Metabolica Etichettatura di leucina Rich Repeat chinasi 1 e 2 con Radioactive fosfato

Riepilogo

Leucina ricca chinasi ripetizione 1 e 2 (LRRK1 e LRRK2) sono proteine ​​multidominio che codificano sia GTPase e domini di chinasi e che sono fosforilata nelle cellule. Qui vi presentiamo un protocollo per etichettare LRRK1 e LRRK2 in cellule con ³² P ortofosfato, fornendo così un mezzo per misurare i loro livelli complessivi di fosforilazione cellulare.

Abstract

Leucina chinasi ricco ripetizione 1 e 2 (LRRK1 e LRRK2) sono paraloghi che condividono un dominio simile organizzazione, compreso un dominio chinasi serina-treonina, un complesso di Ras dominio proteine ​​(ROC), un C-terminale del dominio ROC (COR), e ricco di leucina e ripetizioni ankyrin simile al N-terminale. I ruoli cellulari precise LRRK1 e LRRK2 devono ancora essere chiariti, tuttavia LRRK1 è stato implicato in tirosina chinasi recettore segnalazione ^1,2, mentre LRRK2 è implicato nella patogenesi della malattia di Parkinson ^3,4. In questa relazione, vi presentiamo un protocollo per etichettare le proteine ​​LRRK1 e LRRK2 in cellule con ³² P ortofosfato, fornendo così un mezzo per misurare i livelli di fosforilazione complessivi di queste due proteine ​​nelle cellule. In breve, l'affinità etichettato LRRK proteine ​​sono espresse in cellule HEK293T che sono esposti al terreno contenente ³² P-ortofosfato. Il ³² P-ortofosfato viene assimilato dalle cellule dopo solo pochiore di incubazione e tutte le molecole nella cella contenente fosfati sono così marcato radioattivamente. Via il tag di affinità (3xflag) le proteine ​​LRRK sono isolati dagli altri componenti cellulari mediante immunoprecipitazione. Gli immunoprecipitati sono quindi separati mediante SDS-PAGE, cancellati su membrane PVDF e analisi dei fosfati incorporate viene eseguita mediante autoradiografia ⁽³² segnale P) e rilevamento occidentale (segnale proteina) delle proteine ​​sulle macchie. Il protocollo può essere facilmente adattato per monitorare la fosforilazione di qualsiasi altra proteina che può essere espresso in cellule e isolato mediante immunoprecipitazione.

Introduzione

Leucina ricca chinasi ripetizione 1 e 2 (LRRK1 e LRRK2) sono paraloghi multidominio che condividono un'organizzazione dominio simile. Entrambe le proteine ​​codificano una sequenza GTPasi simile alla famiglia di GTPasi Ras (Ras di proteine ​​complesse, o ROC), nonché un terminale C della ROC dominio (COR), classificando efficacemente entrambe le proteine ​​della famiglia di proteine ​​ROCO ^5,6. N-terminale del dominio tandem ROC-COR, entrambe le proteine ​​codificare un dominio ripetizione ricca di leucina e un dominio ankyrin simile, mentre solo LRRK2 codifica un armadillo supplementare domein ^6-8. C-terminale della ROC-COR, entrambe le proteine ​​condividono un dominio chinasi serina-treonina mentre solo LRRK2 codifica un dominio WD40 nella regione C-terminale ^8. I ruoli cellulari precise LRRK1 e LRRK2 devono ancora essere chiariti, tuttavia LRRK1 è stato implicato in tirosina chinasi recettore segnalazione ^1,2, mentre evidenze genetica ad un ruolo per LRRK2 nella patogenesi della malattia di Parkinson ^3,4.

La fosforilazione di proteine ​​è un meccanismo di regolazione comune nelle cellule. Ad esempio, la fosforilazione può essere essenziale per l'attivazione di enzimi o per l'assunzione di proteine ​​per un complesso di segnalazione. La fosforilazione cellulare di LRRK2 è stato ampiamente caratterizzato e mappatura phosphosite ha mostrato una maggioranza dei siti di fosforilazione cellulare a verificarsi in un cluster tra la ripetizione ankyrin e leucina domini ripetuti ricchi ^9-11. Anche se LRRK1 siti di fosforilazione cellulare devono ancora essere mappato, evidenze da studi che utilizzano phosphoprotein colorazione delle macchie di proteine ​​LRRK1 immunoprecipitata da cellule COS7 suggerisce che la proteina LRRK1 è fosforilata nelle cellule ^12.

Questo documento fornisce un protocollo di base per saggiare il livello di fosforilazione generale di LRRK1 e LRRK2 in linee cellulari mediante marcatura metabolica con ³² P-ortofosfato. La strategia generale è semplice. Affinity tagged LRRK prins sono espressi in cellule HEK293T che sono esposti al terreno contenente ³² P-ortofosfato. Il ³² P-ortofosfato viene assimilato dalle cellule dopo solo poche ore di incubazione e di tutte le molecole nella cellula contiene fosfati sono così marcato radioattivamente. Il tag di affinità (3xflag) viene quindi utilizzata per isolare le proteine ​​LRRK da altri componenti cellulari mediante immunoprecipitazione. Gli immunoprecipitati sono quindi separati mediante SDS-PAGE, cancellati su membrane PVDF e analisi dei fosfati incorporate viene eseguita mediante autoradiografia ⁽³² segnale P) e rilevamento occidentale (segnale proteina) delle proteine ​​sulle macchie.

Protocollo

Il presente protocollo utilizza radioattivo ³² P-marcato ortofosfato di seguire la fosforilazione cellulare di LRRK2. E 'importante tenere a mente che tutte le operazioni con i reagenti radioattive devono essere effettuate utilizzando adeguate misure di protezione per ridurre al minimo l'esposizione delle radiazioni radioattive per l'operatore e per l'ambiente. Composti contenenti isotopi che emettono radiazioni ionizzanti possono essere dannosi per la salute umana e licenze rigorosa e regolamenti a un controllo istituzionale e nazionale il loro uso. Gli esperimenti in questo protocollo sono stati effettuati seguendo una formazione sull'uso di radiazione open source presso Katholieke Universiteit Leuven (KU Leuven) e seguendo le linee guida di buona pratica di laboratorio previsti dal dipartimento di salute, sicurezza e ambiente presso l'università. Diversi passaggi nel nostro protocollo sono ampiamente utilizzate come coltura cellulare, SDS-PAGE, western blotting e dato ecco i dettagli del protocollo applicato nel nostro laboratorio. E 'should segnala che precise condizioni sperimentali variano da laboratorio a laboratorio; pertanto misure specifiche per garantire la corretta manipolazione di materiale radioattivo devono essere adattate ad ogni nuovo ambiente di laboratorio.

L'uso di radiazioni open source è soggetta ad approvazione normativa preventiva e l'organismo di regolamentazione competente per le radiazioni open source nel laboratorio di ricerca varia da paese a paese. Gli utenti dovrebbero consultare il proprio responsabile della sicurezza di radiazione istituzionale al fine di garantire che le procedure conformi a norme e regolamenti locali. Informazioni su organismi di regolamentazione può essere trovato: in Belgio, l'Agenzia federale per il controllo nucleare ( http://www.fanc.fgov.be , sito in francese o olandese), nel Regno Unito, la Health and Safety Executive ( http: / / www.hse.gov.uk / radiazioni / ionizzanti / index.htm ), negli Stati Uniti il Nuclear Regulatory Commission ( http://www.nrc.gov/materials/miau/regs-guides-comm.html ), in Canada Canadian Commissione per la sicurezza nucleare ( http://nuclearsafety.gc.ca/eng/ ), e in Germania Das Bundesamt für Strahlenschutz ( http://www.bfs.de/de/bfs ). Precauzioni di sicurezza relative a questo protocollo sono stati notati nel testo, evidenziate con il simbolo del trifoglio radioattivo ( ).

1. Etichettatura metabolica delle cellule

1. Preparazione delle cellule per l'etichettatura.
   1. Linee cellulari Culture HEK293T base alle condizioni di coltura standard (37 ° C, 5% CO ₂₎ in DMEM con siero fetale di vitello 8% e gentamicina.
   2. Espandere cellule sufficiente perottenere almeno 1 x 10 ⁶ cellule per campione da testare.
   3. Trypsinize cellule e piastra out in 6 pozzetti (diametro 35 mm) a 10 ⁶ cellule / pozzetto.
   4. 24 ore dopo la placcatura le cellule, esprimono la proteina 3xflag-LRRK2 tramite trasfezione o trasduzione mediata da vettori lentivirali.
      1. Per la trasfezione, mescolare per campione 4 microgrammi di DNA (pCHMWS-3xflag-LRRK2 plasmide ^13-15 o pCHMWS-3xflag-LRRK1 plasmide ¹⁵⁾ e 8 ml di polietilenimmina lineare (PEI lineare, 1 mg / ml) in 80 microlitri DMEM (senza aggiunte ). Lasciare complessa per 15-30 minuti quindi aggiungere complesso di cellule mescolando bene nel medio attuale.
      2. Per i vettori lentivirali mediata trasduzione, diluire vettori lentivirali codifica 3xflag-LRRK1 o -2 (LV-3xflag-LRRK1, LV-3xflag-LRRK2, come regola generale, trasducono con il doppio di molte unità di trasduzione, cioè il numero di particelle di vettore funzionali, di lentivector quanto vi sono celle) nel terreno di coltura. Una descrizione del prodotto ione di LV-3xflag-LRRK1 / 2 è stato descritto in precedenza ^15.
   5. Quando le cellule sono 80-100% confluenti (circa 48 ore dopo la trasfezione o trasduzione), lavare le cellule con preriscaldata (37 ° C) DMEM senza fosfati.
2. Cellule Label con ³² P-orto-fosfato.
   1. Tenete a mente i principi generali di sicurezza quando si lavora con le radiazioni.
      1. Eseguire tutte le operazioni con ³² P in un'area designata radiazioni.
      2. Equipaggiamento personale di protezione adatto deve essere indossato - nell'ambito della procedura operativa standard nel nostro laboratorio questi includono camice da laboratorio, due paia di guanti e occhiali protettivi.
      3. g "src =" / files/ftp_upload/50523/50523rad1.jpg "/> Tutti i lavori con ³² P dovrebbe essere schermato dagli utenti di 6 schermi mm perspex per minimizzare l'esposizione.
      4. Dispositivi di monitoraggio personale devono essere sempre utilizzati - entro KUL tutti gli utenti radiazioni open source certificata indossa un badge pellicola attaccato al taschino del camice da laboratorio per monitorare l'esposizione alle radiazioni durante gli esperimenti.
      5. Tutte le superfici sperimentali dovrebbero essere valutati per la radioattività prima e dopo l'uso con un contatore Geiger.
      6. Tutti i materiali di consumo potenzialmente contaminati devono essere smaltiti in stretta aderenza alle linee guida istituzionali per rasmaltimento dei rifiuti dioactive.
   2. Sotto un flusso laminare, preparare un tubo Falcon con 2,1 ml di DMEM senza fosfati (preriscaldata a 37 ° C) per 6 pozzetti di cellule di etichetta.
      1. Per esempio, le cellule di etichette in tutti i pozzetti di una piastra da 6 pozzetti, preparare 12,6 ml di mezzo (= 6 x 2.1). Questo è prevedere 2 medie ml da utilizzare per piastra da 6 pozzetti e di cellule con un eccesso del 5% in volume.
   3. Preparare la panchina a cui verranno eseguiti gli esperimenti con radiazioni ionizzanti. Lo spazio di lavoro è coperto da una stuoia fuoriuscita su cui uno strato protettivo di materiale assorbente viene collocato. Nel caso in cui si utilizza un rivestimento con una superficie impermeabile, posizionare con il lato assorbente alto.
   4. Anche fornire perun vaso Perspex sullo spazio di lavoro e posizionare il tubo di mezzo privo di fosfato in esso.
   5. Prendete il contenitore rivestito di piombo con il flaconcino di ³² ortofosfato P etichettato fuori dal frigorifero e portarla al banco di radioattività. Monitorare il contenitore per contaminazione radioattiva esterna utilizzando un contatore Geiger.
   6. Diluire ³² P etichettato ortofosfato nel tubo di DMEM senza fosfati ad una concentrazione di 24 uCi / ml.
      1. Nota: a 2 ml per piastra da 6 pozzetti e di cellule, questo corrisponde a 5 uCi ³² P etichettato ortofosfato / cm ² di cellule in coltura.
      2. Mantenereil tubo nel vaso perspex.
   7. Chiudere il contenitore con il resto del ³² P etichettato ortofosfato e sostituire in frigo.
   8. Rimuovere le 6 pozzetti con cellule da marcate dal termostato e posto in panchina radioattività.
   9. Rimuovere medio surnatante e gettarlo. Aggiungere 2 ml del mezzo senza fosfati contenenti ³² P etichettato ortofosfato / bene.
   10. Posizionare le piastre di coltura in una scatola di Perspex quindi monitorare il contenitore for contaminazione radioattiva esterna utilizzando un contatore Geiger.
   11. Trasferire la scatola in perspex con celle di un incubatore cellula eucariotica dedicato alla marcatura metabolica isotopica.
   12. Incubare per 1-20 ore a 37 ° C in 5% CO _2.
       1. In generale, è consigliato un tempo incorporazione di 3 ore o più. Il tempo ottimale di incubazione può essere valutata mediante esperimenti di corso di tempo per ogni proteina specifica, se lo desideri.
   13. Optional: trattamento di cellule con il composto.
       1. In esperimenti con trattamento composto (ad esempio un inibitore della chinasi), una fase di trattamento composto è incluso dopo un initial tempo di incubazione, senza compound per permettere l'etichettatura. Dopo il tempo di incubazione desiderato, la casella Perspex contenente le piastre di coltura vengono rimossi dal termostato e portato al banco radioattività.
       2. Medio etichettatura viene rimosso e sostituito con terreno privo di fosfato preriscaldata in cui il composto è diluito alla concentrazione desiderata. Scartare medio in un tubo da 50 ml per la raccolta dei rifiuti, che viene inserito nel vaso Perspex.
       3. Le cellule sono sostituiti nella casella Perspex e poste in incubatrice cella per il tempo di contatto desiderato.
3. Raccogliere lisati di labecellule led.
   1. Rimuovere medio da cellule e gettare nel tubo di raccolta dei rifiuti che si trova nel vaso perspex.
   2. Sciacquare le cellule 2x con ghiaccio TBS freddo (Tris 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7.4, 2 ml / risciacquo), scartando la soluzione di risciacquo in un tubo di raccolta dei rifiuti messi in vaso perspex.
   3. Aggiungere 0,5 ml di ghiaccio freddo immunoprecipitazione (IP) tampone di lisi a ciascun pozzetto e raccogliere lisato pipettando lisato su e giù per allentare tutte le cellule lisate.
      1. Preparare il volume richiesto di IP tampone di lisi (0,5 ml / campione più 5% in eccesso) prima del tempo, aggiungendo il cocktail di inibitori delle proteasi e fosfatasiinibitore cocktail fresco appena prima dell'uso.
      2. La composizione del tampone di lisi è Tris 20 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, Triton 1%, glicerolo 10%, inibitori della proteasi e cocktail inibitore fosfatasi cocktail.
   4. Trasferire il lisato in una provetta e incubare in ghiaccio per almeno 10 min.
   5. Centrifugare lisati in una microcentrifuga a> 5.000 xg per 10 min.
   6. Smaltire i rifiuti radioattivi nei cestini dei rifiuti dedicati che sono memorizzate dietro gli scudi in plexiglas.

2. Analizzare etichettatura delle proteine ​​di interesse

1. Isolare proteina di interesse da immunopurificazione (IP).
   1. Trasferire le provette da microcentrifuga con lisati centrifugati torna al ghiaccio e pipetta il surnatante in una provetta contenente 10 ml di volume letto di equilibrate agarosio flag-M2.
      1. Preparare le provette con equilibrate flag-M2 agarosio perline prima del tempo.
      2. Per questo, pipetta un volume di bandiera-M2 liquami agarosio corrispondente a 10 microlitri volume del letto per campione più un eccesso del 5%.
         1. Generalmente, a 10 microlitri volume del letto di perline corrisponde a 20 microlitri slurry. Consultare la scheda prodotto per maggiori dettagli.
      3. Equilibrare i beads di risciacquo 3x in 10 volumi (rispetto al volume del letto) di tampone di lisi IP.
      4. Distribuire perline equilibrate in modo uniforme a 10 microlitri di volume letto / tubo in tante provette come ci sono campioni. Etichettare le provette con un identificatore per ciascun campione.
   2. Trasferire le provette da microcentrifuga a 50 ml provette (circa 6 microcentrifuga tubes/50 tubo ml) contrassegnati con un simbolo del trifoglio radioattivo e tenere in ghiaccio.
   3. Campioni di trasferirli su un dispositivo rotante dietro uno scudo Perspex nell'area designata di una cella frigorifera per la fine rispetto a fine miscelazione a 4 ° C per 1-20 ore.
   4. Trasferire i campioni di uno spazio di lavoro designato su ghiaccio.
   5. 50523rad1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50523/50523rad1.jpg "/> Spin giù la proteina legata flag-M2 agarosio in una microcentrifuga (1.000 xg, 1 min) e scartare il surnatante in un tubo di raccolta dei rifiuti.
   6. Lavare le proteine ​​legato flag-M2 agarosio risospendendo in 1 ml IP tampone di lavaggio.
      1. Composizione del tampone di lavaggio IP: Tris 25 mM pH 7.5, NaCl 400 mM, Triton 1%. Si raccomanda di includere anche gli inibitori della proteasi e fosfatasi nel tampone di lavaggio per le proteine ​​sensibili alla degradazione da proteasi co-purificazione o di defosforilazione da fosfatasi co-purificazione.
      2. Spin giù le proteine ​​legato flag-M2 agarosio in una microcentrifuga (1.000 xg, 1 min) e scartare il surnatante in una raccolta di rifiutitubo zione.
      3. Ripetere il 3x fase di lavaggio.
   7. Dopo i lavaggi, risospendere le sfere in 1 ml IP tampone di lavaggio (Tris 25 mM pH 7.5, _MgCl2 10 mM, ditiotreitolo (DTT) 2 mM, Triton 0,02%, beta-glicerofosfato 5 mm, Na ₃ VO ₄ 0,1 mm).
   8. Spin giù le proteine ​​legate flag-M2 agarosio in una microcentrifuga (1.000 xg, 1 min) e scartare il surnatante in un tubo di raccolta dei rifiuti. Rimuovere tutti tampone in eccesso.
   9. Risospendere le sfere in 40 & m(Tris-HCl 160 mM pH 6,8, SDS 2%, DTT 0,2 M, glicerolo 40%, blu di bromofenolo 2 mg / ml) l di tampone campione SDS loading IP; u.
      1. I campioni possono essere analizzati immediatamente o conservate in un congelatore a -20 ° C per ulteriore analisi.
         1. Per la conservazione dei campioni a -20 ° C, posto i campioni in contenitori di tubo o le scatole in una scatola di Perspex in una radioattivo simbolo del trifoglio freezer etichetta dedicata per lo stoccaggio di campioni radioattivi.
   10. Smaltire i rifiuti radioattivi nei cestini dei rifiuti dedicati che sono memorizzate dietro gli scudi in plexiglas.
2. Risolvere i campioni IP tramite SDS-PAGE e blot a membrana PVDF.
   1. Campioni di calore in tampone di caricamento a 95 ° C per 2 minuti e centrifugare per 1 min a> 1.000 xg per agglomerare le perline.
   2. Preparare il modulo gel elettroforesi proteine ​​in panchina radioattività dietro uno schermo Perspex.
   3. Caricare i campioni su un 3-8% Tris-acetato SDS-PAGE gel.
      1. Questo tipo di gel è adatto per risolvere alto peso molecolare (HMW) proteine. Altri tipi di gel possono inoltre essere idonei, ad esempio un 4-20% Bis-Tricina gel o Tris-glicina 4-20% gel.
      2. Includere un marcatore di peso molecolare che è adatto per discernere le dimensioni delle proteine ​​HMW.
   4. Eseguire elettroforesi a 150 V per 1 ora.
   5. Dopo l'elettroforesi, rimuovere il gel dal suo involucro di plastica e trasferire il gel in un contenitore con Western blotting buffer di trasferimento.
      1. Composizione del Western blotting buffer di trasferimento: Tris 50 mM, glicina 40 mM, SDS 0,04%, metanolo 20%.
      2. Tagliare le parti del gel che sporgono come i separatori e così porzione inferiore del gel che sporge.
   6. Preparare un fluoruro di polivinilidene (PVDF) membrana per gel mediante immersione in metanolo per 1 minuto, poi posto in tampone di trasferimento.
      1. Le membrane sono tagliati ai s dimensioni ame come il gel più un margine di 3 mm.
   7. Posizionare un modulo blotting semi-dry in panchina radioattività e rimuovere il coperchio e la piastra di elettrodo superiore.
   8. Preparare il panino assorbente sulla superficie del modulo blotting semi-dry.
      1. Bagnare un forte spessore (2,5 millimetri di spessore, 7,5 x 10 cm di larghezza) assorbente filtro buffer di trasferimento e posto sulla piastra inferiore del modulo blotting.
      2. Posizionare la membrana PVDF pre-bagnato sul filtro assorbente.
      3. Posizionare con cura il gel sulla membrana PVDF ed eliminare eventuali bolle d'aria.
      4. 523/50523rad1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50523/50523rad1.jpg "/> Completa il panino macchia bagnando un filtro assorbente di spessore in più nel buffer di trasferimento e posto sulla piastra inferiore del modulo assorbente. Rimuovere tutta l'aria bolle eventualmente presenti nel panino assorbente.
         Si prega di notare che la descrizione qui proposta è compatibile con il sistema SD BioRad trans-blot cui elettrodi sono tali che le proteine ​​migrano verso il basso sulla membrana. Altri sistemi blotting sono compatibili anche con questi passaggi con adattamenti minori, come quelli eventualmente necessarie per tener conto un'altra direzione blotting o, nel caso di blotting serbatoio supplementare rifiuti liquidi da smaltire nello stesso modo come buffer per elettroforesi sopra.
   9. Rimuovere tutto il tampone in eccesso con carta assorbente e posizionare la piastra superiore e la copertura della semi-d ry modulo assorbente.
   10. Trasferire le proteine ​​a 15 V per 1-2 ore.
   11. Durante questo tempo, ripulire il modulo elettroforesi.
       1. Smaltire i rifiuti radioattivi nei cestini dei rifiuti dedicati che sono memorizzate dietro gli scudi in plexiglas.
       2. Sciacquare il modulo elettroforesi con acqua distillata (AD) ed eliminare l'acqua di lavaggio nel contenitore di rifiuti liquidi radioattivi.
   12. 0523/50523rad1.jpg "/> Dopo il trasferimento, rimuovere la membrana PVDF con proteine ​​macchiati dal modulo blotting.
   13. Facoltativo: eseguire una colorazione Ponceau S delle proteine ​​macchiati di visualizzare le proteine.
       1. Trasferire il blot di una nave incubazione superficiale blot contenente soluzione Ponceau S e incubare per 5 min.
       2. Sciacquare 2x rapidamente in AD.
   14. Essiccare la membrana.
3. / Files/ftp_upload/50523/50523rad1.jpg "/> Esegui autoradiografia.
   1. Esporre la membrana ad una piastra fosforescenza per 1-5 giorni.
   2. Leggi la 32P al largo della piastra fosforescenza esposto utilizzando uno scanner tempesta 840 fosforescenza o equivalente e salvare l'immagine come tiff alta risoluzione.
4. Rileva i livelli di proteina tramite immunorivelazione.
   1. Reidratare le membrane per immersione brevemente in metanolo, poi il trasferimento a una macchia nave incubazione superficiale con PBS.
   2. Bloccare le membrane in PBS-T (PBS con 0,1% Triton) contenente 5% di latte.
   3. Incubare le macchie con anti-LRRK2 anticorpo ^13,16 o anti bandiera di anticorpi e di processo ulteriormente con adeguate operazioni di lavaggio e incubazione anticorpo secondario.
   4. Eseguire il rilevamento chemiluminescenza di confermare i livelli di proteina relativi di LRRK2.
5. Quantificare incorporazione di ³² P in LRRK2.
   1. Eseguire l'analisi densitometrica delle bande sulle autoradiogrammi macchia e immunoreactivity utilizzando software appropriato, come il software ImageJ, un programma freeware disponibile sul Istit Nazionalesce del sito web Salute ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ ).
   2. Calcolare i livelli costitutivi fosfato come il rapporto tra il segnale autoradiografia sopra il livello immunoreattività.

Risultati

Al fine di confrontare i livelli di fosforilazione complessivi di LRRK1 e LRRK2 nelle cellule, 3xflag etichettato LRRK1 e LRRK2 sono stati espressi nelle cellule HEK293T ^15. Le cellule sono state coltivate in piastre da 6 pozzetti e marcate con ^32P ed analizzati come descritto sopra nel testo protocollo. Figura 1 mostra risultati rappresentativi per marcatura metabolica di LRRK1 e LRRK2 in cellule HEK293T. Incorporazione di fosfato radioattivo viene osservata sia per LRRK1 e ...

Discussione

Questo documento fornisce un protocollo di base per saggiare il livello di fosforilazione generale di LRRK1 e LRRK2 in linee cellulari mediante marcatura metabolica con ³² P-ortofosfato. La strategia generale è semplice. Affinity etichettato LRRK proteine ​​sono espresse in cellule HEK293T che sono esposti al terreno contenente ³² P-ortofosfato. Il ³² P-ortofosfato viene assimilato dalle cellule dopo solo poche ore di incubazione e di tutte le molecole nella cellula contiene fosfati...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phosphorus-32 Radionuclide, 1 mCi, buffer disodiumphosphate in 1 ml water	Perkin Elmer	NEX011001MC
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (D-MEM) (1X), liquid (high glucose)	Invitrogen	11971-025	This medium contains no phosphates
Anti Flag M2 affiinty gel	Sigma	A2220	For an equivalent product with red colored gel (useful to more easily visualize the beads), use cat. No. F2426.
Extra thick blotting filter	Bio-Rad	1703965
Ponceau S solution	Sigma	P7170