LRRK1. J.Neurochem. 102, 93-102 (2007).
  13. Taymans, J. M. LRRK2 Kinase Activity Is Dependent on LRRK2 GTP Binding Capacity but Independent of LRRK2 GTP Binding. PLoS One. 6, 23207-23 (2011).
  14. Daniëls, V. Insight into the mode of action of the LRRK2 Y1699C pathogenic mutant. J Neurochem. 116, 304-315 (2011).
  15. Civiero, L. Biochemical characterization of highly purified leucine-rich repeat kinases 1 and 2 demonstrates formation of homodimers. PLoS One. 7, e43472 (2012).
  16. Taymans, J. M., Van den Haute, C., Baekelandt, V. Distribution of PINK1 and LRRK2 in rat and mouse brain. J.Neurochem. 98, 951-961 (2006).
  17. Lewis, P. A. Assaying the kinase activity of LRRK2 in vitro. J Vis Exp. , (2012).
  18. Lobbestael, E. Immunohistochemical detection of transgene expression in the brain using small epitope tags. BMC Biotechnol. 10, 16 (2010).
  19. Davies, P., et al. Comprehensive Characterization and Optimization of Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) Monoclonal Antibodies. Biochem J. , (2013).
  20. West, A. B. Parkinson's disease-associated mutations in LRRK2 link enhanced GTP-binding and kinase activities to neuronal toxicity. Hum.Mol.Genet. 16, 223-232 (2007).
  21. Sheng, Z., et al. Ser1292 autophosphorylation is an indicator of LRRK2 kinase activity and contributes to the cellular effects of PD mutations. Sci Transl Med. 4, 164ra161 (2012).
  22. Li, X., et al. Phosphorylation-dependent 14-3-3 binding to LRRK2 is impaired by common mutations of familial Parkinson's disease. PLoS One. 6, e17153 (2011).
  23. Dzamko, N., et al. Inhibition of LRRK2 kinase activity leads to dephosphorylation of Ser(910)/Ser(935), disruption of 14-3-3 binding and altered cytoplasmic localization. Biochem J. 430 (910), 405-413 (2010).

転載および許可

このJoVE論文のテキスト又は図を再利用するための許可を申請します

許可を申請

さらに記事を探す

79 LRRK1 LRRK2 32P

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

個人情報保護方針

利用規約

一般データ保護規則

お問い合わせ

図書館への推薦

JoVE ニュースレター

研究

教育

著者

図書館員

JoVEについて

Copyright © 2023 MyJoVE Corporation. All rights reserved