Metabólicas etiquetado y de membrana de fraccionamiento para Comparativo Proteómica Análisis de<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Culturas suspensión celular

Resumen

Aquí se describe un método robusto para el fraccionamiento de las membranas de plasma de plantas en las membranas solubles resistentes y detergentes detergente a base de una mezcla de no marcado e in vivo completamente ¹⁵ N cultivos de células de Arabidopsis thaliana etiquetados. El procedimiento se aplica para los estudios proteómicos comparativos para entender los procesos de señalización.

Resumen

Microdominios de membrana de plasma son características basadas en las propiedades físicas del entorno de lípidos y esteroles y tienen funciones específicas en los procesos de señalización. La extracción de microdominios de membrana enriquecidos con esteroles a partir de células de plantas para el análisis proteómico es una tarea difícil debido principalmente a múltiples pasos de preparación y las fuentes de contaminación de otros compartimentos celulares. La membrana plasmática constituye sólo alrededor del 5-20% de todas las membranas en una célula de planta, y por lo tanto el aislamiento de la fracción de membrana de plasma altamente purificado es un reto. Un método utilizado con frecuencia implica acuosa de partición de dos fases en glicol de polietileno y dextrano, que produce vesículas de la membrana de plasma con una pureza de 95% ^1. Microdominios de membrana rica en esteroles dentro de la membrana de plasma son insolubles tras el tratamiento con detergentes no iónicos en frío a pH alcalino. Esta fracción de membrana resistente al detergente se puede separar de la membrana plasmática a granel por ultracentrifugación en comogradiente ucrose ^2. Posteriormente, las proteínas se pueden extraer de la banda de baja densidad de la gradiente de sacarosa mediante precipitación de metanol / cloroformo. Proteína extraída a continuación, se digirió tripsina, se desalaron y finalmente analizado por LC-MS/MS. Nuestro protocolo de extracción para microdominios rica en esteroles está optimizado para la preparación de fracciones de membrana limpias detergente resistentes de cultivos de células de Arabidopsis thaliana.

Utilizamos marcaje metabólico completo de los cultivos celulares suspensión de Arabidopsis thaliana con K ¹⁵ NO ₃ como única fuente de nitrógeno para los estudios proteómicos comparativos cuantitativos después del tratamiento biológico de interés ^3. Mediante la mezcla de iguales proporciones de cultivos de células marcadas y no marcadas para la extracción de proteínas conjunta la influencia de pasos de preparación sobre resultado cuantitativo final se mantiene a un mínimo. También la pérdida de material durante la extracción afectará tanto el control y las muestras de tratamiento de la misma manera, unad, por tanto, la relación entre la luz y el péptido tirón se mantendrá constante. En el método propuesto ya sea marcada o no marcada cultivo celular se somete a un tratamiento biológico, mientras que el otro sirve como control ^4.

Introducción

En 1972, Jonathan Singer y Garth Nicolson propusieron el modelo de mosaico fluido un modelo de estructura de las membranas celulares, en sustitución del modelo de sándwich proteína-proteína-lípido que en general se aceptó a principios de 1960. Singer y Nicolson postularon que la membrana biológica puede ser considerado como un líquido de dos dimensiones, donde todas las moléculas de lípidos y de proteínas se difunden libremente y fácilmente ^5. Desde ese momento, la estructura del modelo de la membrana plasmática y el conocimiento de la composición de la membrana se hizo aún más complejo. En particular, dentro de la membrana plasmática, se pueden observar estructuras tales como complejos de proteínas y lípidos basados ​​/ esterol microdominios estructuralmente desordenados. En membranas modelo artificiales ^6,7, esteroles y esfingolípidos pueden separar lateralmente de otras especies de lípidos para formar regiones con características físicas alteradas. Esta segregación dentro de la membrana celular es causada principalmente por las propiedades de auto-asociación entre esteroles y altamente sacadenas de hidrocarburos turated de phopsho-y esfingolípidos ^8. En particular, los anillos de esterol rígidos favorecen interacciones con más rígido y especies de lípidos más recta saturados y estas interacciones obligan a cadenas de hidrocarburos vecinos en más conformaciones extendidas, el aumento de grosor de la membrana y la dureza.

Una de las características comúnmente observados de esterol enriquecido microdominios de membrana era su insolubilidad tras el tratamiento con detergentes no iónicos Triton X-100 tales o Brij 35. Estas fracciones se cree que son idénticos a los microdominios de membrana y fueron llamados membranas resistentes a detergentes (DRM) en función de su método de preparación bioquímica ^2. El uso de detergentes no iónicos durante la extracción DRM recibió algunas críticas como la preparación DRM bioquímica puede no corresponder directamente a cualquier compartimento de membrana específico dentro de la célula viva ^9. Particularmente, el detergente a la proporción de proteína parece crucial en tales preparaciones, unas de diferentes detergentes, así como diferentes cantidades de detergente pueden producir diferente composición de la fracción de membrana resistente al detergente ^10. Sin embargo, hay evidencia de que las especies de proteínas particulares se asocian específicamente con estos dominios de membrana rica en esteroles celulares, y que estas proteínas son bien enriquecidas en preparaciones bioquímicas de fracciones de membrana de detergente resistente ^11. El núcleo de proteínas que se encuentra en la fracción de DRM de la planta, y para los cuales la presencia de DRMs era esterol dependiente, fueron particularmente proteínas ancladas a GPI, como las proteínas-fasciclin como arabinogalactano (FLAS) y miembros de la familia de proteínas SKU. También se encontraron algunas proteínas de señalización, tales como quinasas o fosfolipasas similares al receptor de ^11. Estos resultados son consistentes con muchos estudios proteómicos en microdominios de membrana de mamíferos ^12,13. También en las plantas cada vez hay más pruebas para el papel de microdominios de membrana en el contexto de la respuesta de estrés ^{14 -}16.

El protocolo descrito aquí proporciona un método robusto para el fraccionamiento de microdominios de membrana de plasma y en particular utiliza una proteína a la concentración de detergente que nos permite representar las alteraciones inducidas por el estrés de el compartimiento de membrana rica en esteroles ^4,11,14.

Protocolo

PROCEDIMIENTO

Reactivos y tampones comunes usados ​​en el protocolo de extracción:

1. Medio JPL para la suspensión de cultivos celulares de Arabidopsis thaliana
   • 3 M H ₃ BO ₃
   • 3 M _MnSO4 x H ₂ O
   • 1,1 M ZnSO ₄ x 7 H ₂ O
   • 0,15 M KJ
   • 0,03 M Na _{2 Moo 4} x 2 H ₂ O
   • 3 nM _CoCl2 x 6 H ₂ O
   • 3 nM CuSO ₄ x 5 H ₂ O
   • 0,9 mM CaCl ₂ x 2 H ₂ O
   • 0,5 mM MgSO ₄ x 7 H ₂ O
   • 0,5 M _FeSO4 x 7 H ₂ O
   • 0,5 M Na ₂ EDTA x 2 H ₂ O
   • 0,12 M de HCl de tiamina
   • 0,16 M de ácido nicotínico
   • Piridoxina HCl 0,097 M
   • 0.107 M NAA
   • 0,375 mM KH ₂ PO ₄
   • 0,061 mM NaH2 PO ₄ x 2 H ₂ O
   • 0,039 mM Na ₂ HPO ₄
   • Glicina 0,027 mM
   • 0,56 mM myo-inositol
   • 1,5% de sacarosa
   • 10 mM K ¹⁴ NO ₃ o 10 mM K ¹⁵ NO ₃

NOTA: el pH del medio de JPL se debe ajustar a 5,7 con KOH. El medio debe ser esterilizado por filtración o tratamiento en autoclave antes de su uso.

2. Tampón H
   • 100 mM de HEPES-KOH (pH 7,5)
   • 250 mM de sacarosa
   • 10% (w / v) de glicerol
   • EDTA 5 mM
   • Ácido ascórbico 5 mM
   • 0.6% (w / v) de PVP K-25 o K-30
   • DTT 5 mM (añada fresca)
   • 1 mM PMSF (añada fresca)
   • inhibidores de la proteasa y fosfatasa (añadir fresca)
     • NaF 50 mM
     • 1 mM Na ₃ VO ₄
     • 1 mM de benzamidin
     • 0,3 M mikrocystin
     • 4 M leupeptina
     • cóctel inhibidor de la proteasa
3. Buffer R
   • Fosfato de potasio 5 mM
   • 0,33 M de sacarosa
   • 3 mM de KCl
   • EDTA 0,1 mM
   • DTT 1 mM (añada fresca)
4. Tampón TNE
   • 25 mM de Tris-HCl, pH 7,5
   • 150 mM de NaCl
   • EDTA 5 mM
5. El sistema de dos fases (6 g-sistema es adecuado para un máximo de 15 g de la muestra el peso fresco) Método de preparación
   En 15 ml Falcon ingredientes de la mezcla del tubo se indican a continuación y mezclar bien:
   • 20% (w / w) de dextrano T500 - 2,6 g
   • 40% (w / w) de poli (etilenglicol) (PEG 3350) - 1,3 g
   • sacarosa - 0,678 g
   • 0,2 M de fosfato de potasio, pH 7,8 a 0,15 ml
   • 2 M de KCl - 0.014 ml
   • añadir agua hasta que la masa total del sistema de dos fases es de 6 g.
6. Soluciones de sacarosa en tampón TNE
   • 2,4 M, 1,6 M, 1,4 M, 0,15 M
7. Reactivos para la digestión con tripsina
   • UTU: 6 M de urea, 2 M tiourea (pH 8,0 con Tris-HCl 10)
   • Buffer de Reducción (1 mg / l de DTT en agua; 6,5 mM)
   • Buffer de alquilación (5 mg / l de yodoacetamida en agua; 27 mM)
   • LysC endopeptidasa (0,5 mg / l)
   • Tripsina, modificado la secuencia grado (0,4 mg / l)
8. Reactivos para la desalación del péptido más de C ₁₈
   • solución de resuspensión: ácido 2% trifluoroacético (TFA), acetonitrilo 5% en agua
   • Solución A: ácido acético al 0,5%
   • solución B: acetonitrilo al 80%, ácido acético 0,5%
9. Reactivos para el enriquecimiento phosphopeptide
   • Solución A: 0,1% de TFA, 5% de acetonitrilo
   • Solución B: 0,1% de TFA, 80% de acetonitrilo
   • De TiO ₂ 10 micras
   • Amoníaco (solución madre al 25%)
   • Piperidina (Disponible 100%)

PROTOCOLOS

1. Marcaje metabólico de Arabidopsis thaliana suspensión celular culturas

1. Crecer Arabidopsis Col-0 célulacultivos en suspensión derivadas de las hojas ¹⁷ en un medio completo ¹⁴ N-JPL ^(18; véase la sección "Reactivos y tampones comunes") y un conjunto de culturas en medio ¹⁵ N-JPL en frasco estéril en condiciones de luz constante en 80 a 100 mmol / m ² s, 23 ° C, bajo agitación constante a 120 rpm.
2. Para mantener los cultivos celulares, inocular 400 ml de medio JPL fresca con 40 ml de los siete cultura día celular viejo en frascos de 1 L.
3. La recolección de cultivos de células se produce a través de la succión del vacío a través de un embudo de vidrio de ancho con una malla de acero inoxidable. Las células se acumulan en la placa de malla y en el embudo y pueden ser fácilmente recogidos de allí. Las células se recomiendan para ser congeladas a -80 ° C o en nitrógeno líquido antes de la molienda.

NOTA: Para ¹⁵ N cultivos de células marcadas metabólicamente utilizan el K ¹⁵ N º ₃ como la única fuente de nitrógeno para al menos dos pasajes durante dos semanas ^19. En experimentos para proteómica comparativa, use un cultivo celular etiquetada ¹⁵ N y también mantienen una cultura sin etiqueta en un medio normal. El tratamiento biológico se aplicará entonces a la cultura, ya sea marcado o no marcado, mientras que el otro sirve como control (Figura 1). Para la preparación de proteínas, las dos culturas se combinarán ^20. Al planificar la configuración experimental, se recomienda considerar un ajuste de etiquetado recíproco ⁴ en el que se aplica el mismo tratamiento una vez a las células marcadas ^N-15 y una vez que las células no marcadas y el respectivo sin etiqueta o ¹⁵ células N-etiquetados sirven como controles. En este caso, se necesitan las cantidades dobles de cultivos de células.

2. Membrana plasmática La purificación

NOTA: Todos los pasos adicionales se llevan a cabo en la sala de frío y / o en el hielo a menos que se indique lo contrario.

1. Homogeneizar las células de alrededor de 1 l de cultivos en suspensión de células 7 días de edad en nitrógeno líquido.El material se puede almacenar a -80 ° C hasta su uso posterior.
2. Mezclar las mismas cantidades de cultivos celulares congelados etiqueta y etiqueta basado en el peso fresco en un vaso de precipitados y añadir 2 volúmenes de tampón H inmediatamente. En caso de la preparación de microdominios de membrana se sugiere utilizar al menos 7 g de peso fresco de ambas células marcadas y no marcadas.
3. Colocar el vaso en un agitador y agitar hasta que el material se funde y la solución es líquido y sin cristales de hielo.
4. Filtrar el homogenato a través de una capa de Miracloth en tubos de 50 ml de centrífuga.
5. Muestras de equilibrio con tampón H y centrifugar a 10000 g durante 8 min.
6. Cargue el sobrenadante en tubos ultra-centrífuga pre-enfriado (por ejemplo, para el rotor Beckman Coulter SW31Ti), con un volumen de unos 32 ml
7. Muestras de equilibrio con tampón H y sedimentar los microsomas por centrifugación a 100.000 xg a 4 ° C durante 30 minutos usando rotor Beckman SW32Ti.
8. Eliminar el sobrenadante después de la centrifugación.

NOTA: El sobrenadante contiene las proteínas solubles. Una pequeña cantidad de esta fracción se puede guardar para su posterior precipitación de proteínas y análisis posterior también de proteínas solubles.

9. Resuspender el sedimento de membrana de cada muestra respectiva en cantidad de tampón R y cargar en la parte superior del sistema de dos fases U1 (Figura 2). Si se utiliza el sistema de dos fases 6 g, cargar exactamente 2 g de sedimento de membrana resuspendido.

NOTA: El volumen final de tampón R depende del tamaño del sistema de dos fases que se van a utilizar (~ 1,6 ml de tampón R se necesita cuando se utiliza 6 g del sistema). Se recomienda usar menos memoria intermedia para la resuspensión de manera tampón puro se puede añadir en sistema de dos fases para obtener el peso exigido, en lugar de usar demasiado tampón para solubilización y no ser capaz de cargar toda la muestra en el sistema de dos fases.

10. Cargar el mismo volumen de tampón puro R tal como se utiliza para the muestra de resuspensión en U2.
11. Mezcle lentamente tubos U1 y U2 invirtiendo ellos 30x (aproximadamente 1 inversión / seg).

NOTA: No agitar enérgicamente el sistema de dos fases. Se puede causar una falta de separación de las fases en la etapa de ultracentrifugación.

12. Centrifugar las muestras a 1500 xga 4 ° C durante 10 min.
13. Eliminar el sobrenadante después de la centrifugación.
14. Transferir la fase superior de U1 en U2 y repetir la centrifugación a 1500 xga 4 ° C durante 10 min.
15. Mueva la fase superior de U2 en los tubos de ultracentrífuga SW41Ti y diluirlo con cinco volúmenes de tampón I y mezclar bien.

NOTA: La fase superior final puede tener que ser dividido en tubos de ultracentrífuga separados antes de que pueda ser diluida cinco veces.

16. Centrifugar las muestras a 200.000 xg a 4 ° C durante una hora usando el rotor SW41Ti.
17. Resuspender sedimento de membrana en Small cantidad de tampón TNE (típicamente se utiliza 200 l de tampón) para el aislamiento de las membranas resistentes a los detergentes.

NOTA: Una pequeña cantidad de esta fracción se pueden guardar para el análisis de la membrana plasmática no fraccionada.

NOTA: La fracción de membrana de plasma se puede almacenar a 4 ° C durante la noche antes del fraccionamiento en las membranas resistentes a detergentes y fracciones solubles en detergente.

3. Detergente Resistente Preparación de la membrana

1. Comprobar la concentración de la fracción de membrana de plasma mediante el ensayo de Bradford.
2. Añadir Triton X-100 a la fracción de membrana de plasma. La concentración final de detergente debe estar entre 0,5 a 1%. El detergente en peso de proteínas en relación al peso debe mantenerse entre 13-15.
3. Muestras Shake en torno a 100 rpm a 4 º C durante 30 min.
4. Añadir tres volúmenes de 2,4 M de sacarosa a un volumen de la membrana de plasma tratado para obtener 1,8 M de concentración final de sacarosa.
5. Preparar el gradiente de sacarosa en tubos de ultracentrífuga SW41Ti por la carga de las respectivas soluciones de sacarosa en la parte superior de la fracción 1,8 M como se ilustra en la Figura 3.
6. Centrifugar las muestras a 250.000 xg a 4 ° C durante 18 horas utilizando el rotor Beckman SW41Ti.
7. Retire con cuidado los tubos de ultracentrífuga del rotor para evitar la interrupción de la banda de baja densidad, que puede ser visible como un anillo de lechosa en la interfaz de 0,15 M/1.4 M de sacarosa. A veces no se ve nada, pero la fracción todavía contiene la fracción proteica resistente detergente.
8. Eliminar la fracción de 0,75 ml de volumen de la parte superior del gradiente. Las fracciones 2 y 3 que cubren volumen de alrededor de 1,5 ml por encima del anillo de interfase y 0,5 ml por debajo representan la fracción de membrana resistente al detergente. Reunir estas fracciones en 15 ml tubos Falcon. Las fracciones 9 y 10 contienen la fracción de membrana soluble en detergente y también pueden ser recogidos para la comparación. Para un análisis más detallado, piscina fractiones 2 y 3, así como las fracciones 9 y 10.

4. Extracción de proteínas de la fracción de detergente resistentes por metanol / cloroformo

NOTA: Todas las etapas se llevan a cabo en la temperatura ambiente.

1. Añadir 4 volúmenes de metanol para las fracciones recogidas y mezclar bien.
2. Añadir 1 volumen de cloroformo y agitar bien.
3. Añadir 3 volúmenes de agua, mezclar bien.
4. Centrifugar las muestras a 2000 xg durante 5 min utilizando una centrífuga de sobremesa (por ejemplo, Eppendorf 5417R).
5. Retirar la fase acuosa por encima de la capa de proteína en la interfase.
6. Añadir 3 volúmenes de metanol, mezclar bien.
7. Centrifugar las muestras a 4000 xg durante 10 min.
8. Eliminar el sobrenadante y secar el pellet. El precipitado seco está listo para la digestión en solución.

5. En solución de tripsina digestión

NOTA: En este procedimiento, todas las medidas se realizan atemperatura ambiente para reducir la derivatización no deseada de aminoácidos cadenas laterales por los desnaturalizantes.

1. Disolver la muestra en pequeño volumen de 6 M urea, 2 M thiurea, pH 8 (UTU). Utilice un precio tan bajo volumen que no entorpezca la muestra (generalmente aproximadamente 40 l).
2. Muestras de Spin solubilizados en UTU a 5.000 xg en una centrífuga de sobremesa (por ejemplo, Eppendorf 5417R) durante 10 min para sedimentar cualquier material insoluble.
3. El pH de la solución final debe estar cerca de 8,0 para la digestión óptima de la tripsina. Consulte con tiras de pH.
4. Añadir 1 l de tampón de reducción por cada 50 g de proteína de la muestra e incubar 30 min a temperatura ambiente.

NOTA: Sólo una estimación aproximada del contenido de proteína es necesaria. Cuando la cantidad de muestra es limitado, es mejor sacrificar la precisión en lugar de perder la muestra en un ensayo de proteínas.

5. Añadir 1 l de tampón de alquilación para cada proteína de la muestra 50 g e incubar 20 min a temperatura ambiente en la oscuridad.
6. Añadir 0,5 l de LysC por 50 g de proteína de la muestra y se incuba durante tres horas a temperatura ambiente con agitación constante a 700 rpm. Si es necesario, el producto de digestión también se puede llevar a cabo durante la noche. Sin embargo, no se recomienda el tiempo extendido a temperaturas cálidas, ya que puede aumentar la pérdida de péptidos debido a la adsorción de material del tubo de plástico debajo acuosas pH 8 condiciones.
7. Diluir la muestra con cuatro volúmenes de 10 mM de Tris-HCl, pH 8.

NOTA: Este paso es absolutamente necesario para diluir la concentración de urea como tripsina es muy sensible a la alta concentración de sal.

8. Añadir 1 l de tripsina por 50 g de proteína de la muestra y se incuba durante la noche a temperatura ambiente con agitación constante a 700 rpm.
9. Acidificar las muestras a 0,2% de TFA concentración final para alcanzar un pH 2 (añadir aproximadamente 1/10 de volumen de ácido trifluoroacético 2%).

NOTA: Las muestras pueden ser almacenadas a - 20 ° C hasta su uso ulterior, pero es mejor para almacenarellos en StageTips a 4 ° C si es por un corto tiempo (una semana) o almacenarlos después StageTips desalado.

6. Fabricación de C _18-StageTips

1. Coloque un disco de C18 Empore sobre una superficie plana y limpia, como un plástico desechable placa de Petri.
2. Perfore un pequeño disco con una aguja hipodérmica de punta roma con diámetro de 1,5 mm. El disco se pega en la aguja y puede ser transferido a una punta de pipeta.
3. Empuje el disco de la aguja y fijarlo en el estrechamiento de una punta de pipeta por un pedazo de sílice o de los accesorios en el interior de la aguja de la tubería fundida.

NOTA: StageTips se pueden almacenar en seco a temperatura ambiente ^21.

7. El uso de C _18-StageTips para Péptido Desalación y concentración

1. Acondicionar un _C-18 StageTip colocando 50 l de solución B a la StageTip preparado. Gire la punta en la centrífuga a 2000 rpm durante 2 minutos en una mesa de trabajo centrifuge (por ejemplo, Eppendorf 5417R).

NOTA: Use los adaptadores para hacer girar StageTips en una centrífuga Eppendorf, líquido será recogida en un tubo de reacción de 2 ml. Para preparaciones a gran escala, consejos de etapa también se pueden colocar en un bastidor de punta con 96 de los 200 l consejos y el líquido pueden ser recogidas en una placa de microtitulación.

NOTA: No utilizar velocidades más altas que 3.000 xg en una centrífuga de sobremesa (por ejemplo, Eppendorf 5417R) debido al riesgo de hacer girar el disco de C ₁₈ de la punta.

2. Equilibre la StageTip usando 100 l solución A. Gire la punta en la centrífuga a 5000 xg en una centrífuga de mesa (por ejemplo, Eppendorf 5417R).
3. Repita el paso 2.
4. Cargue la muestra en el disco con la pipeta cuidadosamente la muestra en la punta de la pipeta con el disco dentro.

NOTA: Un disco puede unirse aprox. 100 g de proteína.

5. Haga girar los consejos en el centrifuge hasta que todo el volumen de la muestra pase a través del disco de C _18.
6. Lávese las StageTips dos veces con 100 l de solución A. girar los consejos en la centrífuga.

NOTA: Los StageTips lavadas y cargados se pueden almacenar a 4 ° C durante hasta una semana.

7. Eluir muestra con 40 l de la solución B. Recoger el eluido en un tubo nuevo 1,5 ml de reacción.
8. Concentrar la muestra en el Speed ​​Vac. En condiciones ideales, detenga el proceso de deshidratación ya que no se trata sólo de 1 o 2 l de líquido izquierda.

NOTA: Secado muestras se pueden almacenar en el -80 º C durante años.

9. Añadir un volumen final de 9 l de solución de resuspensión a la muestra y la transfiere a la placa de microtitulación para el análisis de espectrometría de masas.

NOTA: El volumen final de la memoria intermedia de resuspensión utilizado depende de las necesidades de experimentador y la sensibilidad del espectrómetro de masasutilizado.

8. Protocolo alternativo para fosfopéptido Enriquecimiento

NOTA: Para el enriquecimiento de fosfopéptidos, la extracción de proteína en el paso 2 se debe hacer en la presencia de inhibidores de la fosfatasa.

NOTA: La concentración de proteína exacta no tiene que ser determinada por los siguientes pasos. Es suficiente tener una estimación aproximada del contenido de proteína para evitar la pérdida innecesaria de la muestra

1. Prepare el _C8-StageTips (sigue el mismo protocolo para la preparación de C _18-StageTips en el paso 6).
2. Transferencia de 1 mg de TiO _2-perlas a la parte superior de preparados C _8-StageTips (uso de 1 mg de TiO ₂ por 100 g de proteína).
3. Equilibrar las _TiO2-tips con 100 l de solución C, centrifugado a 2000 xg durante 5 minutos en una centrífuga de mesa (por ejemplo, Eppendorf 5417R).
4. Mezclar 100 g de péptidos digeridos y desalado del paso 7.7 (que debe estar en 100 l de soluciónB) con 100 l de la solución A.
5. Cargue muestra mixta en las equilibradas _TiO2 columnas; centrifugado a 1000 xg, 5 min.
6. Recoger el filtrado y cargarla en la misma punta de nuevo (mantener el flujo a través después del segundo pase).
7. Lave la punta con 100 l de solución A; giran a 2.000 xg, 5 min en una centrífuga de mesa (por ejemplo, Eppendorf 5417R).
8. Eluir muestra con 50 l de 5% de amoniaco.
9. Eluir muestra con 50 l de 5% de piperidina (ambos eluidos se pueden combinar).
10. Se acidifica inmediatamente la muestra con 50 l de ácido fosfórico al 20%. pH debe estar en torno al 2.

NOTA: Guarde los _TiO2 consejos y recuperar el polvo. Se puede lavar con la solución B y se utiliza de nuevo para una o dos rondas más.

11. Una vez más desalar muestras acidificadas sobre C ₁₈ consejos (véase el paso 8).

9. LC-MS/MS Análisis de Mezclas de Péptidos

1. Resuspender fosf desaladaopeptides en tampón de resuspensión.
2. Cargar resuspendió la muestra en el sistema LC-MS/MS de elección y adquisición de espectros en modo depende de los datos en el sugerido resolución de 60.000 anchuras a media altura.

NOTA: Para la fragmentación óptima, ya sea escaneado neutro pérdida debe ser aplicado ^22, o si se dispone de la activación de varias etapas ^23. Si ETD disponible, se permite la fragmentación esqueleto peptídico sin pérdida de ácido fosfórico ^24.

NOTA: Las listas de pico a partir de los datos en bruto deben ser extraído y sometido a la base de datos de identificación, así como para la cuantificación. Aquí se describe la configuración para utilizar la mascota y MSQuant, que trabaja para los archivos de datos en bruto de LTQ, LTQ-Orbitrap e instrumentos LTQ-FT (Thermo Scientific).

3. Extracto lista pico usando DTAsupercharge dentro del menú "Helper" en MSQuant. Utilice la configuración predeterminada.
4. Enviar resultante pico lista de archivos de motor de búsqueda de la mascota. Crajustes itical: precursores de iones de masa tolerancia de 10 ppm, MS / MS tolerancia de masa 0,5 Da. Modificaciones fijos: carbamidomethylation de cisteínas, modificaciones variables: oxidación de la metionina, la fosforilación de serina, treonina, tirosina. Método de cuantificación: ¹⁵ N marcaje metabólico.
5. Ahorra Mascot resultado como archivo de página web.
6. Cargue el archivo de la mascota del resultado y de archivos en bruto en MSQuant. Seleccione todas las proteínas de interés y ejecutar "cuantificación automática". El programa leerá espectros de barrido completo desde el archivo RAW y hacer pico de la integración de socios de etiqueta y etiqueta de cada péptido.
7. Resultados de cuantificación de exportación a un programa de hoja de cálculo o un archivo de texto delimitado por tabuladores. Los datos pueden ser sometidas a un análisis más profundo estadística en Excel o con otros paquetes de software tales como Statquant ²⁵ o Cracker ^26.

Resultados

Con el protocolo presentado usando cultivos de células de Arabidopsis marcadas metabólicamente que es posible aislar las membranas plasmáticas a partir de tejido de la planta (paso 2, las Figuras 2 y 4), y para enriquecer resistente a detergentes fracciones de membrana dentro de la membrana de plasma (paso 3, las Figuras 3 y 5). Posteriormente, el protocolo permite la extracción de proteínas a partir de estos resistentes a detergentes fracciones de la membrana (paso 4) y l...

Discusión

El protocolo se presenta en este documento contiene muchos pasos y todos ellos son cruciales para obtener el fraccionamiento pura y representante de la membrana plasmática de plantas resistentes a las membranas de detergente y fracciones solubles detergentes. Por lo tanto, es importante seguir cada paso como se indica.

El tratamiento de la fracción de membrana de plasma con detergente no iónico (paso 3.2) tiene la mayor influencia en la calidad de la membrana de microdominios de fracciona...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
Chemicals were ordered from Sigma-Aldrich unless noted otherwise
Ammonia (stock 25 % solution)	WAKO	010-03166
TiO2 10 μm	GL-Science	5020-75010
Empore Disk C18	Varian	12145004
Polyethylene glycol(PEG 3350)	Sigma	88276
Dextran T500	Roth	9219.2
Trypsin	Promega	V5113
Protease inhibitor cocktail (PIC)	Sigma	P9599
K15NO3	Cambridge Isotope Laboratories	NLM-765-PK
EQUIPMENT
Optima L-80 XP Ultracentrifuge	Beckman
Plate reader	BioTek
EASY-nLC II nano-Liquid Chromatograph	Thermo Scientific
LTQ-Orbitrap mass spectrometer	Thermo Scientific
Centrifuge 5810R	Eppendorf
Centrifuge 5417R	Eppendorf
Thermomixer	Eppendorf
Speed Vac RVC 2-25	Christ
Shaker Unimax 2010	Heidolph