מטבולית תיוג וממברנה היפוך חלוקה לניתוח השוואתי של proteomic<em&gt; Thaliana ארבידופסיס</em&gt; תא תרבויות השעיה

Summary

כאן אנו מתארים שיטה חזקה לחלוקה של ממברנות פלזמה צמח לקרומים מסיסים עמידים וחומרי ניקוי חומרי ניקוי המבוססת על תערובת של ללא תווית וin vivo באופן מלא ¹⁵ N תרביות תאי thaliana ארבידופסיס שכותרתו. ההליך מיושם ללימודי proteomic השוואתיים להבין תהליכי איתות.

Abstract

microdomains קרום פלזמה הם תכונות המבוססות על התכונות הפיסיקליות של סביבת השומנים וסטרולים ויש תפקידים מסוימים באיתות תהליכים. חילוץ microdomains קרום מועשר בסטרולים מתאי צמח לניתוח proteomic הוא משימה קשה בעיקר בשל צעדי הכנה מרובים ומקורות לזיהומים מתאים סלולריים אחרים. קרום הפלזמה מהווה רק כ 5-20% מכל הקרומים בתא צמח, ולכן הבידוד של חלק קרום פלזמה מטוהר מאוד מאתגר. שיטה משמשת לעתים קרובות כרוכה מחיצות מימיות שני שלבים בפוליאתילן גליקול וdextran, אשר מניבה שלפוחית ​​קרום פלזמה עם טוהר 95% ^1. microdomains קרום סטרולים עשירים בתוך קרום הפלזמה הם מסיסים על טיפול עם חומרי ניקוי nonionic קרים ב-pH בסיסי. שבריר קרום אבקת עמידה זה יכול להיות מופרד מקרום הפלזמה כמויות גדולות על ידי ultracentrifugation כבשיפוע ucrose ^2. בהמשך לכך, ניתן להפיק חלבונים מהלהקה הצפיפות הנמוכה של שיפוע סוכרוז על ידי משקעים מתנול / כלורופורם. חלבון המופק לאחר מכן ניתן יהיה טריפסין מתעכל, desalted ולבסוף נותח על ידי LC-MS/MS. פרוטוקול החילוץ שלנו לmicrodomains סטרולים עשירים מותאם במיוחד להכנה של שברים קרום נקיים חומרי ניקוי עמיד מתרביות תאי thaliana ארבידופסיס.

אנו משתמשים בתיוג טבולים מלא של תרביות תאי ההשעיה thaliana ארבידופסיס עם ¹⁵ K NO ₃ כמקור חנקן היחיד ללימודי proteomic השוואתיים כמותית לאחר טיפול ביולוגי של עניין ^3. על ידי ערבוב יחסים שווים של תרביות תאים שכותרתו וללא תווית להפקת חלבון משותפת ההשפעה של צעדי הכנה בתוצאה הכמותית סופית נשמר במינימום. גם אובדן של חומר במהלך החילוץ ישפיע גם שליטה ודגימות טיפול באותה הדרך,ד ולכן היחס של אור ופפטיד התרומה יישאר קבוע. בשיטה המוצעת או שכותרתו או תרבית תאים ללא תווית עוברת טיפול ביולוגי, ואילו השני משמש כשליטה ^4.

Introduction

ב1972, ג'ונתן סינגר וגארת' ניקולסון הציעו מודל פסיפס נוזל מודל מבנה ממברנות תאים, החלפת מודל כריך חלבון שומנים החלבון שהיה מקובל ב 1960s מוקדם. זינגר וניקולסון הניחו כי הקרום הביולוגי יכול להיחשב כנוזל דו ממדים שבו כל מולקולות השומנים וחלבונים מפוזרות באופן חופשי ובקלות ^5. מאז אותה תקופה, מודל מבנה של קרום הפלזמה והידע של הרכב הקרום הפך למורכב עוד יותר. במיוחד, בתוך קרום הפלזמה, ניתן לראות מבנים כגון קומפלקסי חלבונים וmicrodomains מבני מסודר המבוסס שומנים / סטרולים. בממברנות מודל מלאכותיות ^6,7, סטרולים וsphingolipids יכולים רוחבי להפריד ממינים שומנים אחרים כדי ליצור אזורים עם מאפיינים פיזיים שונים. הפרדה זו בתוך קרום התא נגרמת בעיקר על ידי מאפייני שיוך העצמי בין סטרולים וsa מאודשרשרות פחמימנים turated של phopsho וsphingolipids ^8. במיוחד, טבעות סטרולים הנוקשה להעדיף אינטראקציות עם נוקשה ומיני שומנים ישר רוויים ואינטראקציות אלה יאלצו את שרשרות הפחמימנים שכנים ליותר תצורות מורחבות, הגדלת עובי קרום ואת קשיות.

אחד המאפיינים שנצפה של microdomains קרום סטרולים מועשרים היה insolubility על טיפול בחומרי ניקוי שאינו יוניים כגון טריטון X-100 או 35 בריג'. שברים אלה נחשבים לזהים עם microdomains קרום ונקראו קרומי סבון עמידים (DRM) המבוססים על שיטת ההכנה ביוכימיים שלהם ^2. השימוש בחומרי ניקוי nonionic במהלך חילוץ DRM קיבלו ביקורת כהכנת ה-DRM ביוכימיים לא יכולה ישירות מתאימות לכל תא קרום ספציפי בתוך התא החי ^9. במיוחד, חומרי הניקוי ליחס חלבון נראה מכריעים בהכנות כאלה,חומרי ניקוי של שונים, כמו גם כמויות חומרי ניקוי שונות יכול להניב הרכב של שבריר קרום אבקת עמידה ¹⁰ שונה. עם זאת, יש ראיות לכך שמיני חלבון מסוימים באופן ספציפי לקשר עם תחומים אלה קרום סלולארי סטרולים עשירים, ושחלבונים אלו מועשרים גם בהכנות ביוכימיים של שברים קרום אבקת עמידה ^11. הליבה של חלבונים, שנמצאו בחלק ה-DRM צמח, ואשר הנוכחות בDRMs הייתה סטרולים תלויה, היו בעיקר חלבונים מעוגנים-GPI, כגון חלבונים כמו fasciclin-arabinogalactan (flas) ובני משפחת חלבון מק. גם כמה חלבוני איתות, כגון קינאזות כמו קולטן או phospholipases נמצאו ^11. תוצאות אלו עולות בקנה אחד עם מחקרים רבים proteomic על microdomains קרום היונקים ^12,13. גם בצמחים יש להגדיל ראיות לתפקיד של microdomains קרום בהקשר של תגובה ללחץ ^{14 -}16.

הפרוטוקול המתואר כאן מספק שיטה חזקה לחלוקה של microdomains קרום פלזמה ובמיוחד משתמש בחלבון לריכוז חומר ניקוי שמאפשר לנו לתאר שינויי מתח מושרה של תא קרום סטרולים עשירים ^4,11,14.

Protocol

נוהל

ריאגנטים נפוצים ומאגרים בשימוש בפרוטוקול החילוץ:

1. בינוני JPL לתרביות תאי ההשעיה thaliana ארבידופסיס
   • BO 3 מיקרומטר H _{3 3}
   • 3 מיקרומטר MnSO ₄ x H ₂ O
   • 1.1 מיקרומטר ZnSO ₄ x 7 H ₂ O
   • 0.15 KJ מיקרומטר
   • 0.03 מיקרומטר Na ₂ Moo ₄ x 2 H ₂ O
   • 3 ננומטר CoCl ₂ x 6 H ₂ O
   • 3 ננומטר CuSO ₄ X 5 H ₂ O
   • 0.9 מ"מ CaCl ₂ x 2 H ₂ O
   • 0.5 מ"מ MgSO ₄ x 7 H ₂ O
   • 0.5 מיקרומטר FeSO H ₄ x 7 ₂ O
   • 0.5 מיקרומטר Na ₂ EDTA x 2 H ₂ O
   • 0.12 מיקרומטר HCl תיאמין
   • 0.16 מיקרומטר חומצה ניקוטינית
   • HCl פירידוקסין 0.097 מיקרומטר
   • 0.107 NAA מיקרומטר
   • 0.375 מ"מ KH ₂ PO ₄
   • 0.061 מ"מ לאא2 PO ₄ x 2 H ₂ O
   • 0.039 מ"מ Na ₂ HPO ₄
   • גליצין 0.027 מ"מ
   • 0.56 מ"מ מיו-אינוסיטול
   • סוכרוז 1.5%
   • 10 מ"מ K ¹⁴ NO ₃ או 10 מ"מ K ¹⁵ NO ₃

הערה: ה-pH של מדיום JPL צריכה להיות מותאמת ל5.7 עם KOH. המדיום חייב להיות מעוקר על ידי סינון או מעוקר לפני השימוש.

2. החיץ H
   • 100 HEPES מ"מ-KOH (pH 7.5)
   • 250 מ"מ סוכרוז
   • 10% גליצרול (w / v)
   • 5 מ"מ EDTA
   • חומצה אסקורבית 5 מ"מ
   • 0.6% (w / v) PVP K-25 או K-30
   • 5 מ"מ DTT (להוסיף טרי)
   • 1 מ"מ PMSF (להוסיף טרי)
   • מעכבי פרוטאז ו phosphatase (להוסיף טרי)
     • 50 מ"מ NAF
     • 1 מ"מ Na ₃ VO ₄
     • 1 מ"מ benzamidin
     • 0.3 מיקרומטר mikrocystin
     • 4 leupeptin מיקרומטר
     • מעכבי פרוטאז קוקטייל
3. החיץ R
   • אשלגן זרחה 5 מ"מ
   • 0.33 M סוכרוז
   • 3 מ"מ KCl
   • 0.1 מ"מ EDTA
   • 1 מ"מ DTT (להוסיף טרי)
4. החיץ TNE
   • 25 מ"מ טריס-HCl, pH 7.5
   • 150 מ"מ NaCl
   • 5 מ"מ EDTA
5. מערכת דו שלביים (6 g-המערכת מתאימה לעד 15 גרם של דגימה במשקל טרי) שיטת הכנה
   ב15 מיליליטר מרכיבי תערובת צינור פלקון המפורטים להלן ומערבבים היטב:
   • 20% (w / w) T500 dextran - 2.6 גרם
   • פולי 40% (w / w) (אתילן גליקול) (PEG 3350) - 1.3 גרם
   • סוכרוז - 0.678 גרם
   • 0.2 פוספט M אשלגן, 7.8 pH - 0.15 מיליליטר
   • 2 M KCl - 0.014 מיליליטר
   • להוסיף מים עד שהמסה כוללת של מערכת שני שלבים היא 6 גרם.
6. פתרונות סוכרוז במאגר TNE
   • 2.4 M, 1.6 M, 1.4 M, 0.15 M
7. ריאגנטים לעיכול טריפסין
   • UTU: 6 M אוריאה, 2 M thiourea (pH 8.0 עם 10 מ"מ טריס-HCl)
   • חיץ הפחתה (DTT 1 מיקרוגרם / μl במים; 6.5 מ"מ)
   • חיץ אלקילציה (5 מיקרוגרם / μl iodoacetamide במים; 27 מ"מ)
   • LysC Endopeptidase (0.5 מיקרוגרם / μl)
   • טריפסין, כיתה רצף שונה (0.4 מיקרוגרם / μl)
8. ריאגנטים לdesalting פפטיד C מעל ₁₈
   • פתרון resuspension: 2% חומצת trifluoroacetic (TFA), אצטוניטריל 5% במים
   • פתרון: 0.5% חומצה אצטית
   • פתרון ב ': אצטוניטריל 80%, 0.5% חומצה אצטית
9. ריאגנטים להעשרת phosphopeptide
   • פתרון: 0.1% TFA, אצטוניטריל 5%
   • פתרון ב ': 0.1% TFA, אצטוניטריל 80%
   • Tio ₂ 10 מיקרומטר
   • אמוניה (פתרון 25% מניות)
   • Piperidine (מניית 100%)

פרוטוקולים

1. תיוג המטבולית של תרבויות תרחיף תא thaliana ארבידופסיס

1. לגדול ארבידופסיס תא Col-0תרבויות השעיה נובעות מעלים ¹⁷ במדיום מלא ¹⁴ N-JPL ^(18; ראו "חומרים כימיים ומאגרים משותפים" סעיף) וקבוצה אחת של תרבויות ^ב15 בינוני N-JPL בבקבוק סטרילי בתנאי אור קבועים ב80-100 μmol / מ ' ² שעה, 23 ° C, תחת קבוע רועד ב120 סל"ד.
2. כדי לשמור על תרביות תאים, לחסן 400 מיליליטר של מדיום JPL הטרי עם 40 מיליליטר של תרבית תאים ישנה שבעת ימים בצלוחיות L 1.
3. קצירה של תרביות תאים מתרחשת באמצעות יניקת ואקום דרך משפך זכוכית רחב עם רשת נירוסטה. תאים מצטברים על צלחת הרשת ובמשפך והוא יכול בקלות להיות שנאספו משם. תאים מומלץ להקפיא ב -80 מעלות צלזיוס או בחנקן נוזלי לפני הטחינה.

הערה: לקבלת ¹⁵ N תרביות תאים שכותרתו מטבולית להשתמש ¹⁵ K NO ₃ כמקור היחיד של חנקן לפחות שני קטעים יותר משבועות ^19. בexperiments לפרוטאומיקה השוואתית, השתמש ¹⁵ N תרבית תאים שכותרתו וגם לשמור על תרבות ללא תווית במדיום נורמלי. טיפול ביולוגי לאחר מכן ניתן יהיה להחיל את התרבות או שכותרתו או ללא תווית, ואילו השני משמש כביקורת (איור 1). להכנת חלבון, שתי התרבויות תשולב ^20. כאשר מתכנן התקנה הניסיונית, אנו ממליצים לשקול התקנת גומלין תיוג ⁴ שבו את אותו הטיפול מוחל פעם אחת ^ל15 תאי N שכותרתו ופעם אחת לתאים ללא תווית וללא תווית המתאימה או ¹⁵ תאים N שכותרתו משמשים כקבוצת ביקורת. במקרה זה, הכמויות כפולות של תרביות תאים יש צורך.

2. פלזמה ממברנה טיהור

הערה: כל הצעדים נוספים מתבצעים בחדר הקר ו / או על קרח, אלא אם כן צוינו אחרת.

1. Homogenize תאים מכ 1 ליטר של תרבויות השעיה תא בן 7 ימים בחנקן נוזלי.ניתן לאחסן את החומר ב-80 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף.
2. מערבבים את אותן הכמויות של תרביות תאים שכותרתו קפוא וללא תווית המבוססת על משקל טרי בכוס ולהוסיף 2 כרכים של החיץ H באופן מיידי. במקרה של הכנת microdomain קרום הוא הציע להשתמש בלפחות 7 גרם במשקל טרי של שני תאים שכותרתו וללא תווית.
3. מניחים את הכוס על שייקר ולנער עד החומר הוא נמס והפתרון הוא נוזלי וללא גבישי קרח.
4. סנן את homogenate דרך שכבה אחת של Miracloth ל50 צינורות צנטריפוגה מיליליטר.
5. דגימות איזון עם H חיץ ו צנטריפוגות ב XG 10,000 במשך 8 דקות.
6. טען את supernatant לתוך צינורות מקוררים מראש אולטרה צנטריפוגה (למשל עבור הרוטור בקמן קולטר SW31Ti), עם נפח של כ 32 מיליליטר
7. דגימות איזון עם H חיץ וגלולת microsomes ידי צנטריפוגה ב100,000 XG ב 4 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות באמצעות הרוטור בקמן SW32Ti.
8. הסר את supernatant לאחר צנטריפוגה.

הערה: את supernatant מכיל חלבונים מסיסים. כמות קטנה של חלק זה ניתן לשמור לממטרים נוספים חלבון וניתוח שלאחר מכן גם של חלבונים מסיסים.

9. Resuspend את כדור הקרום של כל דגימה בכמות המתאימה של R חיץ ולטעון על גבי החלק העליון של מערכת שני שלבים U1 (איור 2). אם משתמשים במערכת שני השלבים 6 גרם, לטעון גרם בדיוק 2 של גלולה קרום מושעה.

הערה: הנפח הסופי של R החיץ תלוי בגודל של מערכת שני שלב שהוא הולך להיות בשימוש (~ 1.6 מיליליטר של R החיץ נחוץ בעת שימוש במערכת גרם 6). מומלץ להשתמש בפחות חיץ לresuspension כך חיץ טהור ניתן להוסיף על גבי מערכת של שני שלבים כדי להשיג את המשקל דרש, ולא משתמש יותר מדי חיץ לsolubilization ולא תוכל לטעון את המדגם כולו על גבי המערכת של שני שלבים.

10. טען את אותו הנפח של R חיץ הטהור כפי שהוא משמש עבור הresuspension מדגם דואר על U2.
11. לאט לאט לערבב צינורות U1 ו-U2 ידי היפוכם 30x (כ 1 היפוך / sec).

הערה: אין במרץ לנער את מערכת שני שלבים. זה יכול לגרום לחוסר ההפרדה בין השלבים בצעד ultracentrifugation.

12. צנטריפוגה הדגימות ב1,500 XG ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
13. הסר את supernatant לאחר צנטריפוגה.
14. מעביר את השלב העליון מU1 על U2 וחזור צנטריפוגה ב1,500 XG ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
15. הזז את השלב העליון מU2 לתוך צינורות ultracentrifuge SW41Ti ולדלל אותו עם חמישה כרכים של R חיץ ומערבבים היטב.

הערה: השלב העליון הסופי עשוי להיות מחולק לצינורות ultracentrifuge נפרדים לפני שניתן יהיה המדולל חמש פעמים.

16. צנטריפוגה הדגימות ב200,000 XG ב 4 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת באמצעות הרוטור SW41Ti.
17. גלולה קרום resuspend ב smalכמות ליטר של חיץ TNE (בדרך כלל 200 μl של חיץ משמשת) לבידודה של ממברנות עמידות חומרי ניקוי.

הערה: כמות קטנה של חלק זה ניתן לשמור לניתוח של קרום הפלזמה unfractionated.

הערה: חלק קרום הפלזמה יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה לפני חלוקה לממברנות עמידות חומרי ניקוי ושברים מסיסים חומרי ניקוי.

3. דטרגנט עמיד ממברנה הכנה

1. בדוק את הריכוז של שבריר קרום הפלזמה על ידי assay ברדפורד.
2. הוספת טריטון X-100 לשבריר קרום הפלזמה. הריכוז הסופי של חומר ניקוי צריך להישאר בין 0.5-1%. חומר הניקוי למשקל חלבון יחס משקל צריך להישאר בין 13-15.
3. דגימות Shake בסביבות 100 סל"ד ב-C ° 4 ל30 דקות.
4. הוסף שלושה כרכים של 2.4 M סוכרוז לכרך אחד של קרום הפלזמה טופל להשיג 1.8 M ריכוז סופי של סוכרוז.
5. הכן את שיפוע סוכרוז בצינורות ultracentrifuge SW41Ti ידי טעינת פתרונות סוכרוז המתאימים בחלקו העליון של שבריר 1.8 M כפי שמודגם באיור 3.
6. צנטריפוגה הדגימות ב250,000 XG ב 4 מעלות צלזיוס למשך שעות 18 באמצעות הרוטור בקמן SW41Ti.
7. מוציא בזהירות את צינורות ultracentrifuge מהרוטור כדי למנוע שיבוש של הלהקה בצפיפות נמוכה שיכול להיות גלוי כמו טבעת חלבית על הממשק של 0.15 M/1.4 סוכרוז M. לפעמים שום דבר לא יכול היה לראות, אבל החלק עדיין מכיל את החלק יחסי חלבון עמיד לחומרי הניקוי.
8. הסרת חלק קטן של 0.75 מיליליטר נפח מהחלק העליון של השיפוע. שברים 2 ו -3 אשר מכסים נפח של כ 1.5 מיליליטר מעל טבעת ביניים ו0.5 מיליליטר להלן מייצגים את החלק יחסי קרום עמיד חומרי הניקוי. איסוף השברים הללו ל15 צינורות מיליליטר פלקון. שברים 9 ו10 מכילים את חלק קרום מסיס בחומרי הניקוי ויכולים גם להיות שנאספו לצורך ההשוואה. לניתוח נוסף, Fract בריכהיונים 2 ו -3, כמו גם שברים 9 ו10.

4. מיצוי של חלבונים מהחלק עמיד דטרגנט ידי מתנול / כלורופורם

הערה: כל השלבים מתבצעים בטמפרטורת החדר.

1. הוסף 4 כרכים של מתנול לשברים ומערבולת שנאספו ביסודיות.
2. הוסף 1 נפח של כלורופורם, מערבולת ביסודיות.
3. הוסף 3 כרכים של מים, מערבולת ביסודיות.
4. צנטריפוגה הדגימות ב2,000 XG במשך 5 דקות באמצעות צנטריפוגות המעבדתיים (למשל Eppendorf 5417R).
5. הסר את השלב המימית מעל שכבת החלבון בשלבי ביניים.
6. הוסף 3 כרכים של מתנול, מערבולת ביסודיות.
7. צנטריפוגה הדגימות ב4,000 XG 10 דקות.
8. הסר supernatant ולייבש את גלולה. גלולה מיובשת מוכנה לעיכול בפתרון.

5. ב- פתרון טריפסין עיכול

הערה: בהליך זה נעשים כל הצעדים בטמפרטורת חדר כדי לצמצם derivatization לא רצוי של צד שרשרות של חומצות אמינו על ידי denaturants.

1. ממיסים דגימה בנפח קטן של 6 M אוריאה, thiurea 2 מ ', pH 8 (UTU). השתמש בנפח נמוך כמו תואם את המדגם (בדרך כלל כ 40 μl).
2. דגימות ספין solubilized בUTU בXG 5,000 בצנטריפוגה המעבדתיים (למשל Eppendorf 5417R) עבור 10 דקות עד גלולה כל חומר בלתי מסיס.
3. ה-pH של הפתרון הסופי צריכה להיות ליד 8.0 לעיכול טריפסין אופטימלי. בדוק עם רצועות ה-pH.
4. הוסף 1 μl של חיץ הפחתה לכל 50 מיקרוגרם חלבון מדגם של דגירה 30 דקות בטמפרטורת חדר.

הערה: רק הערכה גסה של תכולת חלבון היא הכרחית. כאשר כמות מדגם מוגבלת עדיף להקריב את הדיוק ולא מבזבז את המדגם על assay חלבון.

5. הוסף 1 μl של חיץ אלקילציה עבור כל חלבון מדגם 50 מיקרוגרם דגירה 20 דקות בטמפרטורת חדר בחושך.
6. הוסף 0.5 μl של LysC ל50 חלבון מדגם מיקרוגרם דגירה במשך שלוש שעות בטמפרטורת חדר עם קבוע רועד ב700 סל"ד. במידת צורך, יכול גם להתבצע לעכל לילה. עם זאת, זמן יתארך בטמפרטורות חמות אינו מומלץ כפי שהוא יכול להגדיל את הפסד פפטיד בשל ספיחה לחומר צינור פלסטיק מתחת pH 8 תנאים מימיים.
7. לדלל מדגם עם ארבעה כרכים 10 מ"מ טריס-HCl, pH 8.

הערה: שלב זה הוא הכרחי כדי לדלל את ריכוז האוריאה כטריפסין הוא מאוד רגיש למלח גבוה.

8. הוסף 1 μl של טריפסין ל50 חלבון מדגם מיקרוגרם ו דגירה הלילה בטמפרטורת חדר עם קבוע רועד ב700 סל"ד.
9. להפוך לחומצת הדגימות ל0.2% ריכוז סופי TFA להגיע pH 2 (להוסיף כ 1/10 נפח של 2% חומצת trifluoracetic).

הערה: דוגמאות ניתן לאחסן ב - 20 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף, אבל זה יותר טוב לאחסוןשלהם על StageTips על 4 מעלות צלזיוס אם זה לזמן קצר (שבוע) או לאחסן אותם לאחר desalting StageTips.

6. ייצור של _C-18 StageTips

1. הנח Empore דיסק C18 על משטח שטוח ונקי כמו צלחת פטרי פלסטיק חד פעמית.
2. אגרוף החוצה דיסק קטן באמצעות מחט מזרק קהה שקצהו בקוטר של 1.5 מ"מ. דיסק מקלות במחט וניתן להעביר אל קצה פיפטה.
3. לדחוף את הדיסק החוצה של המחט ולתקן אותה בהיצרות פיפטה קצה על ידי חתיכה של סיליקה או צינורות מתאימים בחלק הפנימי של המחט התמזגו.

הערה: ניתן לאחסן StageTips יבש בטמפרטורת חדר ^21.

7. שימוש בC ₁₈ StageTips לפפטיד desalting וריכוז

1. להתנות C ₁₈ StageTip ידי הצבת 50 μl של הפתרון B על StageTip מוכן. ספין הקצה בצנטריפוגות ב 2,000 סל"ד במשך 2 דקות בג המעבדתייםentrifuge (למשל Eppendorf 5417R).

הערה: מתאמי שימוש לטוות StageTips בצנטריפוגה Eppendorf, נוזל ייאסף בצינור תגובה 2 מיליליטר. להכנות בקנה מידה גדולה, יכולים גם להיות ממוקמים טיפים במה לארון תקשורת קצה עם 96 של הטיפים μl 200 ונוזל יכול להיות שנאספו בצלחת microtiter.

הערה: לעולם אל תשתמש במהירויות גבוהות יותר מ -3,000 XG בצנטריפוגה המעבדתיים (למשל Eppendorf 5417R) בשל הסיכון של ספינינג את ₁₈ הדיסק C מהקצה.

2. לאזן StageTip באמצעות א פתרון 100 μl ספין הקצה בצנטריפוגות ב XG 5,000 בצנטריפוגה המעבדתיים (למשל Eppendorf 5417R).
3. חזור על שלב 2.
4. מדגם עומס על גבי דיסק על ידי pipetting בזהירות את המדגם לקצה פיפטה עם הדיסק בפנים.

הערה: דיסק אחד יכול להיקשר כ. של חלבון 100 מיקרוגרם.

5. ספין הטיפים בלסה"נntrifuge עד שכל הנפח של מדגם לעבור ₁₈ הדיסק C.
6. שטוף את StageTips שתי פעמים עם א פתרון 100 μl ספין הטיפים בצנטריפוגה.

הערה: ניתן לאחסן StageTips שטף והעמיס על 4 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע.

7. Elute מדגם עם 40 μl של B. פתרון איסוף eluate בצינור תגובה טרי 1.5 מיליליטר.
8. לרכז את המדגם בVAC המהירות. בתנאים אידיאליים, לעצור את תהליך ההתייבשות כמו שיש רק על 1 או 2 נוזל μl עזב.

ניתן לאחסן דגימות מיובשות ב-80 מעלות צלזיוס במשך שנים: הערה.

9. הוספת נפח סופי של μl 9 של פתרון resuspension למדגם ולהעביר אותו לmicrotiterplate לניתוח מפרט המוני.

הערה: הנפח הסופי של חיץ resuspension משמש תלוי בצרכים של הנסיין ואת הרגישות של ספקטרומטר המסהבשימוש.

8. פרוטוקול חלופי לPhosphopeptide העשרה

הערה: להעשרת phosphopeptide, מיצוי חלבון בשלב 2 חייב להיעשות בנוכחות מעכבי phosphatase.

הערה: ריכוז חלבון מדויק אינו צריך להיקבע לשלבים הבאים. זה מספיק כדי לקבל הערכה גסה של תכולת חלבון כדי למנוע אובדן מיותר מדגם

1. הכן את _C-8 StageTips (בצע את אותו הפרוטוקול להכנת C ₁₈ StageTips בשלב 6).
2. העברה 1 מ"ג של Tio _{2-חרוזים} לראש C מוכנה _8-StageTips (מ"ג TIO שימוש 1 ₂ לחלבון 100 מיקרוגרם).
3. לאזן Tio _2-טיפים עם של C פתרון, ספין 100 μl ב2,000 XG במשך 5 דקות בצנטריפוגה המעבדתיים (למשל Eppendorf 5417R).
4. מערבבים 100 מיקרוגרם של פפטידים מתעכלים וdesalted מצעד 7.7 (זה צריך להיות בפתרון 100 μlB) עם של א 'פתרון 100 μl
5. טען מעורב מדגם על Tio ₂ עמודות equilibrated; ספין ב1,000 XG, 5 דקות.
6. לאסוף את הזרימה דרך לטעון אותו על אותו הקצה שוב (לשמור על זרימה דרך אחרי מסירה שנייה).
7. שטוף קצה עם פתרון 100 μl; ספין ב2,000 XG, 5 דקות בצנטריפוגה המעבדתיים (למשל Eppendorf 5417R).
8. Elute מדגם עם 50 μl של אמוניה 5%.
9. Elute מדגם עם 50 μl של piperidine 5% (ניתן לשלב שני eluates).
10. מייד להפוך לחומצת המדגם באמצעות 50 μl של 20% חומצה זרחתית. pH צריך להיות סביב 2 ב.

הערה: שמור את Tio ₂ טיפים ולאחזר את האבקה. זה יכול להישטף עם הפתרון B ולהשתמש בו שוב לסיבוב או שתיים נוסף.

11. שוב desalt דגימות acidified מעל C ₁₈ טיפים (ראה שלב 8).

9. ניתוח LC-MS/MS של פפטיד תערובות

1. Resuspend phosph desaltedopeptides במאגר resuspension.
2. טען resuspended מדגם על גבי מערכת של LC-MS/MS של בחירה ורכישת ספקטרום במצב תלוי נתונים ברזולוציה הציעה של 60,000 רוחבי מלא במחצית המרבית.

הערה: לפיצול אופטימלי, או סריקה ניטראלי הפסד צריכה להיות מיושמת ^22, או אם קיימת הפעלה הרבה שלבי ^23. אם ETD נגיש זה יאפשר פיצול עמוד השדרה פפטיד ללא הפסד של חומצה זרחתית ^24.

הערה: רשימות שיא מהנתונים גולמיים צריכים להיות מופקים ומוגשים לזיהוי בסיס הנתונים, כמו גם לכימות. כאן, אנו מתארים את הגדרות לשימוש בקמע וMSQuant, אשר עובדת עבור קבצי נתונים גולמיים מLTQ, LTQ-Orbitrap ומכשירי LTQ-FT (Thermo Scientific).

3. לחלץ רשימת שיא באמצעות DTAsupercharge בתוך התפריט "עוזר" בMSQuant. להשתמש בהגדרות ברירת מחדל.
4. שלח כתוצאה קובץ רשימת שיא למנועי חיפוש קמע. Crהגדרות itical: מבשר יון המוני סובלנות 10 עמודים לדקה, סובלנות ההמונית MS / MS 0.5 דא. שינויים קבועים: carbamidomethylation של cysteines, שינויים משתנים: חמצון של מתיונין, זרחון של סרין, תראונין, טירוזין. שיטת ^{quantitation:} 15 N תיוג מטבולית.
5. שמירת תוצאת קמע כקובץ דף האינטרנט.
6. לטעון את קובץ תוצאת הקמע וקובץ גולמי לMSQuant. בחר את כל החלבונים של עניין ולהפעיל "quantitation האוטומטי". התכנית תקרא את ספקטרום סריקה מלא מקובץ הגלם ולעשות אינטגרציה שיא לשותפים שכותרתו וללא תווית של כל פפטיד.
7. תוצאות quantitation יצוא לתכנית גיליון אלקטרוני או לקובץ טקסט מופרד באמצעות טאבים. אז יכולים להיות שהגישו את הנתונים לניתוח סטטיסטי נוסף ב-Excel או באמצעות חבילות תוכנה נוספות כגון Statquant ²⁵ או קרקר ^26.

תוצאות

עם הפרוטוקול שהוצג באמצעות תרביות תאי ארבידופסיס שכותרת מטבולית זה אפשרי לבודד ממברנות פלזמה מרקמות צמח (step2, איורים 2 ו 4), ומעשיר לשברי קרום אבקת עמידה בתוך קרום הפלזמה (שלב 3, איורים 3 ו -5). בהמשך לכך, הפרוטוקול מאפשר מיצוי של חלבונים משברי קרום א...

Discussion

הפרוטוקול שהוצג במאמר זה מכיל שלבים רבים וכל אחד מהם הם חיוניים כדי להשיג חלוקה טהורה ונציג של קרום הפלזמה הצמח לממברנות עמידות חומרי ניקוי ושברים מסיסים חומרי ניקוי. לכן, חשוב לעקוב אחר כל צעד בהתאם להנחיות.

טיפול בשבריר קרום הפ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
Chemicals were ordered from Sigma-Aldrich unless noted otherwise
Ammonia (stock 25 % solution)	WAKO	010-03166
TiO2 10 μm	GL-Science	5020-75010
Empore Disk C18	Varian	12145004
Polyethylene glycol(PEG 3350)	Sigma	88276
Dextran T500	Roth	9219.2
Trypsin	Promega	V5113
Protease inhibitor cocktail (PIC)	Sigma	P9599
K15NO3	Cambridge Isotope Laboratories	NLM-765-PK
EQUIPMENT
Optima L-80 XP Ultracentrifuge	Beckman
Plate reader	BioTek
EASY-nLC II nano-Liquid Chromatograph	Thermo Scientific
LTQ-Orbitrap mass spectrometer	Thermo Scientific
Centrifuge 5810R	Eppendorf
Centrifuge 5417R	Eppendorf
Thermomixer	Eppendorf
Speed Vac RVC 2-25	Christ
Shaker Unimax 2010	Heidolph