Метаболический Маркировка и мембраны фракционирования для сравнительного Proteomic Анализ<em&gt; Арабидопсис</em&gt; Подвеска Клеточные культуры

Резюме

Здесь мы опишем надежный метод для фракционирования плазмы мембран растений в моющих устойчивых и моющих растворимых мембран на основе смеси немеченый и в естественных условиях польностью ¹⁵ N меченых культур арабидопсис клеток. Процедура применяется для сравнительных протеомных исследований, чтобы понять процессы сигнализации.

Аннотация

Плазменные мембранные микродомены особенности, основанные на физических свойствах липидного и стеринового среды и имеют определенные роли в сигнальных процессов. Извлечение стеринов обогащенных мембранные микродомены из растительных клеток для протеомного анализа является трудной задачей в основном за счет нескольких стадий получения и источники загрязнений от других клеточных отсеках. Плазматической мембраны составляет лишь около 5-20% всех мембран в растительной клетке, и, следовательно, выделение высоко очищенной плазмы мембранной фракции является сложной задачей. Часто используемый способ включает водный двухфазной разделение в полиэтиленгликоле и декстрана, который дает в плазме мембранных везикул с чистотой 95% ^1. Стерол богатых мембранные микродомены пределах плазматической мембране нерастворимы при обработке холодных неионогенных моющих средств при щелочном рН. Это моющее средство устойчивостью мембранную фракцию можно отделить от основной массы плазматической мембране с помощью ультрацентрифугирования в качествеucrose градиент ^2. Впоследствии белки могут быть извлечены из группы низкой плотности в градиенте сахарозы по метанол / хлороформ осадков. Экстрагированного белка будет затем переваривали трипсином, обессоленной и, наконец анализируют с помощью LC-MS/MS. Наш протокол экстракции стеролов богатых микродоменов оптимизирован для подготовки чистых моющих устойчивостью мембранных фракций из культур арабидопсис клеток.

Мы используем полный метаболический маркировки арабидопсис культур подвеска клеток с К ¹⁵ NO ₃ в качестве единственного источника азота для количественных сравнительных протеомных исследований следующих биологической очистки интерес ^3. При смешивании равных соотношения меченых и без таковой клеточных культур для совместного извлечения белка влияние подготовительных шагов по окончательному количественного результате сохраняется на минимальном уровне. Также потери материала при добыче повлияет как контроль и образцы лечения таким же образом,д, следовательно, соотношение света и вертикальной качки пептида будет оставаться постоянным. В предлагаемом способе либо меченными или немеченными культуры клеток подвергается биологической очистки, а другой служит в качестве контроля ^4.

Введение

В 1972 году Джонатан Сингер и Гарт Николсон предложил модельном флюиде Мозаика структурную модель клеточных мембран, заменяя белок-липидных-белка сэндвич модель, которая была общепринятой в начале 1960-х. Singer и Nicolson постулировано, что биологическая мембрана может рассматриваться как двумерной жидкости, где все липидные и белковые молекулы диффундируют свободно и легко ^5. С этого времени, структура модель мембраны плазмы и знания состава мембраны стала еще более сложной. В частности, в плазматической мембране, структуры, такие как комплексы белков и липидов / стерола на основе структурно неупорядоченных микродоменов можно наблюдать. В искусственных модельных мембранах ^6,7, стерины и сфинголипиды может боков отделить от других липидных видов формирование регионов с измененными физическими возможностями. Это разделение в клеточной мембране в основном вызвано само-связывая свойствах между стерины и высоко саturated углеводородных цепей phopsho-и сфинголипидов ^8. В частности, жесткие стериновые кольца пользу взаимодействия с жестче и прямее насыщенных видов липидов и эти взаимодействия заставить соседние углеводородные цепи в более длительных конформации, увеличением толщины мембраны и твердость.

Один из обычно наблюдаемых особенностей стеролов обогащенный мембранных микродоменов был их нерастворимость при обработке неионных детергентов, таких Triton X-100 или Brij 35. Эти фракции считается идентичным с мембранными микродоменов и назывались моющие стойкие мембраны (DRM) на основе их биохимического способа получения ^2. Использование неионогенных моющих средств во время извлечения DRM получил некоторую критику как биохимический подготовка DRM не может напрямую соответствуют какой-либо конкретной мембраны отсеке внутри живой клетки ^9. В частности, моющее средство соотношение белка кажется важным в таких препаратов,сек различные моющие средства, а также различные количества моющего средства может дать различный состав моющего средства устойчивы мембранной фракции ^10. Тем не менее, существуют доказательства, что отдельные виды белковых конкретно связать с этими клеточными стеролов богатых мембранных доменов, и что эти белки хорошо обогащенный биохимических препаратов моющих устойчивостью мембранных фракций ^11. Ядро белков, которые были найдены в растительной DRM фракции, и для которых присутствие в МБК зависит стериновый, были особенно GPI-якорь белки, такие как fasciclin-как арабиногалактановых белков (FLAS) и членов семейства белков SKU. Кроме того, некоторые сигнальные белки, такие как рецептор-подобных киназ или фосфолипаз были найдены ^11. Эти результаты согласуются со многими протеомных исследований по млекопитающих мембранных микродоменов ^12,13. Также в растениях появляется все больше доказательств на роль мембранных микродоменов в контексте ответа на стресс ^{14 -}16.

Протокол, описанный здесь обеспечивает надежный метод для фракционирования плазмы мембранных микродоменов и, в частности использует белок для концентрации моющего средства, что позволяет нам изображать стресс, вызванный изменениями стерина богатых мембраны отсеке ^4,11,14.

протокол

ПОРЯДОК

Общие реагенты и буферы, используемые в протоколе экстракции:

1. Лаборатория реактивного движения среда для арабидопсис культур подвеска клеток
   • 3 мкМ Н ₃ ВО ₃
   • 3 мкМ MnSO ₄ х H ₂ O
   • 1.1 мкМ ZnSO ₄ х 7 H ₂ O
   • 0,15 мкм KJ
   • 0,03 мкм Na ₂ MoO ₄ х ₂ H 2 O
   • 3 нМ CoCl ₂ х 6 H ₂ O
   • 3 нМ CuSO ₄ х 5 H ₂ O
   • 0,9 мМ CaCl ₂ х ₂ H 2 O
   • 0,5 мМ MgSO ₄ х 7 H ₂ O
   • 0,5 мкМ FeSO ₄ × 7 H ₂ O
   • 0,5 мкМ Na ₂ ЭДТА х ₂ H 2 O
   • 0,12 мкМ тиамин HCl
   • 0,16 мкМ никотиновой кислоты
   • 0,097 мкМ пиридоксин HCl
   • 0,107 мкМ НУК
   • 0,375 мМ KH ₂ PO ₄
   • 0,061 мМ NaH2 PO ₄ х ₂ H 2 O
   • 0,039 мМ Na ₂ HPO ₄
   • 0.027 мМ глицина
   • 0,56 мМ мио-инозитол
   • 1,5% сахарозы
   • 10 мМ К ¹⁴ NO ₃ или 10 мМ К ¹⁵ NO ₃

Примечание: рН среды ЛРД должна быть скорректирована до 5,7 с помощью КОН. Среда должна быть стерилизованы фильтрацией или автоклавированием перед использованием.

2. Буфер H
   • 100 мМ HEPES-KOH (рН 7,5)
   • 250 мм сахарозы
   • 10% (вес / объем) глицерина
   • 5 мМ ЭДТА
   • 5 мМ аскорбиновой кислоты
   • 0,6% (вес / объем) PVP K-25 или К-30
   • 5 мМ DTT (добавить новый)
   • 1 мМ PMSF (добавить новый)
   • протеазы и фосфатазы ингибиторы (добавить новый)
     • 50 ммоль NaF
     • 1 мМ Na ₃ VO ₄
     • 1 мМ benzamidin
     • 0,3 мкМ mikrocystin
     • 4 мкМ лейпептина
     • коктейль ингибиторов протеаз
3. Буфер Р
   • 5 мМ фосфат калия
   • 0,33 М сахарозы
   • 3 мМ KCl
   • 0,1 мМ ЭДТА
   • 1 мМ DTT (добавить новый)
4. Буфер TNE
   • 25 мМ Трис-HCl, рН 7,5
   • 150 мМ NaCl
   • 5 мМ ЭДТА
5. Двухфазной системе (6 г-система подходит для до 15 г образца сырого веса) способ получения
   В 15 мл Сокол ингредиентов смеси труба, перечисленных ниже и тщательно перемешать:
   • 20% (м / м) декстран T500 - 2,6 г
   • 40% (вес / вес) поли (этиленгликоль) (ПЭГ 3350) - 1,3 г
   • сахароза - 0,678 г
   • 0,2 М фосфат калия, рН 7,8 - 0,15 мл
   • 2 М KCl - 0,014 мл
   • добавить воду, пока общая масса двухфазной системе не 6 г.
6. Сахарозы решения в TNE буфера
   • 2.4 М, 1,6 М, 1,4 М, 0,15 М
7. Реагенты для трипсина пищеварения
   • UTU: 6 М мочевина, 2 М тиомочевины (рН 8,0 10 мМ Трис-HCl)
   • Уменьшение буфера (1 мкг / мкл DTT в воде; 6,5 мМ)
   • Алкилирование буфер (5 мкг / мкл иодацетамида в воде; 27 мМ)
   • LysC эндопептидазы (0,5 мкг / мкл)
   • Трипсин, изменение класса секвенирование (0,4 мкг / мкл)
8. Реагенты для пептида обессоливания более C ₁₈
   • ресуспендирования раствор: 2% трифторуксусной кислоты (TFA), 5% ацетонитрила в воде
   • Раствор А: 0,5% уксусной кислоты
   • раствор В: 80% ацетонитрил, 0,5% уксусной кислоты
9. Реагенты для обогащения фосфопептида
   • Раствор А: 0,1% TFA, 5% ацетонитрил
   • Раствор В: 0,1% ТФК, 80% ацетонитрила
   • TiO ₂ 10 мкм
   • Аммиак (фондовые 25% раствор)
   • Пиперидин (фондовые 100%)

ПРОТОКОЛЫ

1. Метаболический Маркировка арабидопсис суспензионных культур клеток

1. Расти Arabidopsis Col-0 Сотовыеподвески культуры, полученные из листьев ¹⁷ в полном ¹⁴ N-JPL среды ^(18; см. раздел «Общие реагентов и буферов") и один набор культур в ¹⁵ N-JPL среды в стерильной колбе при постоянном состоянии света на 80 до 100 мкмоль / м ² сек, 23 ° С, при постоянном встряхивании при 120 оборотах в минуту.
2. Для поддержания клеточных культур, инокуляции 400 мл свежей среды ЛРД 40 мл семь дневной культуры клеток в 1 л колбы.
3. Заготовка клеточных культур происходит через вакуумного отсоса через широкую стеклянную воронку с сеткой из нержавеющей стали. Клетки накапливаются на сетчатой ​​пластине и в воронке и могут быть легко собраны из там. Клетки рекомендуется замораживали при -80 ° С или в жидком азоте перед измельчением.

ПРИМЕЧАНИЕ: Для ¹⁵ N метаболически меченые клеточные культуры использовать K ¹⁵ NO ₃ в качестве единственного источника азота по крайней мере два переходов через две недели ^19. В EXPEriments для сравнительных протеомики, использовать ¹⁵ N надписью клеточную культуру, а также сохранять непомеченный культуру в нормальном среды. Биологическая очистка будут применяться либо с маркировкой или немеченого культуры, а другой служит контролем (рис. 1). Для приготовления белкового, обе культуры будут объединены ^20. При планировании экспериментальную установку, мы рекомендуем, учитывая взаимное подписи заголовков ^4, в котором такой же режим применяется один раз к ¹⁵ N-меченых клеток и один раз немеченых клеток и соответствующего немеченого или ¹⁵ N-меченые клетки служат в качестве контрольных. В этом случае двойные количества клеточных культур необходимы.

2. Плазменные Мембрана Очистка

Примечание: Все дальнейшие шаги выполняются в холодной комнате и / или на льду, если это не указано иное.

1. Однородный клетки от около 1 л 7 дней культурах клеточной суспензии в жидком азоте.Материал можно хранить при -80 ° С до дальнейшего использования.
2. Смешайте одинаковое количество меченых и немеченого культур замороженных клеток на основе сырого веса в химический стакан и добавить 2 объемами буфера H немедленно. В случае мембранного подготовки микродоменной предлагается использовать, по меньшей мере 7 г сырого веса обоих меченых и без таковой клеток.
3. Поместите стакан на шейкере и встряхните пока материал не плавится и раствор жидкости и без кристаллов льда.
4. Фильтр гомогената через один слой Miracloth в 50 мл центрифужные пробирки.
5. Образцы Баланс с буферной Н и центрифуге при 10000 мкг в течение 8 мин.
6. Загрузите супернатант в предварительно охлажденные пробирки ультра-центрифуги (например, для ротора Beckman Coulter SW31Ti), с объемом около 32 мл
7. Образцы равновесии с буфером ч и осаждения микросом центрифугированием при 100000 х г при 4 ° С в течение 30 мин с помощью Beckman SW32Ti ротор.
8. Удалить супернатант после центрифугирования.

ПРИМЕЧАНИЕ: супернатант содержит растворимые белки. Небольшое количество этой фракции могут быть сохранены для дальнейшего осаждения белка и последующего анализа также растворимых белков.

9. Ресуспендируют осадок мембран из каждого образца в соответствующем количестве буферного R и загрузить на верхней части U1 двухфазной системе (рис. 2). Если используется 6 г двухфазная система, сработал ровно 2 г ресуспендированного мембраны гранул.

Примечание: Конечный объем буферной R зависит от размера в двухфазной системе, которая будет использоваться (~ 1,6 мл буфера R необходим при использовании системы 6 г). Рекомендуется использовать меньше буфер для ресуспендированием так чисто буфер может быть добавлен на двухфазной системе, чтобы получить требуемую вес, а не использовать слишком много буфер для растворения, а не быть в состоянии загрузить весь образец на двухфазной системе.

10. Загрузить тот же объем чистого буфера R как используемый для гоэ образец ресуспендирование на U2.
11. Медленно перемешать U1 и U2 труб путем обращения их 30x (примерно 1 инверсии / сек).

ПРИМЕЧАНИЕ: Не энергично встряхнуть двухфазной системы. Это может привести к отсутствие разделения фаз на стадии ультрацентрифугирования.

12. Центрифуга образцов при 1500 х г при 4 ° С в течение 10 мин.
13. Удалить супернатант после центрифугирования.
14. Передача верхней фазы с U1 на U2 и повторить центрифугирования при 1500 х г при 4 ° С в течение 10 мин.
15. Переместить верхнюю фазу из U2 в ультрацентрифуге труб SW41Ti и разбавить его с пятью объемами буфера R и тщательно перемешать.

ПРИМЕЧАНИЕ: Окончательное верхнюю фазу, возможно, придется быть разделен на отдельные Ультрацентрифуга труб, прежде чем он может быть разбавлен в пять раз.

16. Центрифуга образцов при 200 000 х г при 4 ° С в течение одного часа с использованием ротора SW41Ti.
17. Ресуспендируют осадок мембран в Смальл количество TNE буфера (обычно 200 мкл буфера используется) для изоляции моющих устойчивых мембран.

ПРИМЕЧАНИЕ: Небольшое количество этой фракции могут быть сохранены для анализа нефракционированного мембране.

ПРИМЕЧАНИЕ: мембранную фракцию плазмы можно хранить при температуре 4 ° С в течение ночи до фракционирования в моющих устойчивых оболочек и моющих растворимых фракций.

3. Моющее средство Устойчив Получение мембран

1. Проверьте концентрацию плазменного мембранной фракции по Бредфорда.
2. Добавить Тритон Х-100 в мембранной фракции плазмы. Конечная концентрация моющего средства должны оставаться между 0,5-1%. Моющее средство для веса белка в весовом соотношении должны остаться между 13-15.
3. Образцы содрогнутся около 100 оборотов в минуту при 4 ° С в течение 30 мин.
4. Добавить три тома 2,4 М сахарозы в одном объеме обрабатываемой плазматической мембраны, чтобы получить 1,8 М конечной концентрации сахарозы.
5. Подготовьте сахарозы градиент в SW41Ti Ультрацентрифуга труб, загрузив соответствующие растворы сахарозы на верхней части 1,8 М фракции, как показано на рисунке 3.
6. Центрифуга образцов при 250 000 х г при 4 ° С в течение 18 часов с использованием ротора Beckman SW41Ti.
7. Осторожно снимите ультрацентрифуге труб от ротора, чтобы избежать нарушая полосы низкой плотности, которые могут быть видны как молочно кольца на границе 0,15 M/1.4 М сахарозы. Иногда ничего не видно, но доля по-прежнему содержит стойкую белковую фракцию моющего средства.
8. Удалить фракцию 0,75 мл объема из верхней части градиента. Фракции 2 и 3, которые охватывают объем около 1,5 мл выше межфазной кольца и 0,5 мл ниже представляют моющего средства стойкий мембранной фракции. Соберите эти фракции в 15 мл пробирки Фалкон. Фракции 9 и 10 содержат моющего растворимого мембранной фракции, а также может быть собрана для сравнения. Для дальнейшего анализа бассейна FractИоны 2 и 3, а также фракции 9 и 10.

4. Добыча белки от Устойчивость фракции моющих по метанол / хлороформ

ПРИМЕЧАНИЕ: Все шаги осуществляются в комнатной температуре.

1. Добавить 4 объемов метанола, собранных фракций и тщательно вихря.
2. Добавить 1 объем хлороформа, тщательно вихрь.
3. Добавить 3 объема воды, вихрь полностью.
4. Центрифуга образцов при 2000 мкг в течение 5 мин с использованием настольной центрифуге (например Эппендорф 5417R).
5. Удалить водную фазу над слоем белка в интерфазе.
6. Добавить 3 объемов метанола, вихревые тщательно.
7. Центрифуга образцов при 4000 х г в течение 10 мин.
8. Удалить супернатант и сухой осадок. Высушенный осадок готов к в-решения пищеварения.

5. В растворе трипсина Пищеварение

ПРИМЕЧАНИЕ: В этой процедуре все шаги сделаны втемпература в помещении для уменьшения нежелательных модифицирования аминокислотных боковых цепей по денатурирующих.

1. Растворите образца в небольшом объеме 6 М мочевины, 2 М thiurea, рН 8 (UTU). Использование в качестве малый объем, насколько это совместимо с образцом (обычно приблизительно 40 мкл).
2. Образцы растворяли в Спин UTU на 5000 мкг в настольной центрифуге Eppendorf (например 5417R) в течение 10 мин для осаждения нерастворимого материала.
3. РН конечного раствора должна быть около 8,0 для оптимального трипсин-переваривание. Проверьте с рН полос.
4. Добавить 1 мкл буфера для каждого сокращения 50 мкг образца белка и инкубировать 30 мин при комнатной температуре.

ПРИМЕЧАНИЕ: Только грубая оценка содержания белка необходимо. Когда количество образца ограничен лучше пожертвовать точность, а не тратить на образец белкового анализа.

5. Добавить 1 мкл буфера алкилирования для каждого образца белка 50 мкг и инкубировать 20 мин при комнатной температуре в темном.
6. Добавить 0,5 мкл LysC за 50 мкг белка образца и инкубировать в течение трех часов при комнатной температуре при постоянном встряхивании при 700 оборотах в минуту. Если необходимо, дайджест также может быть осуществлено в течение ночи. Тем не менее, длительное время при высокой температуре, не рекомендуется, поскольку это может увеличить потерю пептида за счет адсорбции на пластического материала трубы в водных рН 8 условий.
7. Развести пробы с четырьмя объемами 10 мМ Трис-HCl, рН 8.

Примечание: Этот шаг является абсолютно необходимым, чтобы разбавить концентрацию мочевины как трипсин очень чувствителен к высокой концентрации соли.

8. Добавить 1 мкл трипсина на 50 мкг белка образца и инкубировать в течение ночи при комнатной температуре при постоянном встряхивании при 700 оборотах в минуту.
9. Подкислить образцов до 0,2% ТФУ конечной концентрации до достижения рН 2 (добавить приблизительно 1/10 объема 2% трифторуксусной кислоты).

Примечание: Образцы можно хранить при - 20 ° C до использования в дальнейшем, но лучше, чтобы сохранитьих на StageTips при 4 ° С, если это в течение короткого времени (одна неделя) или сохранить их после StageTips обессоливания.

6. Изготовление C _18-StageTips

1. Поставьте Empore Disk C18 на ровную чистую поверхность, например, одноразовой пластиковой чашке Петри.
2. Удар небольшую диск при помощи тупого наконечником иглы для подкожных инъекций с диаметром 1,5 мм. Диск палочки в иглу и могут быть переданы в кончика пипетки.
3. Нажмите диск из иглы и закрепите его в сужения кончика пипетки куском плавленого кварца или трубки фитинга во внутренней части иглы.

ПРИМЕЧАНИЕ: StageTips можно хранить сухой при комнатной температуре ^21.

7. Использование C _18-StageTips для пептида опреснения и концентрации

1. Условие а C _18-StageTip путем размещения 50 мкл раствора В на подготовленную StageTip. Вращайте чаевые в центрифуге при 2000 оборотов в минуту в течение 2 мин в настольной сentrifuge (например Эппендорф 5417R).

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте адаптеры для спин StageTips в центрифуге Эппендорф, жидкость будет собираться в 2 мл реакционную трубку. Для более крупных препаратов, советы стадии также могут быть размещены в стойке с наконечником 96 из 200 мкл наконечниками и жидкость может быть собрана в планшет для микротитрования.

ПРИМЕЧАНИЕ: Никогда не используйте более высокую скорость, чем 3000 мкг в настольной центрифуге (например Эппендорф 5417R) в связи с риском из-под С ₁₈ диск из чаевых.

2. Уравновешивают StageTip помощью 100 мкл раствора А. Спин наконечник в центрифуге при 5000 мкг в в настольной центрифуге (например Эппендорф 5417R).
3. Повторите шаг 2.
4. Нагрузка образца на диске, осторожно пипеткой образец в наконечником пипетки с диском внутри.

ПРИМЕЧАНИЕ: Один диск может связать ок. 100 мкг белка.

5. Вращайте советы в СЕntrifuge пока весь объем образца не проходят через C ₁₈ диска.
6. Вымойте StageTips два раза с 100 мкл раствора А. прясть советы в центрифуге.

ПРИМЕЧАНИЕ: Промытые и загруженные StageTips можно хранить при температуре 4 ° С в течение до недели.

7. Элюции образца с 40 мкл раствора B. Сбор элюат в свежем 1,5 мл реакционной трубки.
8. Концентрат образца в Speed ​​Vac. В идеальных условиях, остановить процесс обезвоживания, поскольку есть только приблизительно 1 или 2 мкл жидкости осталось.

Примечание: высушенные образцы могут быть сохранены в -80 ° С в течение многих лет.

9. Добавить конечный объем 9 мкл ресуспендирующего решения образца и передать его на микротитрационного планшета для массового анализа спектра.

Примечание: Конечный объем использованного ресуспендирующего буфера зависит от потребностей экспериментатора и чувствительности масс-спектрометраиспользуется.

8. Альтернативная Протокол фосфопептид обогащения

Примечание: для обогащения фосфопептида, экстракция белка на стадии 2 должно быть сделано в присутствии ингибиторов фосфатазы.

Примечание: Точный концентрация белка не должны быть определены для следующих шагов. Достаточно иметь грубую оценку содержания белка, чтобы избежать ненужных потерь образца

1. Подготовьте С _8-StageTips (следовать той же протокол для подготовки С _18-StageTips в шаге 6).
2. Передача 1 мг TiO ₂ шариков в верхнюю часть готова C _8-StageTips (использование 1 мг TiO ₂ в 100 мкг белка).
3. Уравновесить TiO ₂ советы со 100 мкл раствора С, спина при 2000 мкг в течение 5 мин в настольной центрифуге (например Эппендорф 5417R).
4. Смешайте 100 мкг переваривается и обессоленной пептидов из шага 7.7 ​​(она должна быть в 100 мкл раствораB) со 100 мкл раствора А.
5. Загрузите смешанный образец на уравновешенных TiO ₂ колонки; спин при 1000 мкг, 5 мин.
6. Сбор проточные и загрузить его на том же наконечником снова (держать поток через после второго прохода).
7. Вымойте наконечник 100 мкл раствора А; спин при 2000 мкг в, 5 мин в настольной центрифуге (например Эппендорф 5417R).
8. Элюции образца с 50 мкл 5%-ного аммиака.
9. Элюции образца с 50 мкл 5% пиперидина (как Элюаты могут быть объединены).
10. Немедленно подкисляют примера с использованием 50 мкл 20%-ной фосфорной кислоты. рН должно быть около 2.

ПРИМЕЧАНИЕ: Сохраните TiO ₂ советы и получить порошок. Он может быть промывают раствором В и повторно использовать для одного или двух более раундов.

11. Опять опреснения подкисленной пробы над C ₁₈ советов (см. шаг 8).

9. ЖХ-МС/МС Анализ пептидных смесей

1. Ресуспендируют обессоленной Phosphopeptides в ресуспендирующего буфера.
2. Нагрузка ресуспендировали образец на LC-MS/MS системы выбора и приобрести спектры в зависимости данных режиме при предложенной разрешением 60000 полных ширин на полувысоте.

ПРИМЕЧАНИЕ: Для обеспечения оптимальной фрагментации, либо сканирование нейтральной потери следует применять ^22, или при наличии многоступенчатой ​​активации ^23. Если ETD доступно это позволит пептид магистральной фрагментации без потери фосфорной кислоты ^24.

ПРИМЕЧАНИЕ: Пик списки от исходных данных должны быть извлечены и представлены идентификации базы данных, а также для количественного определения. Здесь мы описываем настройки для использования талисманов и MSQuant, который работает для файлов исходных данных из LTQ, LTQ-Orbitrap и LTQ-ФТ инструментов (Thermo Scientific).

3. Выписка пик список, используя DTAsupercharge в меню "Помощник" в MSQuant. Используйте настройки по умолчанию.
4. Отправить в результате пик списке файлов, чтобы талисман поисковой системы. Critical настройки: предшественники ионной масс толерантности 10 частей на миллион, MS / MS масса толерантности 0,5 Da. Основные модификации: carbamidomethylation цистеинов, переменная модификации: окисления метионина, фосфорилирование серин, треонин, тирозин. Количественный способ: ¹⁵ Н метаболический маркировки.
5. Сохранить талисмана результат, как веб-страницы файла.
6. Загрузите талисман файл результатов и необработанный файл в MSQuant. Выберите все белки, представляющие интерес и запустить "Автоматическая количественное". Программа будет читать полные спектры сканирования из сырой файл и сделать пик интеграции для меченых и без таковой партнеров каждого пептида.
7. Результаты Экспорт Quantitation в программе электронных таблиц или в табуляцией текстовый файл. Затем данные могут быть представлены в дальнейшего статистического анализа в Excel или с помощью дополнительных пакетов программного обеспечения, таких как Statquant ²⁵ или взломщик ^26.

Результаты

С помощью представленного протокола метаболически меченые культуры Arabidopsis клетки можно изолировать плазматические мембраны из растительной ткани (Шаг 2, фиг.2 и 4) и обогащают для моющих устойчивы мембранных фракций в плазматической мембране (шаг 3, фиг 3 и 5). Впосл...

Обсуждение

Протокол, представленные в этой статье, содержит много шагов, и все они имеют решающее значение для получения чистого и представительного фракционирование плазмы мембраны растений в моющих устойчивых оболочек и моющих растворимых фракций. Поэтому важно следить за каждым шагом в соот?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
Chemicals were ordered from Sigma-Aldrich unless noted otherwise
Ammonia (stock 25 % solution)	WAKO	010-03166
TiO2 10 μm	GL-Science	5020-75010
Empore Disk C18	Varian	12145004
Polyethylene glycol(PEG 3350)	Sigma	88276
Dextran T500	Roth	9219.2
Trypsin	Promega	V5113
Protease inhibitor cocktail (PIC)	Sigma	P9599
K15NO3	Cambridge Isotope Laboratories	NLM-765-PK
EQUIPMENT
Optima L-80 XP Ultracentrifuge	Beckman
Plate reader	BioTek
EASY-nLC II nano-Liquid Chromatograph	Thermo Scientific
LTQ-Orbitrap mass spectrometer	Thermo Scientific
Centrifuge 5810R	Eppendorf
Centrifuge 5417R	Eppendorf
Thermomixer	Eppendorf
Speed Vac RVC 2-25	Christ
Shaker Unimax 2010	Heidolph