الأيضية وصفها وغشاء التقطير للالمقارن تحليل البروتين من<em&gt; نبات الأرابيدوبسيس thaliana</em&gt; الثقافات تعليق خلية

Summary

نحن هنا تصف طريقة قوية للتجزئة أغشية البلازما مصنع المنظفات في الأغشية القابلة للذوبان مقاومة والمنظفات يعتمد على خليط من غير المسماة في الجسم الحي بالكامل ^و15 N المسمى الثقافات خلية نبات الأرابيدوبسيس thaliana. يتم تطبيق هذا الإجراء للدراسات المقارنة البروتين لفهم العمليات الإشارة.

Abstract

البلازما microdomains غشاء هي الميزات على أساس الخصائص الفيزيائية للدهون وستيرول البيئة ولها أدوار معينة في عمليات الإشارة. استخراج microdomains غشاء التخصيب ستيرول من الخلايا النباتية لتحليل البروتين هو مهمة صعبة ويرجع ذلك أساسا إلى إعداد خطوات متعددة ومصادر التلوث للمن المقصورات الخلوية الأخرى. يشكل غشاء البلازما فقط حوالي 5-20٪ من جميع الأغشية في الخلايا النباتية، وبالتالي عزل عالي النقاء جزء غشاء البلازما يمثل تحديا. ويتضمن الطريقة المستخدمة في كثير من الأحيان مائي التقسيم على مرحلتين في غليكول البولي ايثيلين وديكستران والتي ينتج عنها حويصلات غشاء البلازما بدرجة نقاء 95٪ ^1. microdomains غشاء ستيرول الغنية داخل غشاء البلازما هي غير قابلة للذوبان على العلاج مع المنظفات غير أيوني الباردة في درجة الحموضة القلوية. يمكن فصل هذا الكسر غشاء مقاومة للالمنظفات من غشاء البلازما بالجملة من قبل تنبيذ فائق في النحوالتدرج ucrose ^2. في وقت لاحق، والبروتينات يمكن استخلاصها من الموجات المنخفضة الكثافة من التدرج السكروز بواسطة الميثانول / كلوروفورم هطول الأمطار. وبعد ذلك يتم هضمها التربسين البروتين المستخرج، المحلاة وتحليلها أخيرا LC-MS/MS. هو الأمثل لدينا بروتوكول استخراج لmicrodomains-ستيرول الغنية لإعداد نظيفة مقاومة للالمنظفات الكسور غشاء الخلية من ثقافات نبات الأرابيدوبسيس thaliana.

نستخدم وضع العلامات الأيضية الكامل للنبات الأرابيدوبسيس thaliana الثقافات الخلية التعليق مع K ¹⁵ NO ₃ كمصدر للنيتروجين فقط للدراسات المقارنة البروتين الكمي التالية المعالجة البيولوجية من الفائدة ^3. عن طريق خلط نسب متساوية من الثقافات خلية وصفت وغير المسماة لاستخراج البروتين مشتركة يتم الاحتفاظ تأثير على خطوات إعداد النتيجة النهائية الكمية كحد أدنى. أيضا خسائر ماديه اثناء الاستخراج سوف تؤثر على كل من الرقابة وعينات المعاملة في نفس الطريق، ووبالتالي د نسبة الضوء ويتنفس الببتيد سوف تظل ثابتة. في الطريقة المقترحة إما المسمى أو زراعة الخلايا غير المسماة تخضع لعملية المعالجة البيولوجية، في حين أن الآخر بمثابة السيطرة ^4.

Introduction

في عام 1972، اقترح جوناثان سينغر ونيكلسون نموذج غارث فسيفساء السائل نموذج هيكل الأغشية الخلوية، ليحل محل النموذج ساندويتش البروتين الدهني البروتين الذي تم المقبولة عموما في أوائل 1960s. المغني ونيكلسون افترض أن غشاء بيولوجي يمكن اعتباره السائل ثنائي الأبعاد حيث نشر كل الدهون والبروتينات جزيئات بحرية وبسهولة ^5. منذ ذلك الوقت، نموذج هيكل غشاء البلازما والمعرفة لتكوين غشاء أصبح أكثر تعقيدا. بشكل خاص، داخل غشاء البلازما، والهياكل مثل المجمعات البروتين والدهون / ستيرول مقرها microdomains المختلين هيكليا يمكن ملاحظتها. في الأغشية النموذج الصناعي ^6،7، يمكن الجامدة والدهون الإسفنجية فصل أفقيا من الأنواع الدهون الأخرى لتشكيل الأقاليم مع ميزات المادية المتغيرة. ويتسبب هذا الفصل أساسا داخل الغشاء الخلوي من خصائص الربط الذاتي بين الجامدة وسا غايةالسلاسل الهيدروكربونية turated من phopsho والدهون الإسفنجية ^8. بشكل خاص، يرن ستيرول جامدة تفضل التفاعل مع صلابة والأنواع الدهون المشبعة واستقامة هذه التفاعلات إجبار السلاسل الهيدروكربونية المجاورة إلى أكثر التشكل الموسعة، زيادة سمك الغشاء وصلابة.

كان واحدا من السمات يلاحظ عموما من ستيرول التخصيب microdomains غشاء الصلابة سفرهم عند العلاج مع المنظفات غير الأيونية مثل هذا تريتون X-100 أو بريج 35. ويعتقد أن هذه الكسور لتكون متطابقة مع microdomains الغشاء وكانت تسمى أغشية مقاومة المنظفات (DRM) على أساس على طريقة إعداد البيوكيميائية ^2. استخدام المنظفات غير أيوني خلال استخراج DRM تلقى بعض الانتقادات مثل إعداد DRM البيوكيميائية قد لا تتوافق مباشرة إلى أي مقصورة غشاء محددة داخل الخلية الحية ^9. وخاصة، والمنظفات لنسبة البروتين يبدو حاسما في مثل هذه الاستعدادات، ويمكن ق المنظفات المختلفة، فضلا عن كميات المنظفات المختلفة تسفر عن تكوين مختلفة من المنظفات مقاومة الغشاء جزء ^10. ومع ذلك، هناك أدلة على أن الأنواع بروتين معين المنتسبين على وجه التحديد مع هذه المجالات غشاء ستيرول الغنية الخلوية، والتي يتم إثراء هذه البروتينات جيدا في التحضيرات الكيميائية الحيوية المقاومة للكسور الغشاء المنظفات ^11. كان جوهر البروتينات التي تم العثور عليها في المصنع DRM كسر، والتي كان وجودها في DRMS ​​ستيرول تعتمد، ولا سيما البروتينات GPI الراسية، مثل البروتينات مثل fasciclin arabinogalactan (إف إل أي إس) وأفراد من عائلة البروتين SKU. كما يشير بعض البروتينات، مثل تحركات مثل مستقبلات أو phospholipases تم العثور على ^11. هذه النتائج متسقة مع العديد من الدراسات على البروتين microdomains غشاء الثدييات ^12،13. أيضا في النباتات هناك أدلة متزايدة لدور microdomains الغشاء في سياق الاستجابة للضغط النفسي ^{14 -}16.

بروتوكول الموصوفة هنا يوفر طريقة قوية للتجزئة من microdomains غشاء البلازما، ويستخدم بشكل خاص على البروتين لتركيز المنظفات التي تسمح لنا لتصوير الاجهاد الناجم التعديلات للستيرول الغنية غشاء مقصورة ^4،11،14.

Protocol

PROCEDURE

الكواشف ومخازن الشائعة المستخدمة في بروتوكول استخراج:

1. مختبر الدفع النفاث المتوسطة للنبات الأرابيدوبسيس thaliana الثقافات الخلية تعليق
   • 3 ميكرومتر H ₃ BO ₃
   • 3 ميكرومتر MnSO ₄ × H ₂ O
   • 1.1 ميكرومتر ZnSO ₄ × 7 H ₂ O
   • 0.15 ميكرومتر KJ
   • 0.03 ميكرومتر نا ₂ زارة النفط ₄ × 2 H ₂ O
   • 3 نانومتر كوكلي _{2 ×} 6 H ₂ O
   • 3 نانومتر كبريتات النحاس ₄ × 5 H ₂ O
   • 0.9 مم CaCl _{2 ×} 2 H ₂ O
   • 0.5 ملي MgSO ₄ × 7 H ₂ O
   • 0.5 ميكرومتر FESO ₄ × 7 H ₂ O
   • 0.5 ميكرومتر نا ₂ EDTA × 2 H ₂ O
   • 0.12 ميكرومتر الثيامين حمض الهيدروكلوريك
   • 0.16 ميكرومتر حمض النيكوتينيك
   • 0.097 ميكرومتر حمض الهيدروكلوريك البيريدوكسين
   • 0.107 ميكرومتر NAA
   • 0.375 ملي KH ₂ PO ₄
   • 0.061 ملي ناه2 ص ₄ × 2 H ₂ O
   • 0.039 ملي نا ₂ هبو ₄
   • 0.027 ملي جليكاين
   • 0.56 ملي ميو اينوزيتول
   • 1.5٪ سكروز
   • 10 ملي K ¹⁴ NO ₃ أو 10 ملي K ¹⁵ NO ₃

ملاحظة: يجب أن يتم ضبط درجة الحموضة في مختبر الدفع النفاث المتوسطة إلى 5.7 مع KOH. يجب أن تكون معقمة والمتوسطة عن طريق الترشيح أو التعقيم قبل استخدامها.

2. العازلة H
   • 100 ملي HEPES KOH-(الرقم الهيدروجيني 7.5)
   • 250 ملي السكروز
   • 10٪ (ث / ت) الجلسرين
   • 5 ملي EDTA
   • 5 ملم حمض الاسكوربيك
   • 0.6٪ (ث / ت) PVP K-25 K-30 أو
   • 5 ملي DTT (إضافة جديدة)
   • 1 ملم PMSF (إضافة جديدة)
   • البروتيني والفوسفاتيز مثبطات (إضافة جديدة)
     • 50 ملي ناف
     • 1 ملم نا ₃ VO ₄
     • 1 ملم benzamidin
     • 0.3 ميكرومتر mikrocystin
     • 4 ميكرومتر leupeptin
     • مثبط البروتياز كوكتيل
3. العازلة R
   • 5 ملي فوسفات البوتاسيوم
   • 0.33 M السكروز
   • 3 ملي بوكل
   • 0.1 ملي EDTA
   • 1 ملم DTT (إضافة جديدة)
4. العازلة TNE
   • 25 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.5
   • 150 ملي مول كلوريد الصوديوم
   • 5 ملي EDTA
5. نظام مرحلتين (6 ز النظام هو مناسبة لمدة تصل إلى 15 غرام من العينة الوزن الطازج) طريقة التحضير
   في 15 مل فالكون المكونات أنبوب مزيج المدرجة أدناه وتخلط جيدا:
   • 20٪ (ث / ث) ديكستران T500 - 2.6 ز
   • 40٪ (ث / ث) بولي (جلايكول الإثيلين) (PEG 3350) - 1.3 ز
   • السكروز - 0.678 غ
   • 0.2 M الفوسفات البوتاسيوم، ودرجة الحموضة 7،8-،15 مل
   • 2 M بوكل - 0.014 مل
   • يضاف الماء حتى الكتلة الاجمالية للنظام على مرحلتين هو 6 ز.
6. حلول السكروز في المخزن TNE
   • 2.4 M، M 1.6، 1.4 M، 0.15 M
7. الكواشف لالتربسين الهضم
   • UTU: 6 M اليوريا، 2 M ثيويوريا (الرقم الهيدروجيني 8.0 مع 10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك)
   • العازلة التخفيض (1 ميكروغرام / ميكرولتر DTT في الماء؛ 6.5 ملم)
   • العازلة الألكلة (5 ميكروغرام / ميكرولتر iodoacetamide في الماء؛ 27 ملي)
   • LysC ببتيداز داخلية (0.5 ميكروغرام / ميكرولتر)
   • التربسين، تعديل درجة التسلسل (0.4 ميكروغرام / ميكرولتر)
8. الكواشف لتحلية على الببتيد C ₁₈
   • الحل إعادة تعليق: حمض 2٪ trifluoroacetic (TFA)، و 5٪ في الماء أسيتونتريل
   • الحل ج: حمض الخليك 0.5٪
   • الحل ب: 80٪ أسيتونتريل، وحامض الخليك 0.5٪
9. الكواشف لتخصيب phosphopeptide
   • الحل ج: 0.1٪ TFA، 5٪ أسيتونتريل
   • الحل ب: 0.1٪ TFA، 80٪ أسيتونتريل
   • تيو ₂ 10 ميكرون
   • الأمونيا (الأسهم حل 25٪)
   • تأكسد (الأسهم 100٪)

بروتوكولات

1. وصفها التمثيل الغذائي للنبات الأرابيدوبسيس thaliana الثقافات تعليق خلية

1. ينمو نبات الأرابيدوبسيس العقيد-0 الخليةالتعليق الثقافات المستمدة من أوراق ¹⁷ في الكامل ¹⁴ N-مختبر الدفع النفاث المتوسطة ^(18، وانظر قسم "الكواشف المشتركة ومخازن") ومجموعة واحدة من الثقافات في ¹⁵ N-مختبر الدفع النفاث في قارورة معقمة المتوسطة في حالة الضوء ثابتة عند 80 و 100 ميكرومول / م ² ق، 23 درجة مئوية، في إطار ثابت تهتز في 120 دورة في الدقيقة.
2. للحفاظ على الثقافات الخلية، وتطعيم 400 مل من الطازجة المتوسطة مختبر الدفع النفاث مع 40 مل من ثقافة سبعة ايام المحمولة القديمة في 1 L القوارير.
3. حصاد الثقافات الخلية يحدث عبر فراغ شفط خلال قمع الزجاج واسعة مع شبكة الفولاذ المقاوم للصدأ. الخلايا تتراكم على لوحة شبكة والقمع، ويمكن بسهولة أن تجمع من هناك. ينصح الخلايا ليتم تجميدها في -80 درجة مئوية أو في النيتروجين السائل قبل طحن.

ملاحظة: للحصول على ¹⁵ N الثقافات الخلية المسمى أيضي استخدام K ¹⁵ NO ₃ كمصدر وحيد للنيتروجين لمدة سنتين على الأقل المقاطع اكثر من اسبوعين ^19. في بةriments لالبروتيوميات نسبية، واستخدام زراعة الخلايا N ¹⁵ المسمى، وكذلك الحفاظ على الثقافة غير المسماة في المتوسط ​​العادي. وبعد ذلك يتم تطبيق المعالجة البيولوجية للثقافة إما المسمى أو غير المسماة، في حين أن الآخر بمثابة السيطرة (الشكل 1). لإعداد البروتين، سيتم الجمع بين الثقافتين ^20. عند التخطيط الإعداد التجريبية، نوصي تفكر في الإعداد ووضع العلامات متبادلة ⁴ التي يتم تطبيق نفس العلاج مرة واحدة إلى ¹⁵ N الخلايا المسمى ومرة واحدة للخلايا غير المسماة وغير المسماة منها أو ¹⁵ خلايا N المسمى بمثابة الضوابط. في هذه الحالة، هناك حاجة إلى كميات مضاعفة من الثقافات الخلية.

2. غشاء البلازما تنقية

ملاحظة: تتم جميع خطوات إضافية في الغرفة الباردة و / أو على الجليد ما لم يتم الإشارة إلى خلاف ذلك.

1. التجانس الخلايا من حوالي 1 لتر من 7 أيام الثقافات القديمة تعليق خلية في النيتروجين السائل.ويمكن تخزين المواد في -80 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.
2. مزيج نفس الكميات من مزارع الخلايا المجمدة وصفت وغير المسماة على أساس الوزن الطازج في كوب وإضافة 2 مجلدات من العازلة H فورا. في حالة إعداد microdomain غشاء يقترح استخدام لا يقل عن 7 غرام من الوزن الطازج كل من الخلايا المسمى وغير المسماة.
3. ضع الكأس على شاكر ويهز حتى ذاب المادية والحل هو السائل ودون بلورات الثلج.
4. تحديد جناسة من خلال طبقة واحدة من Miracloth إلى 50 مل أنابيب الطرد المركزي.
5. عينات التوازن مع العازلة H وأجهزة الطرد المركزي في 10،000 x ج لمدة 8 دقائق.
6. تحميل طاف في تبريد قبل أنابيب الطرد المركزي فائقة (مثل الدوار بيكمان كولتر SW31Ti)، مع حجم حوالي 32 مل
7. عينات التوازن مع العازلة H وبيليه microsomes بواسطة الطرد المركزي في 100،000 x ج في 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة باستخدام بيكمان SW32Ti الدوار.
8. إزالة طاف بعد الطرد المركزي.

ملاحظة: طاف تحتوي على بروتينات قابلة للذوبان. يمكن حفظ كمية صغيرة من هذا الكسر لمزيد من هطول البروتين وتحليل لاحقة أيضا من البروتينات القابلة للذوبان.

9. resuspend الكرية غشاء من كل عينة في كمية منها من العازلة R وتحميل على الجزء العلوي من U1 النظام على مرحلتين (الشكل 2). إذا تم استخدام 6 ز النظام على مرحلتين، تحميل بالضبط 2 غرام من بيليه معلق الغشاء.

ملاحظة: الحجم النهائي من العازلة R يعتمد على حجم النظام المرحلة الثانية التي سوف يتم استخدامها (~ 1.6 مل من العازلة R هو مطلوب عند استخدام 6 ز النظام). فمن المستحسن لاستخدام كميات أقل من العازلة إعادة تعليق لذلك عازلة نقية يمكن أن تضاف إلى النظام على مرحلتين للحصول على الوزن طالب، بدلا من استخدام الكثير عازلة للذوبان ولن تكون قادرة على تحميل العينة كاملة على النظام مرحلتين.

10. تحميل نفس الحجم من الذهب الخالص العازلة R المستخدمة لعشره عينة إعادة تعليق على U2.
11. مزيج ببطء U1 و U2 الأنابيب بواسطة قلب لهم 30X (حوالي 1 انعكاس / ثانية).

ملاحظة: لا يهز بقوة النظام على مرحلتين. فإنه يمكن أن يسبب عدم وجود فصل المراحل في خطوة تنبيذ فائق.

12. الطرد المركزي العينات في 1500 XG في 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
13. إزالة طاف بعد الطرد المركزي.
14. نقل المرحلة العليا من U1 U2 على وكرر الطرد المركزي في 1500 x ج في 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
15. نقل المرحلة العليا من U2 في أنابيب نابذة فائقة السرعة SW41Ti وتمييع مع خمسة مجلدات من العازلة R وتخلط جيدا.

ملاحظة: قد يكون المرحلة النهائية العلوي إلى أن تنقسم إلى أنابيب نابذة فائقة السرعة منفصلة قبل أن تتمكن من أن تضعف خمس مرات.

16. الطرد المركزي العينات في 200،000 XG في 4 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة باستخدام الدوار SW41Ti.
17. بيليه resuspend في غشاء األصغرل كمية من العازلة TNE (عادة 200 ميكرولتر من العازلة المستخدمة) لعزل أغشية مقاومة المنظفات.

ملاحظة: يمكن حفظ كمية صغيرة من هذا الكسر لتحليل الغشاء البلازمي غير المجزأ.

ملاحظة: يمكن تخزين جزء غشاء البلازما في 4 درجات مئوية خلال الليل قبل تجزئة في أغشية مقاومة المنظفات والمنظفات كسور قابلة للذوبان.

3. المنظفات مقاومة غشاء إعداد

1. تحقق تركيز جزء غشاء البلازما من قبل برادفورد مقايسة.
2. إضافة تريتون X-100 إلى البلازما جزء الغشاء. تركيز النهائي من المنظفات يجب ان تبقى بين 0.5-1٪. المنظفات إلى البروتين الوزن لنسبة الوزن يجب ان تبقى بين 13-15.
3. عينات هزة في حوالي 100 دورة في الدقيقة عند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
4. إضافة ثلاثة مجلدات من 2.4 M السكروز إلى مجلد واحد من غشاء البلازما معاملة للحصول على 1.8 M تركيز النهائي من السكروز.
5. إعداد التدرج السكروز في SW41Ti أنابيب نابذة فائقة السرعة عن طريق تحميل حلول السكروز منها على أعلى من 1.8 M جزء كما هو موضح في الشكل 3.
6. الطرد المركزي العينات في 250،000 XG في 4 درجة مئوية لمدة 18 ساعة باستخدام الدوار بيكمان SW41Ti.
7. إزالة بعناية أنابيب نابذة فائقة السرعة من الدوار لتجنب تعطيل الفرقة منخفض الكثافة التي قد تكون واضحة باعتباره حلقة حليبي في واجهة من 0.15 M/1.4 M السكروز. في بعض الأحيان يمكن أن ينظر إليه شيئا ولكن الكسر لا يزال يحتوي على البروتين المنظفات مقاومة الكسر.
8. إزالة جزء من 0.75 حجم مل من أعلى التدرج. الكسور 2 و 3 التي تغطي حجم حوالي 1.5 مل فوق الحلبة البيني و 0.5 مل أدناه تمثل مقاومة المنظفات جزء الغشاء. جمع هذه الكسور في 15 مل أنابيب فالكون. الكسور 9 و 10 تحتوي على المنظفات القابلة للذوبان جزء الغشاء ويمكن أيضا أن يتم جمعها للمقارنة. لمزيد من التحليل، تجمع fractالأيونات 2 و 3 وكذلك الكسور 9 و 10.

4. استخراج البروتينات من الكسر مقاومة للمنظفات بواسطة الميثانول / كلوروفورم

ملاحظة: تتم جميع الخطوات في درجة حرارة الغرفة.

1. إضافة 4 مجلدات من الميثانول إلى الكسور التي تم جمعها ودوامة بدقة.
2. إضافة 1 حجم كلوروفورم، دوامة بدقة.
3. إضافة 3 مجلدات من الماء، دوامة بدقة.
4. الطرد المركزي العينات في 2000 x ج لمدة 5 دقائق باستخدام جهاز للطرد المركزي الفوق (على سبيل المثال إيبندورف 5417R).
5. إزالة المرحلة المائية فوق طبقة البروتين في الطور البيني.
6. إضافة 3 مجلدات من الميثانول، ودوامة تماما.
7. الطرد المركزي العينات في 4000 x ج لمدة 10 دقيقة.
8. إزالة طاف وتجفيف بيليه. بيليه المجففة مستعدة لعملية الهضم في الحل.

5. في حل التربسين الهضم

ملاحظة: في هذا الإجراء يتم تنفيذ جميع الخطوات فيدرجة حرارة الغرفة للحد من اشتقاق غير المرغوب فيها من الأحماض الأمينية الجانبية سلاسل من denaturants.

1. حل عينة صغيرة من حيث الحجم 6 M اليوريا، 2 M thiurea، ودرجة الحموضة 8 (UTU). استخدام منخفضة تصل إلى حجم كما هو متوافق مع العينة (عادة حوالي 40 ميكرولتر).
2. عينات تدور solubilized في UTU في 5،000 x ج في جهاز للطرد المركزي الفوق (على سبيل المثال إيبندورف 5417R) لمدة 10 دقيقة لتكوير أي مادة غير قابلة للذوبان.
3. يجب أن يكون الرقم الهيدروجيني من الحل النهائي بالقرب 8.0 لأفضل التربسين الهضم. تحقق مع شرائح الأس الهيدروجيني.
4. إضافة 1 ميكرولتر من العازلة التخفيض لكل 50 ميكروغرام من البروتين العينة واحتضان 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

ملاحظة: فقط تقدير تقريبي للمحتوى البروتين ضروري. عندما هو مبلغ عينة محدودة فمن الأفضل أن تضحي دقة بدلا من إضاعة عينة على فحص البروتين.

5. إضافة 1 ميكرولتر من العازلة الألكلة لكل عينة البروتين 50 ميكروغرام واحتضان 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
6. إضافة 0.5 ميكرولتر من LysC في 50 ميكروغرام البروتين العينة واحتضان لمدة ثلاث ساعات في درجة حرارة الغرفة ثابتة مع اهتزاز في 700 دورة في الدقيقة. إذا لزم الأمر، يمكن للهضم أيضا أن تنفذ بين عشية وضحاها. ومع ذلك، فمن غير المستحسن تمديد الوقت في درجات حرارة دافئة لأنها يمكن أن تزيد من فقدان الببتيد بسبب الامتزاز على المواد أنبوب بلاستيكي تحت مائي درجة الحموضة 8 شروط.
7. تمييع عينة مع أربعة مجلدات 10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.

ملاحظة: هذه الخطوة غير ضرورية على الاطلاق لتخفيف تركيز اليوريا كما التربسين حساس جدا لالملح العالية.

8. إضافة 1 ميكرولتر من التربسين في 50 ميكروغرام البروتين العينة واحتضان بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة ثابتة مع اهتزاز في 700 دورة في الدقيقة.
9. يحمض العينات إلى 0.2٪ TFA تركيز النهائي للوصول إلى درجة الحموضة 2 (إضافة حوالي 1/10 من حجم حمض trifluoracetic 2٪).

ملاحظة: يمكن تخزين العينات في - 20 درجة مئوية حتى استخدامها أبعد من ذلك، ولكن من الأفضل لتخزينلهم على StageTips في 4 درجات مئوية إذا كان لفترة قصيرة (أسبوع واحد) أو تخزينها بعد StageTips تحلية.

6. تصنيع _C-18 StageTips

1. وضع Empore القرص C18 على سطح مستو ونظيف مثل البلاستيك القابل للتصرف طبق بيتري.
2. لكمة من قرص صغيرة باستخدام إبرة حادة ذات الرؤوس تحت الجلد مع قطرها 1.5 مم. القرص العصي في الإبرة، ويمكن نقلها إلى طرف ماصة.
3. دفع القرص من الإبرة وإصلاحه في مستدق من طرف ماصة بواسطة قطعة من السيليكا تنصهر أو أنابيب المناسب في الداخل من الإبرة.

ملاحظة: StageTips يمكن تخزين جاف في درجة حرارة الغرفة ^21.

7. استخدام _C-18 StageTips لإزالة الملوحة وتركيز الببتيد

1. حالة A-C ₁₈ StageTip من خلال وضع 50 ميكرولتر من محلول B على استعداد StageTip. تدور طرف في أجهزة الطرد المركزي في 2000 دورة في الدقيقة لمدة 2 دقيقة في الفوق جentrifuge (على سبيل المثال إيبندورف 5417R).

ملاحظة: استخدام محولات تدور StageTips في أجهزة الطرد المركزي إيبندورف، وسيتم جمع السائل في أنبوب رد فعل 2 مل. لاستعدادات واسعة النطاق، ويمكن أيضا أن توضع في مرحلة نصائح رف طرف مع 96 ميكرولتر من النصائح 200 والسائلة يمكن جمعها في وحة microtiter.

ملاحظة: لا تستخدم سرعات أعلى من 3،000 x ج في جهاز للطرد المركزي الفوق (على سبيل المثال إيبندورف 5417R) بسبب خطر تخرج القرص C ₁₈ من غيض.

2. تتوازن في StageTip باستخدام 100 ميكرولتر حل A. تدور طرف في أجهزة الطرد المركزي في 5000 x ج في جهاز للطرد المركزي الفوق (على سبيل المثال إيبندورف 5417R).
3. كرر الخطوة 2.
4. عينة الحمل على القرص بواسطة pipetting بعناية العينة إلى غيض ماصة مع القرص الداخل.

ملاحظة: قرص واحد يمكن ربط تقريبا. 100 ميكروغرام من البروتين.

5. تدور نصائح في مntrifuge حتى مجلدا كاملا من عينة تمر عبر القرص C _18.
6. غسل StageTips مرتين مع 100 ميكرولتر من الحل A. تدور نصائح في أجهزة الطرد المركزي.

ملاحظة: يمكن تخزين StageTips غسلها وتحميلها في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع.

7. أزل العينة مع 40 ميكرولتر من محلول B. جمع شطافة في الطازجة 1.5 مل أنبوب التفاعل.
8. تركيز العينة في بطالة السرعة. في ظل ظروف مثالية، ووقف عملية الجفاف كما أن هناك فقط حوالي 1 أو 2 السائل ميكرولتر اليسار.

ويمكن تخزين العينات المجففة في -80 درجة مئوية لمدة سنوات: ملاحظة.

9. إضافة الحجم النهائي من 9 ميكرولتر من الحل إعادة تعليق لعينة وتحويلها إلى microtiterplate لتحليل المواصفات الشامل.

ملاحظة: الحجم النهائي من المخزن المؤقت إعادة تعليق المستخدمة هي التي تعتمد على احتياجات المجرب وحساسية مطياف الكتلةالمستخدمة.

8. بروتوكول بديلة لإثراء Phosphopeptide

ملاحظة: للحصول على تخصيب phosphopeptide، ويجب أن يتم استخراج البروتين في الخطوة 2 في وجود مثبطات إنزيم الفوسفاتيز.

ملاحظة: لا يحتاج تركيز البروتين بالضبط ليتم تحديد للخطوات التالية. يكفي أن يكون هناك تقدير تقريبي للمحتوى البروتين لتجنب فقدان العينة لا لزوم لها

1. إعداد _C-8 StageTips (اتبع نفس البروتوكول لإعداد _C-18 StageTips في الخطوة 6).
2. نقل 1 ملغ من تيو ₂ حبات إلى أعلى استعداد _C-8 StageTips (1 ملغ استخدام تيو ₂ لكل 100 ميكروغرام من البروتين).
3. تتوازن تيو ₂ نصائح مع 100 ميكرولتر من محلول C، وتدور في 2،000 x ج لمدة 5 دقائق في جهاز للطرد المركزي الفوق (على سبيل المثال إيبندورف 5417R).
4. مزيج 100 ميكروغرام من الببتيدات هضمها والمحلاة من الخطوة 7.7 (يجب أن تكون في 100 ميكرولتر من الحلB) مع 100 ميكرولتر من الحل A.
5. تحميل عينة مختلطة على معايرتها تيو ₂ الأعمدة؛ تدور في 1،000 x ج، 5 دقائق.
6. جمع من خلال تدفق وتحميله على نفس الطرف مرة أخرى (من خلال إبقاء تدفق بعد مرور الثاني).
7. غسل طرف مع 100 ميكرولتر من محلول A؛ تدور في 2،000 x ج، 5 دقائق في جهاز للطرد المركزي الفوق (على سبيل المثال إيبندورف 5417R).
8. أزل العينة مع 50 ميكرولتر من 5٪ الأمونيا.
9. أزل العينة مع 50 ميكرولتر من 5٪ تأكسد (سواء eluates يمكن الجمع).
10. تحمض فورا العينة باستخدام 50 ميكرولتر من 20٪ حمض الفوسفوريك. وينبغي أن تكون درجة الحموضة في حوالي 2.

ملاحظة: احفظ نصائح تيو ₂ واسترداد مسحوق. ويمكن غسلها بمحلول B واستخدامها مرة أخرى عن واحد أو اثنين من أكثر جولات.

11. مرة أخرى desalt عينات المحمض على C ₁₈ نصائح (راجع الخطوة 8).

9. تحليل LC-MS/MS من الببتيد مخاليط

1. في resuspend phosph المحلاةopeptides في المنطقة العازلة إعادة تعليق.
2. تحميل معلق العينة على نظام LC-MS/MS الاختيار واكتساب الأطياف في وضع البيانات تعتمد على القرار المقترح من 60،000 الاعراض الكامل في نصف الحد الأقصى.

ملاحظة: للحصول على تجزئة الأمثل، إما الخسارة محايدة المسح ينبغي تطبيق ^22، أو إذا كانت متوفرة تفعيل متعددة المراحل ^23. إذا ETD متاح أنها سوف تسمح تجزئة الببتيد العمود الفقري من دون خسارة من حامض الفوسفوريك ^24.

ملاحظة: القوائم الذروة من البيانات الخام تحتاج إلى استخراج وتقديمها إلى تحديد قاعدة البيانات وكذلك لتحديد الكميات. هنا، نحن تصف الإعدادات لاستخدام التميمة وMSQuant، والذي يعمل لملفات البيانات الخام من LTQ، LTQ-Orbitrap والصكوك LTQ FT-(الحرارية العلمية).

3. استخراج قائمة الذروة باستخدام DTAsupercharge داخل "مساعد" القائمة في MSQuant. استخدام الإعدادات الافتراضية.
4. يقدم الناتجة ملف قائمة الذروة إلى محرك البحث التميمة. كرإعدادات itical: السلائف أيون الشامل التسامح 10 جزء في المليون، MS / MS التسامح الشامل 0.5 دا. تعديلات ثابتة: carbamidomethylation من cysteines، تعديلات متغير: أكسدة ميثيونين، الفسفرة من سيرين، ثريونين، التيروزين. طريقة الكميات: ¹⁵ N وضع العلامات الأيضية.
5. حفظ التميمة نتيجة كملف صفحة ويب.
6. تحميل ملف التميمة نتيجة وملف الخام إلى MSQuant. حدد جميع البروتينات من الفائدة وتشغيل "الكميات تلقائي". سيقوم البرنامج قراءة الأطياف مسح كامل من ملف الخام والقيام التكامل الذروة للشركاء وصفت وغير المسماة كل الببتيد.
7. النتائج تصدير الكميات إلى برنامج جدول بيانات أو إلى ملف نصي المفصول. ويمكن بعد ذلك تقديم البيانات لمزيد من التحليل الإحصائية في Excel أو استخدام مزيد من حزم البرمجيات مثل Statquant ²⁵ أو ²⁶ التكسير.

النتائج

مع بروتوكول المعروضة باستخدام المسمى أيضي الثقافات خلية نبات الأرابيدوبسيس فمن الممكن لعزل أغشية البلازما من الأنسجة النباتية (STEP2، أرقام 2 و 4)، وإثراء لمقاومة المنظفات الكسور الغشاء داخل غشاء البلازما (الخطوة 3 أرقام 3 و 5). في وقت لاحق، ويسمح ا...

Discussion

بروتوكول المعروضة في هذه الورقة تحتوي على العديد من الخطوات وجميعهم من الأهمية بمكان الحصول على تجزئة نقية وممثل للغشاء البلازما النباتية في أغشية مقاومة المنظفات والمنظفات كسور قابلة للذوبان. وبالتالي، فمن المهم أن تتبع كل خطوة وفقا للتعليمات.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
Chemicals were ordered from Sigma-Aldrich unless noted otherwise
Ammonia (stock 25 % solution)	WAKO	010-03166
TiO2 10 μm	GL-Science	5020-75010
Empore Disk C18	Varian	12145004
Polyethylene glycol(PEG 3350)	Sigma	88276
Dextran T500	Roth	9219.2
Trypsin	Promega	V5113
Protease inhibitor cocktail (PIC)	Sigma	P9599
K15NO3	Cambridge Isotope Laboratories	NLM-765-PK
EQUIPMENT
Optima L-80 XP Ultracentrifuge	Beckman
Plate reader	BioTek
EASY-nLC II nano-Liquid Chromatograph	Thermo Scientific
LTQ-Orbitrap mass spectrometer	Thermo Scientific
Centrifuge 5810R	Eppendorf
Centrifuge 5417R	Eppendorf
Thermomixer	Eppendorf
Speed Vac RVC 2-25	Christ
Shaker Unimax 2010	Heidolph