JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نحن تصف استخدام اثنين من ratiometric، أجهزة الاستشعار المشفرة وراثيا، والتي تقوم على GFP، لرصد الميتوكوندريا الدولة الأكسدة ومستويات ATP في قرار التحت خلوية في الخلايا الحية الخميرة.

Abstract

الميتوكوندريا لها أدوار في العديد من العمليات الخلوية، من استقلاب الطاقة والكالسيوم للسيطرة الخلوية العمر وموت الخلية المبرمج. تؤثر هذه العمليات وتتأثر حالة الأكسدة من إنتاج ATP وبواسطة الميتوكوندريا. هنا، نحن تصف استخدام اثنين من ratiometric، أجهزة الاستشعار المشفرة وراثيا التي يمكن الكشف عن الميتوكوندريا الدولة الأكسدة ومستويات ATP في قرار التحت خلوية في الخلايا الحية الخميرة. يتم قياس حالة الأكسدة الميتوكوندريا باستخدام حساسة الأكسدة بروتين الفلورية الخضراء (roGFP) التي يتم تستهدف المصفوفة الميتوكوندريا. ميتو-roGFP يحتوي cysteines في مناصب 147 و 204 من GFP، التي تخضع الأكسدة عكسها والتي تعتمد على البيئة والحد، والذي بدوره يغير من الطيف الإثارة من البروتين. MitGO-ATeam هو صدى نقل الطاقة فورستر (الحنق) التحقيق فيها الوحيدات ε من F o غير محصورة F 1-ATP سينسيز بين الحنق المانحة ومتقبل FLUOالبروتينات rescent. ملزمة للاعبي التنس المحترفين لنتائج الوحيدات ε في التغييرات التشكل في البروتين التي تجلب الحنق المانحة ومتقبل في القرب والسماح للصدى مضان نقل الطاقة من الجهة المانحة إلى متقبل.

Introduction

الميتوكوندريا هي عضيات ضرورية لإنتاج ATP، الحيوي من الأحماض الأمينية، والأحماض الدهنية، الهيم، الحديد كتل الكبريت والبريميدينات. الميتوكوندريا أيضا أن تلعب دورا محوريا في الكالسيوم، وتنظيم موت الخلايا المبرمج. 1 زيادة الروابط أدلة الميتوكوندريا إلى الشيخوخة، والمرتبط بالعمر الأمراض بما في ذلك مرض باركنسون ومرض الزهايمر والتصلب الوحشي الضموري، ومرض هنتنغتون. 2 بينما الأفراد يعيشون حياتهم كلها مع الطفرات في الميتوكوندريا البروتينات التي ترتبط مع أمراض الاعصاب، تحدث أعراض المرض في وقت لاحق فقط في الحياة. وهذا يدل على أن التغيرات تحدث في الميتوكوندريا مع التقدم في السن التي تسمح علم الأمراض في الظهور. في الواقع، يرتبط ارتباطا واللياقة البدنية الميتوكوندريا مع الصحة العامة الخلية وعمر في الخميرة وخلايا الثدييات. 3،4 هنا، نحن تصف كيفية استخدام ترميز وراثيا، أجهزة الاستشعار فلوري ratiometric لتقييم اثنين من الميزات الهامة من mitochondria في الخلايا الحية الخميرة: حالة الأكسدة ومستويات ATP.

راسخة وظيفة الميتوكوندريا في تعبئة الطاقة الهوائية. الدولة الأكسدة الميتوكوندريا هو نتاج للحد من والمؤكسدة الأنواع في عضية، بما في ذلك NAD + / NADH، FAD / القوات المسلحة الهايتية 2، NADP + / NADPH، الجلوتاثيون / الجلوتاثيون ثاني كبريتيد (GSH / GSSG) وأنواع الاكسجين التفاعلية (ROS). فك ربط الميتوكوندريا أو نقص الأكسجة يؤثر على نشاط الجهاز التنفسي الميتوكوندريا ويغير نسبة NAD + إلى NADH في عضية. ROS، التي يتم إنتاجها من نقل الإلكترون غير فعالة بين المجمعات من سلسلة نقل الإلكترون في غشاء الميتوكوندريا الداخلية، وكذلك من نزع الأمين الأمينات عبر أوكسيديز في غشاء الميتوكوندريا الخارجي 5، ضرر الدهون، والبروتينات، والأحماض النووية ولها تم ربط الشيخوخة وأمراض الاعصاب المرتبط بالعمر 6،7،8. ROS أيضا أن تلعب دورا في نقل الإشارة في مitochondria، من خلال أكسدة الجلوتاثيون. على سبيل المثال، NADH نازعة يساهم ليس فقط لإنتاج ROS ولكن أيضا وينظم من خلال التفاعل مع تجمع الجلوتاثيون 9،10. نازعة α-كيتوغلوتارات وأكونيتاز، مكونات دورة TCA، تظهر انخفاض النشاط في بيئات المؤكسدة 11،12.

في الواقع، يتم حفظها التنظيم التي تعتمد على الأكسدة والاختزال من النشاط أكونيتاز من البكتيريا إلى الثدييات 13،14. وبالتالي، رصد حالة الأكسدة ومستويات ATP من الميتوكوندريا أمر حاسم لفهم وظيفتها ودورها في علم الأمراض.

وقد استخدمت أساليب الكيمياء الحيوية لتقييم حالة الأكسدة أو مستويات ATP من الخلايا بأكملها أو عزل الميتوكوندريا. والأساليب المستخدمة على نطاق واسع لتقييم حالة الأكسدة من الخلايا بأكملها أو بناء معزول الميتوكوندريا على قياس مستويات الزوج الأكسدة GSH / GSSG 15. يتم استخدام نظام وسيفيرين-وسيفيراز عادة لقياس الميتوكوندريامستويات ATP في الخلايا إما كاملة أو permeabilized معزولة الميتوكوندريا. 16،17،18،19،20 في هذا الاختبار، وسيفيراز بربط ATP ويحفز أكسدة والتوهج من وسيفيرين 21 لشدة الضوء المنبعث يتناسب مع كمية من ATP في خليط التفاعل. 22

وقد كشفت هذه الأساليب المعلومات الأساسية بشأن وظيفة الميتوكوندريا، بما في ذلك وجدت أن المرضى الذين يعانون من الأمراض العصبية، مثل مرض الزهايمر، لديهم انخفاض غير عادي في مستويات ATP. 23 ومع ذلك، فإنها لا يمكن أن تستخدم لصورة حية، خلايا سليمة. وعلاوة على ذلك، على أساس أساليب تحليل كامل الخلية توفير ما معدله حالة الأكسدة أو مستويات ATP في جميع مقصورات للخلية. القياسات في العضيات معزولة يمكن أن تكون إشكالية لأن الدولة الأكسدة الميتوكوندريا أو مستويات ATP قد تتغير خلال تجزيء التحت خلوية. وأخيرا، فإن الدراسات الحديثة من مختبرنا وغيرها تشير إلى أنالميتوكوندريا في الخلايا الفردية غير متجانسة في وظيفة، وهذا بدوره يؤثر على عمر الخلايا الأم وابنتها. 3 وهكذا، هناك حاجة لقياس مستويات ATP الميتوكوندريا والدولة الأكسدة والاختزال في الخلايا الحية لقرار التحت خلوية.

وأجهزة الاستشعار من أجل وظيفة الميتوكوندريا وصفها هنا على حد سواء على أساس GFP. GFP حساسة الأكسدة (roGFP) 24،25 هو البديل GFP تضاف فيها cysteines المعرضة لسطح الجزيء. roGFP، مثل البرية من نوع GFP، واثنين من قمم الإثارة (في ~ 400 نانومتر و 480 نانومتر ~) وذروة الانبعاثات واحد في ~ 510 نانومتر. أكسدة بقايا السيستين في نتائج roGFP في زيادة الإثارة في 400 نانومتر ~. الحد من تلك cysteines تفضل الإثارة في 480 نانومتر ~. وهكذا، فإن نسبة الانبعاثات من 510 نانومتر على إثارة roGFP في 480 نانومتر و 400 نانومتر يكشف عن مبلغ قريب من خفض وتتأكسد roGFP، الذي يعكس حالة الأكسدة بيئة fluorophore لل.

اثنين من قيود التصدير الطوعيةوتستخدم على نطاق واسع من الأيونات roGFP: roGFP1 وroGFP2. كلاهما يحتوي على نفس الإدراج السيستين. ويستند roGFP1 على النوع البري GFP، ويستند roGFP2 على S65T GFP، التي لديها الإثارة أكثر كفاءة في 480 نانومتر والإثارة أقل كفاءة في 400 نانومتر مقارنة wtGFP 24. roGFP1 هو أقل درجة الحموضة حساسية من roGFP2 ومجموعة ديناميكية تمتد الى مزيد من نطاق مخفض. وبالتالي، قد يكون أكثر فائدة roGFP1 لرصد أكثر الحد من المقصورات مثل الميتوكوندريا أو العصارة الخلوية، ومقصورات درجة الحموضة مع المتغير، مثل الإندوسومات. يقدم roGFP2 إشارة أكثر إشراقا، وفي بعض الدراسات، مجموعة ديناميكية أكبر من roGFP1 24،26. وتشير الدراسات في thaliana نبات الأرابيدوبسيس أن الوقت اللازم للاستجابة للتغيرات في حالة الأكسدة مشابه لكلا أجهزة الاستشعار (T ½ لأكسدة و 65 و 95 ثانية و t ½ للحد من، 272 و 206 ثانية، لroGFP1 وroGFP2، على التوالي). 26

MitGO-ATeam2 هو الغازية الحد الأدنى، يمكن الاعتماد عليهاأجهزة الاستشعار التي تقيس الميتوكوندريا ATP في خميرة خميرة الخباز في مهدها. GO-ATeam هو صدى نقل الطاقة فورستر (الحنق) التحقيق التي تتكون من الوحيدات ε من F س F 1-ATP سينسيز تقع بين الحنق المانحة والبروتينات الفلورية متقبل (GFP والبرتقالي بروتين فلوري (OFP)، على التوالي). 27 ملزمة للاعبي التنس المحترفين لنتائج الوحيدات ε في التغييرات متعلق بتكوين في البروتين التي تجلب الحنق المانحة في مقربة من متقبل والسماح لنقل الطاقة من المانحين لالمتقبلة. هناك نوعين مختلفين من GO-ATeam، GO-GO-ATeam1 وATeam2. GO-ATeam2 لها قابلية أعلى للMgATP من GO-ATeam1، مما يجعلها أكثر ملاءمة لقياس أقل عادة [ATP] في الميتوكوندريا مقارنة مع العصارة الخلوية. 27

لبحث حالة الأكسدة الميتوكوندريا، اقمنا بروتين الانصهار (ميتو-roGFP1)، ويتألف من roGFP1 تنصهر لتسلسل زعيم ATP9 علىوأعرب الثانية من القائم السنترومير (منخفض في عدد النسخ) تعبير البلازميد الخميرة تحت السيطرة من نازعة غليسيرألدهيد-3-الفوسفات قوية (GPD) المروج (p416GPD، Addgene). كنا roGFP1 للتحقيق في حالة الأكسدة من الميتوكوندريا في سياق الشيخوخة من طراز فطر خميرة الخباز. نجد أن roGFP1 يمكن الكشف عن التغييرات في حالة الأكسدة الميتوكوندريا التي تحدث أثناء الشيخوخة وردا على توافر المواد الغذائية ولكن ليس له تأثير ضار واضح على خلايا الخميرة. نحن أيضا نرى تقلب في ولاية الأكسدة من الميتوكوندريا في خلايا الخميرة الحية الفردية، وهو الاكتشاف الذي يؤكد على أهمية وجود جهاز الاستشعار البيولوجي مع القرار المكانية التحت خلوية.

MitGO-ATeam2 هو البديل من GO-ATeam2، والتي لديها تسلسل إشارة الميتوكوندريا من السيتوكروم أوكسيديز ج VIIIA الوحيدات إدراجها في محطة الأمينية من GO-ATeam2 27 نحن تعديل مسبار mitGO-ATeam2 (شريطة تتكرم من قبل المختبر من H. نوجي، معهد Oجمعة البحوث العلمية والصناعية، جامعة أوساكا، اليابان) لاستخدامها في الخميرة التي subcloning ذلك، عبر Xba1 ومواقع HindIII، في الخميرة التعبير ناقلات pAG415GPD-ccdB (Addgene، كامبريدج، MA، الولايات المتحدة الأمريكية)، وهو الاسعار المنخفضة للنسخة البلازميد يحتوي على التأسيسي GPD المروج قوية. عبرنا عن mitGO-ATeam2 في الخميرة في مهدها، وتجد، من خلال counterstaining مع الحمض النووي ملزم صبغ دابي، أنه يموضع حصرا لالميتوكوندريا، حيث أنه بمثابة مسبار فعالة لقياس التغيرات الفسيولوجية في مستويات ATP الميتوكوندريا.

roGFP وGO-ATeam على حد سواء المشفرة وراثيا. ونتيجة لذلك، فإنها يمكن إدخال وصيانة ثابت في خلايا سليمة، وتقديم معلومات عن حالة الأكسدة أو مستويات ATP في الفردية، الخلايا الحية. وعلاوة على ذلك، على حد سواء أجهزة الاستشعار مراقبة التغيرات في حالة الأكسدة أو مستويات ATP التي تحدث في ظل الظروف الفسيولوجية 28 المركبتان هي أيضا ratiometric. ونتيجة لذلك، لا تتأثر القياسات التي أجريت مع هذه التحقيقات من قبل تشاnges في تركيز جهاز الاستشعار البيولوجي أو عينة إضاءة أو سمك. وأخيرا، تقديم كل من أجهزة الاستشعار القرار المكانية التحت خلوية. وبالفعل، فقد تم استهداف roGFP إلى الميتوكوندريا، ER، الإندوسومات وperoxisomes 24، ويمكن الكشف عن التغييرات في حالة الأكسدة لكل من هذه العضيات، مستقلة إلى حد كبير من الحموضة.

Protocol

1. التحول من خلايا الخميرة مع أجهزة الاستشعار

  1. تحويل سلالة الخميرة المطلوب مع البلازميد تحمل ميتو-roGFP أو mitGO-ATeam2 باستخدام طريقة خلات ليثيوم 27.
  2. لتأكيد التحول مع جهاز الاستشعار البيولوجي التي تنقلها البلازميد ومنع فقدان البلازميد، حدد والحفاظ على transformants المتوسطة كاملة الاصطناعية انتقائية مناسبة (SC-أورا لميتو-roGFP، أو SC-LEU لmitGo-ATeam2). إذا كان قد تم subcloned التحقيق الفلورسنت في البلازميد تختلف عن تلك الموصوفة هنا، استخدم وسيلة انتقائية المناسبة. تصور transformants بواسطة المجهر مضان للتأكد من أنها تعبر عن جهاز الاستشعار البيولوجي الفلورسنت ويحمل مورفولوجيا الميتوكوندريا العادي.

2. نمو الخلايا والتحضير للتصوير

وظيفة الخلية والاستجابة للعلاج بالعقاقير تعتمد اعتمادا كبيرا على كثافة الخلية والنشاط الأيضي. ويتم الحصول على أفضل النتائج عندما الخلايايتم تقسيم بنشاط (مرحلة منتصف السجل، ~ 0،5-1 × 10 7 خلية / مل). الطريقة الأكثر موثوقية لتوليد منتصف سجل الثقافات المرحلة من كثافة الثابت هو لتطعيم ثابتة من مراحل ما قبل الثقافة.

  1. تعد ثابتة مراحل ما قبل الثقافة: اختيار مستعمرة واحدة من الخلايا تحولت من لوحة وسائل الإعلام تطعيم السائل انتقائية (5 مل مل في أنبوب مخروطي القاع 50). ينمو بمعدل 30 درجة مئوية مع اهتزاز عند 225 دورة في الدقيقة حتى وصلت الكثافة البصرية للثقافة في 600 نانومتر (OD 600) هضبة (24-48 ساعة).
  2. تعد ثقافة مرحلة منتصف السجل للمراقبة: استخدام حجم مناسب من قبل الثقافة لتطعيم 5 مل من وسائل الاعلام انتقائية في أنبوب 50 مل المخروطية القاع. وسائل الاعلام YPD هو autofluorescent وينبغي ألا تستخدم لهذه الدراسات. استخدام كاملة، استنادا الجلوكوز، التسرب (SC-أورا) وسائل الاعلام الاصطناعية. تنمو الخلايا عند 30 درجة مئوية، والهز في 225 دورة في الدقيقة، ل4-16 ساعة، حتى تصل إلى مرحلة منتصف السجل (~ 0،5-1 × 10 7 خلية / مل). كثافة الخلية يمكن تحديدعن طريق قياس OD 600؛ معايرة مقياس الطيف لتحديد الصحيح OD 600 القراءة. على موقعنا على بيكمان DU530 (بيكمان كولتر، إنديانابوليس، IN)، مرحلة منتصف السجل يتوافق مع OD 600 من 0.1-0.3.

ميتو-roGFP1 الحواس التقلبات في عضية في استجابة للتغيرات أيضية. على سبيل المثال، في هذا الاختبار الميتوكوندريا تتغير حالة الأكسدة عندما الخميرة تنمو على مصادر الكربون تخمر (مثل الجلوكوز، كما هو الحال في وسائل الإعلام SC) مقابل مصادر الكربون غير قابل للتخمر (مثل الجلسرين، كما هو الحال في وسائل الإعلام SGlyc)، وحتى في دفعات مختلفة من نفس وسائل الاعلام. ولذلك، استخدام نفس دفعة من وسائل الإعلام لجميع التجارب.

  1. الخلايا جاهزة للتركيز (انظر الخطوة 2.4) والتصوير إذا يتم تنفيذ أي علاج. إذا كنت تعالج الخلايا، واحتضان الخلايا مع العلاج المناسب والمتابعة إلى الخطوة التالية.
  2. التركيز 1 مل من الثقافة بواسطة الطرد المركزي في 6،000 x ج لمدة 15 ثانية وإعادة تعليق من بيليه الخلية في 20 ميكرولتر من وسائل الإعلام. هذه الظروف زيادة عدد خلايا مميزة في مجال الرؤية.
  3. تطبيق 2 ميكرولتر من الخلايا معلق على شريحة. تغطية مع ساترة (رقم 1.5، ويفضل عالية الأداء 170 ± 5 ميكرون سمك)، وختم حواف ساترة مع طلاء الأظافر واضح أو valap (انظر الكواشف). لختم مع valap، تذوب كمية صغيرة على ملعقة معدنية بوضعها فوق لهب الموقد بنسن، ثم انتشرت كمية صغيرة على طول حواف ساترة.
  4. الحفاظ على الخلايا عند 30 درجة مئوية خلال التصوير. سخان الهدف على العدسة الغمر النفط 100X المستخدمة في التصوير يعمل بشكل جيد لهذا التطبيق. في ظل هذه الظروف، مورفولوجيا الميتوكوندريا، دولة الأكسدة ومستويات ATP تبقى على حالها خلال التصوير لمدة 10-15 دقيقة.

3. الإعداد التصوير

  1. الإعداد للتصوير ميتو-roGFP1 على المجهر مضان واسعة المجال
    مصممة الخطوات هنا إلى AxioObserver.Z1 المجهر مجهزة كوليبري LED مصدر الإثارة، وهو أوركا ER الكاميرا واسعة المجال وAxiovision البرمجيات الاستحواذ. يتم تقليل Photobleaching من كل القنوات وphotoconversion من أكسدة ميتو-roGFP1 بشكل كبير باستخدام الإضاءة LED مقارنة الزئبق قوس مصباح الإضاءة (انظر أدناه).
    لتعظيم إشارة والقرار، واستخدام أعلى الفتحة العددية ممكن في الهدف، وأقل التكبير التي توفر دقة مكانية كافية. وبالإضافة إلى ذلك، لميتو-roGFP التصوير، والتحقق من أن الهدف ينقل جيدا في 365 نانومتر. و100x/1.3NA EC PlanNeofluar الهدف (زايس) يعمل بشكل جيد لهذا التطبيق.
    تكوين برنامج اكتساب لالتقاط الأنواع ميتو-roGFP1 تتأكسد وتخفيضها. نحن نستخدم الشروط التالية.
    1. تكوين قناة للأكسدة ميتو-roGFP لاستخدام الإثارة في 365 نانومتر (100٪ من الطاقة LED) وعامل تصفية الانبعاثات مناسبة لGFP، مثل 38 معالي تحديد مجموعة (زايس)، مع excitatio شملتن مرشح إزالتها من المكعب. إزالة عامل التصفية الإثارة يسمح الإثارة في كل 365 نانومتر و 470 نانومتر دون الحاجة للتبديل المرشحات، وبالتالي زيادة وقت القرار للتحقيق.
    2. تكوين قناة لخفض ميتو-roGFP لاستخدام الإثارة في 470 نانومتر (100٪ من الطاقة LED) و، على النحو المذكور أعلاه، نفس الانبعاثات مكعب مرشح يستخدم لأكسدة ميتو-roGFP. ضبط الكاميرا ل1X1 binning لتحسين القرار المكانية.
    3. إعداد برنامج للحصول على كومة من الألف إلى الياء تتألف من 11 شرائح مع تباعد 0.5 ميكرون، وجمع كل القنوات في كل موقف Z. هذا النمط من اكتساب أبطأ من الحصول على كل كومة Z بدوره، لكنه يمنع التحف الناشئة عن حركة الميتوكوندريا بين الاستحواذ على قنوات تتأكسد وتخفيضها.
    4. صورة عدة خلايا لتحديد وقت التعرض المناسبة، وتنتج إشارة تشبع قوي ولكن لا. فمن المهم للحفاظ على نسبة مرات التعرض للأكسدة وخفض ميتو-roGFP1 للجميع التجربةق. على سبيل المثال، يجب أن يكون إذا كان مرات التعرض للأكسدة وخفض ميتو-roGFP1 هي 300 و 100 ميللي ثانية، على التوالي، ثم في وقت التعرض للأكسدة ميتو-roGFP1 3 مرات لخفض ميتو-roGFP لجميع التجارب.
  2. الإعداد للتصوير mitGO-ATeam2 على المجهر متحد البؤر الطيفية
    لقياس مستويات ATP باستخدام mitGO-ATeam2، ومضان من GFP (انبعاث أقصى 510 نانومتر) يجب تمييزها عن أن من OFP (انبعاث أقصى 560 نانومتر). هناك مجموعات مرشح مضان أن حل مضان المنبعثة من هذه fluorophores. ومع ذلك، نجد أن جهاز كشف الطيفي، وهي متاحة في العديد من ليزر متحد البؤر المسح المجاهر، يعمل بشكل أفضل لهذا التطبيق. وكشف الطيفي يفصل الانبعاثات مضان في العديد من العناصر (عادة 32 أو أكثر) تبعا لطول الموجة. ويمكن الجمع بين عدة نطاقات الطول الموجي المجاورة في قناة صورة واحدة. يتم اختيار الأطوال الموجية ليتم ضمه تجريبيا وذلك لتعظيم إشارة من GFP وOFP مع تجنب عبور الإشارة التي من شأنها أن يتغلب على الحنق القياس. استخدام أعلى عدسة الفتحة العددية المتاحة. ونحن نستخدم 100x/1.49 أو 60x/1.49 عدسة APO-TIRF. نحن نستخدم نيكون المجهر متحد البؤر A1R تشغيل شيكل عناصر البرنامج. تكوين برنامج اكتساب لالتقاط الأنواع mitGO-ATeam2 ATP محدد وATP-غير منضم. نحن نستخدم الشروط التالية.
    1. تعيين الثقب إلى 1.0 وحدات إيري (AU)، والتي على نظامنا يتوافق مع قرار من الألف إلى الياء من حوالي 0.42 ميكرون.
    2. ضبط التكبير المسح إلى الاقتراب من الحد أخذ العينات نيكويست، والتي سوف تحقيق أقصى قدر من المعلومات المكانية في الصورة. على نظامنا حجم بكسل 0.12 ميكرون.
    3. لأن الميتوكوندريا قد تتحرك أثناء التصوير، يمكن أن يكون مفيدا لزيادة سرعة التصوير من قبل الاقتصاص الحقل إلى 512 X 256 بكسل. إجمالي الوقت اللازم لصورة إطار واحد في نظامنا هو 1.0 ثانية، بما في ذلك المسح الضوئي متوسط ​​2 أضعاف. اعتمادا على القرار المكانية المطلوب، هذا المجال يمكن أن يكون أبعد اقتصاص إلى الزيادهه وقت القرار.
    4. تثير في 488 نانومتر، وجمع الانبعاثات 500-520 نانومتر ل GFP، و550-580 نانومتر لOFP. قد تختلف القيم المثلى الفعلية مع خصائص نظام التصوير.
    5. قوة الليزر الأمثل لنظامنا هو بين 6.0 و 6.4٪. سوف قوة الليزر الأمثل تختلف عن كل نظام المجهر، ولكن لن تكون في أدنى مستوى ممكن من الناحية المثالية في حين لا تزال تنتج صورة للتفسير. استخدام السلطة متر داخلي أو خارجي لرصد التغيرات في قوة الليزر، والتي تحدث عادة مع مرور الوقت في أي نظام بصري.
    6. ضبط كاشف الربح وشدة الضوء إضاءة لتعظيم نطاق الكشف عن القيم بكسل ولكن تجنب إغراق إشارة، لأنه كما العديد من الخلايا ممكن. لا نحلل أي الخلايا التي تحتوي على أكثر من 1٪ بكسل المشبعة. صورة جميع العينات باستخدام نفس الهدف، قوة الليزر والمسح الضوئي والتكبير، وحجم بكسل، وزيادة، والإزاحة.

4. الحصول على الصور

  1. تحديد موقع جيش التحرير الشعبى الصينى التنسيق شمال شرق من خلايا ذات الاهتمام باستخدام الضوء المرسل لتقليل تبيض التحقيق الفلورسنت.
  2. بعد تحديد موقع واحد أو أكثر من الخلايا في المصالح، جمع Z-سلسلة من خلال عمق كاملة من خلية نموذجي (حوالي 7 ميكرون) باستخدام حجم الخطوة من 0.5 ميكرون.
  3. صورة خلايا أخرى من الفائدة على الشريحة، ولكن لا صورة شريحة واحدة لمدة أطول من 15 دقيقة. بعد 15 دقيقة على الشريحة، تفقد الخلايا قدرتها على البقاء.

5. تحليل

يتم تحديد مستوى الميتوكوندريا ATP عن طريق قياس نسبة الانبعاثات mitGO-ATeam2 في 560 نانومتر إلى أنه في 510 نانومتر 27 يتم قياس حالة الأكسدة من عضية كما خفضت إلى المؤكسد (R / O) نسبة ميتو-roGFP؛ أي الانبعاثات في 510 نانومتر على الإثارة في 470 نانومتر مقسوما على الانبعاثات في 510 نانومتر على الإثارة في 365 نانومتر. قبل احتساب النسبة، طرحنا الخلفية وتحديد قيمة الحد الأدنى لبكسل ينتمون إلى الميتوكوندريا الفلورسنت.

خيمة "> الملك العام (على سبيل المثال يماغيج 30) أو المتاحة تجاريا (مثل Volocity، بيركن، إلمر) يمكن استخدام البرنامج لتحليل ميتو-roGFP1 أو mitGO-ATeam2. اعتمادا على البرمجيات المستخدمة في الحصول على الصور والتحليل، والصور قد تحتاج أولا إلى تحويلها إلى تنسيق آخر، مثل TIFF، قبل فتحها في برامج التحليل. إذا يتم تحويل الصور، فمن الضروري للتحقق من أن القيم بكسل لا تتغير أثناء عملية التحويل. تحليل ميتو-roGFP1 البيانات، وذلك باستخدام يوصف كلا البرنامجين أدناه. ويسلط الضوء على قوائم البرامج والخيارات لتحديد القائمة داخل كل بالخط المائل والعريض.

5.1 تحليل يماغيج

  1. فتح الصور ونوع التغيير إلى 32 بت: صورة → → نوع 32 بت.
  2. رسم المنطقة ذات الاهتمام (ROI) في منطقة لا توجد فيها الخلايا. حساب شدة يعني في هذا ROI: تحليل → التدبير.
  3. طرح متوسط ​​خلفية تحسب من المكدس: عملية → → الرياضيات طرح.
  4. باستخدام طرح ض المكدس، والعثور على شريحة الأوسط وعتبة على الميتوكوندريا: صورة → → ضبط عتبة ثم انقر فوق تطبيق على النافذة عتبة. تنطبق على جميع الشرائح في المكدس. تحقق مجموعة بكسل الخلفية في نان.
  5. إنشاء نسبة Z المكدس: عملية → الحاسبة صورة تقسيم المكدس مخفضة من قبل ض المكدس تتأكسد لتحليل ميتو-roGFP1. تقسيم 560 نانومتر (ATP منضم) صورة من قبل 510 نانومتر (ATP غير منضم) صورة للتحليل mitGO-ATeam2.
  6. رسم ROI في جميع أنحاء المنطقة من الفائدة. اختر تحليل → → أدوات ROI مدير، وانقر فوق إضافة لتسجيل العائد على الاستثمار. قد تكون مخزنة في مناطق متعددة المدير. في إدارة العائد على الاستثمار، حدد كافة رويس، ثم اختيار Mخام → متعدد قياس لقياس جميع شرائح المكدس. تصدير البيانات إلى جدول بيانات للتحليل.

5.2 تحليل Volocity

  1. استيراد الصور إلى مكتبة Volocity وخلق تسلسل الصور مع 2 القنوات.
  2. رسم المنطقة ذات الاهتمام (ROI) في منطقة لا توجد فيها الخلايا. اختر: أدوات → النسبة.
  3. استخدام Volocity لحساب خلفية: الحصول من عائدات الاستثمار.
  4. ضبط عتبة لتشمل هياكل الميتوكوندريا.
  5. التحقق من الخيار لتطبيق طرفية قوس قزح لقناة النسبة. قناة كثافة التضمين قد تنتج صورة أقل صاخبة لعرضا للحالة، ولكن لا ينبغي أن تستخدم لتحديد الكميات من متوسط ​​النسبة.
  6. حدد علامة التبويب القياس، حدد القناة ونسبة رسم ROI في جميع أنحاء المنطقة من الفائدة. قياس نسبة قناة، باستثناء القيم صفر. يمكن اختيار مناطق متعددة وقياسفي نفس الوقت. تصدير البيانات إلى جدول بيانات للتحليل.

النتائج

قياس حالة الأكسدة الميتوكوندريا مع ميتو-roGFP

هنا، وتبين لنا أن ميتو-roGFP1 لديه مجموعة ديناميكية للكشف عن تغيرات في حالة الأكسدة الميتوكوندريا من تتأكسد تماما إلى انخفاض في الخلايا الحية الخميرة، دون أن يؤثر نمو الخلايا الخميرة أو ال?...

Discussion

هنا، نحن تصف أساليب لاستخدام ميتو-roGFP1 وmitGO-ATeam2 كما أجهزة الاستشعار لتقييم الميتوكوندريا الدولة الأكسدة ومستويات ATP في الخلايا الحية الخميرة. نجد أن التعبير التي تنقلها البلازميد ميتو-roGFP1 أو mitGO-ATeam النتائج في كمية استهداف الميتوكوندريا، دون أي تأثير واضح على التشكل ا...

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل من قبل جوائز من HHMI 56006760 لJDV، والمعاهد الوطنية للصحة (NIH) (2 TL1 RR 24158-6) إلى DMAW، وعن المؤسسة الطبية إليسون (AG-SS-2465)، والمعاهد الوطنية للصحة (GM45735، GM45735S1 وGM096445) ليرة لبنانية. صدر GM45735S1 من المعاهد الوطنية للصحة تحت الأميركي لإنعاش الاقتصاد وإعادة الاستثمار قانون عام 2009. وقد أيد المجاهر المستخدمة في هذه الدراسات جزئيا من خلال منحة المعاهد الوطنية للصحة / NCI (5 P30 CA13696).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
 Reagents
Antimycin ASigma-Aldrich (St. Louis, MO)1397-94-0Dissolved in ethanol to a 2 mg/ml stock solution.
SGlyc (synthetic glycerol-based) yeast growth medium *omit for SGlyc-Ura
**omit for SGlyc-Leu		Dissolve in H2O. Adjust pH to 5.5 with NaHCO3. Autoclave.

Ingredients:
0.67% Yeast nitrogen base without amino acids
3% Glycerol
0.05% Glucose
2 mg/ml adenine
2 mg/ml uracil*
1 mg/ml L-arginine
1 mg/ml L-histidine
1 mg/ml L-leucine**
3 mg/ml L-lysine
2 mg/ml L-methionine
4 mg/ml L-phenylalanine
2 mg/ml L-tryptophan
3 mg/ml L-tyrosine
SC (synthetic complete, glucose-based) yeast growth medium *omit for SGlyc-Ura
**omit for SGlyc-Leu		Dissolve in H2O. Adjust pH to 5.5 with NaHCO3. Autoclave. Ingredients:
0.67% Yeast nitrogen base without amino acids
3% Glucose
2 mg/ml adenine
2 mg/ml uracil*
1 mg/ml L-arginine
1 mg/ml L-histidine
1 mg/ml L-leucine**
3 mg/ml L-lysine
2 mg/ml L-methionine
4 mg/ml L-phenylalanine
2 mg/ml L-tryptophan
3 mg/ml L-tyrosine
ValapCombine ingredients in a 1:1:1 (w:w:w) ratio. Melt by submerging in a 70 °C H2O bath. Aliquot into glass petri dishes. Store at room temperature. Ingredients:
Vaseline petroleum jelly, hard paraffin, lanolin
 Equipment and Software
Precleaned Gold Seal Rite-on Micro SlidesThomas Scientific (Swedesboro, NJ)3050Size: 25 x 75 mm; Thickness: 0.93 to 1.05 mm
High-performance coverslips, No. 1.5, 18x18 mmZeiss (Thornwood, NY)474030-9000-000These are less variable in thickness (170±5 μm) than standard coverslips, reducing spherical aberration and improving 3D imaging performance
Fisherbrand Microscope Cover Glass, No. 1.5Fisher Scientific (Pittsburgh, PA)12-545ESize: 22 x 22 mm, No. 1.5 thickness (170 μm)
A1 laser scanning confocal microscope with spectral detector and 100x/1.49 NA Apo-TIRF objectiveNikon (Melville, NY) 
AxioObserver.Z1 microscope equipped with a 100x/1.3NA EC Plan-Neofluar objective (Zeiss) and Orca ER cooled CCD camera (Hamamatsu) and controlled by Axiovision softwareZeiss (Thornwood, NY); Hamamatsu (Hamamatsu City, Japan) 
Volocity 3D Image Analysis softwarePerkin Elmer (Waltham, MA)Restoration module for deconvolution; Quantitation module for ratio calculation and measurement
ImageJ softwareNational Institutes of Health (Bethesda, MD)http://rsb.info.nih.gov/ij/

References

  1. Rizzuto, R., De Stefani, D., Raffaello, A., Mammucari, C. Mitochondria as sensors and regulators of calcium signalling. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 13 (9), 566-578 (2012).
  2. Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: in sickness and in health. Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).
  3. McFaline-Figueroa, J. R., Vevea, J., et al. Mitochondrial quality control during inheritance is associated with lifespan and mother-daughter age asymmetry in budding yeast. Aging Cell. 10 (5), 885-895 (2011).
  4. Hamilton, M. L., Van Remmen, H., et al. Does oxidative damage to DNA increase with age. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 10469-10474 (2001).
  5. Cadenas, E., Davies, K. J. Mitochondrial free radical generation, oxidative stress, and aging. Free Radical Biology & Medicine. 29 (3-4), 222 (2000).
  6. Mammucari, C., Rizzuto, R. Signaling pathways in mitochondrial dysfunction and aging. Mechanisms of Ageing and Development. 131 (7-8), 536-543 (2010).
  7. Lin, M. T., Beal, M. F. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases. Nature. 443 (7113), 787-795 (2006).
  8. Schon, E. A., Przedborski, S. Mitochondria: the next (neurode)generation. Neuron. 70 (6), 1033-1053 (2011).
  9. Taylor, E. R., Hurrell, F., Shannon, R. J., Lin, T. -. K., Hirst, J., Murphy, M. P. Reversible glutathionylation of complex I increases mitochondrial superoxide formation. The Journal of Biological Chemistry. 278 (22), 19603-19610 (2003).
  10. Beer, S. M., Taylor, E. R., et al. Glutaredoxin 2 catalyzes the reversible oxidation and glutathionylation of mitochondrial membrane thiol proteins: implications for mitochondrial redox regulation and antioxidant defense. The Journal of Biological Chemistry. 279 (46), 47939-47951 (2004).
  11. Tretter, L., Adam-Vizi, V. Inhibition of Krebs cycle enzymes by hydrogen peroxide: A key role of [alpha]-ketoglutarate dehydrogenase in limiting NADH production under oxidative stress. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 20 (24), 8972-899 (2000).
  12. Nulton-Persson, A. C., Szweda, L. I. Modulation of mitochondrial function by hydrogen peroxide. The Journal of Biological Chemistry. 276 (26), 23357-23361 (2001).
  13. Gardner, P. R., Fridovich, I. Effect of glutathione on aconitase in Escherichia coli. Archives of Biochemistry and Biophysics. 301 (1), 98-102 (1993).
  14. Gardner, P. R., Raineri, I., Epstein, L. B., White, C. W. Superoxide radical and iron modulate aconitase activity in mammalian cells. The Journal of Biological Chemistry. 270 (22), 13399-13405 (1995).
  15. Schafer, F., Buettner, G. Redox environment of the cell as viewed through the redox state of the glutathione disulfide/glutathione couple. Free Radical Biology and Medicine. 30 (11), 1191-1212 (2001).
  16. Maechler, P., Wang, H., Wolheim, C. B. Continuous monitoring of ATP levels in living insulin secreting cells expressing cytosolic firefly luciferase. FEBS Lett. 422, 328-332 (1998).
  17. Ouhabi, R., Boue-Grabot, M., Mazat, J. P. Mitochondrial ATP synthesis in permeabilized cells: Assessment of the ATP/O values in situ. Anal. Biochem. 263, 169-175 (1998).
  18. Strehler, B. L., Totter, J. R. Firefly luminescence in the study of energy transfer mechanism in substrates and enzymes determinations. Arch. Biochem. Biophys. 40, 28-41 (1952).
  19. Lemasters, J. J., Backenbrock, C. R. Adenosine triphosphate: Continuous measurement in mitochondrial suspension by firefly luciferase luminescence. Biochem. Biophys. Res. Commun. 55, 1262-1270 (1973).
  20. Wibom, R., Lundin, A., Hultman, E. A sensitive method for measuring ATP formation in rat muscle mitochondria. Scand. J. Clin. Lab. Invest. 50, 143-152 (1990).
  21. Manfredi, G., Spinazzola, A., Checcarelli, N., Naini, A., Pon, L. A., Schon, E. A. Assay of Mitochondrial ATP Synthesis in Animal Cells. Methods in Cell Biology, Mitochondria. 65, 133-145 (2001).
  22. DeLuca, M. Firefly luciferase. Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. 44, 37-68 (1976).
  23. Atamna, H., Frey, W. H. Mechanisms of mitochondrial dysfunction and energy deficiency in Alzheimer's disease. Mitochondrion. 7, 297-310 (2007).
  24. Hanson, G. T., Aggeler, R., et al. Investigating mitochondrial redox potential with redox-sensitive green fluorescent protein indicators. J. Biol. Chem. 279 (13), 13044-13053 (2004).
  25. Dooley, C. T., Dore, T. M., Hanson, G. T., Jackson, W. C., Remington, S. J., Tsien, R. Y. Imaging dynamic redox changes in mammalian cells with green fluorescent protein indicators. J. Biol. Chem. 279 (21), 22284-22293 (2004).
  26. Schwarzländer, M., Fricker, M. D., et al. Confocal imaging of glutathione redox potential in living plant cells. Journal of Microscopy. 231 (2), 299-316 (2008).
  27. Nakano, M., Imamura, H., Nagai, T., Noji, H. Ca2+ regulation of mitochondrial ATP synthesis visualized at the single cell level. ACS Chem Biol. 6 (7), 709-715 (2011).
  28. Berg, J., Hung, Y. P., Yellen, G. A genetically encoded fluorescent reporter of ATP:ADP Ratio. Nature Methods. 6 (2), 161-166 (2009).
  29. Gietz, R. D., Woods, R. A. Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method. Methods in Enzymology. 350, 87-96 (2002).
  30. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9, 671-675 (2012).
  31. Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells. Science (New York, N.Y.). 297 (5588), 1873-1877 (2002).
  32. Dairaku, N., Kato, K., et al. Oligomycin and antimycin A prevent nitric oxide-induced apoptosis by blocking cytochrome c leakage. J. Lab. Clin. Med. 143 (3), 141-153 (2004).
  33. Cannon, M. B., Remington, S. J. Re-engineering redox-sensitive green fluorescent protein for improved response rate. Protein Sci. , 45-57 (2006).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

77 roGFP GO ATeam ATP ROS GFP

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved