Ratiometric Biosensors, dass die mitochondriale Redox Staats-und ATP in lebenden Hefezellen Messen

Zusammenfassung

Wir beschreiben die Verwendung von zwei ratiometrischen, genetisch kodierte Biosensoren, die auf GFP basieren, zu mitochondrialen Redox-Zustand und ATP-Spiegel in subzellulären Auflösung in lebenden Hefezellen überwachen.

Zusammenfassung

Mitochondrien haben Rollen in vielen zellulären Prozessen, von Energiestoffwechsel und Calcium-Homöostase auf zellulärer Lebensdauer und den programmierten Zelltod steuern. Diese Vorgänge beeinflussen und werden durch die Redox-Status und die ATP-Produktion durch Mitochondrien beeinträchtigt. Hier beschreiben wir die Verwendung von zwei ratiometrischen, genetisch kodierte Biosensoren, die mitochondrialen Redox-Zustand und ATP-Spiegel in subzellulären Auflösung erkennen in lebenden Hefezellen können. Mitochondrialen Redox-Zustand wird unter Verwendung von Redox-sensitive Green Fluorescent Protein (roGFP), die an der mitochondrialen Matrix ausgerichtet ist. Mito-roGFP enthält Cysteine ​​an den Positionen 147 und 204 der GFP, die reversibel und umwelt-abhängige Oxidation und Reduktion, die wiederum verändern das Anregungsspektrum des Proteins unterzogen. MitGO-ATeam ist ein Förster-Resonanz-Energie-Transfer (FRET)-Sonde, in dem der ε-Untereinheit des F _o F _{1-ATP-Synthase} eingeklemmt zwischen FRET-Donor und Akzeptor fluozierenden Proteinen. Die Bindung von ATP an die ε-Untereinheit führt zu Konformationsänderungen im Protein, die bringen FRET-Donor und Akzeptor in unmittelbarer Nähe und ermöglichen Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer vom Spender zum Akzeptor.

Einleitung

Mitochondrien sind Organellen wichtig für die ATP-Produktion, Biosynthese von Aminosäuren, Fettsäuren, Häm, Eisen-Schwefel-Clustern und Pyrimidine. Mitochondrien spielen auch eine entscheidende Rolle bei Calcium-Homöostase, und in der Regulation der Apoptose. ¹ Zunehmende Anzeichen Links Mitochondrien Altern und altersbedingte Krankheiten wie Parkinson, Alzheimer, Amyotrophe Lateralsklerose und Huntington-Krankheit. ² Während Einzelpersonen ihr ganzes Leben leben Mutationen in mitochondrialer Proteine, die mit neurodegenerativen Erkrankungen assoziiert sind, treten die Krankheitssymptome erst im späteren Leben. Dies deutet darauf hin, dass Veränderungen in den Mitochondrien mit zunehmendem Alter, die Krankheit Pathologie entstehen lassen. Tatsächlich mitochondrialen Fitness mit insgesamt Zelle Gesundheit und Lebensdauer in Hefe-und Säugerzellen korreliert ist. ^3,4 Hier beschreiben wir, wie man genetisch kodierten, ratiometrischen Fluoreszenzbiosensoren verwenden, um zwei kritische Merkmale Mitoc beurteilenhondria in lebenden Hefezellen: Redox-Zustand und ATP-Spiegel.

Funktion der Mitochondrien bei der aeroben Energie Mobilisierung ist gut etabliert. Mitochondrialen Redox-Zustand ist ein Produkt der reduzierenden und oxidierenden Spezies in der Organelle, wie NAD ⁺ / NADH, FAD / FADH _2, NADP ⁺ / NADPH, Glutathion / Glutathion-disulfid (GSH / GSSG) und reaktive Sauerstoffspezies (ROS). Uncoupling Mitochondrien oder Hypoxie beeinflusst mitochondrialen Atmungskette Aktivität und verändert das Verhältnis von NAD ⁺ zu NADH in der Organellen. ROS, die durch ineffiziente Elektronentransfer zwischen Komplexe der Atmungskette in der inneren mitochondrialen Membran, sowie von der Desaminierung von Aminen über Monoaminoxidase in der äußeren mitochondrialen Membran ⁵ Schaden Lipide, Proteine ​​und Nukleinsäuren hergestellt werden und wurde zum Altern und altersbedingte neurodegenerative Erkrankungen ^6,7,8 verknüpft. ROS spielen auch eine Rolle bei der Signaltransduktion in mitochondria, durch Oxidation von GSH. Zum Beispiel, NADH-Dehydrogenase trägt nicht nur zur ROS-Produktion, sondern auch durch Wechselwirkungen mit der Glutathion-Pool ^9,10 geregelt. α-Ketoglutarat-Dehydrogenase und Aconitase, Komponenten des TCA-Zyklus, zeigen reduzierte Aktivität in oxidierenden Umgebungen ^11,12.

Tatsächlich ist Redox-abhängige Regulation der Aconitaseaktivität von Bakterien bis zu Säugetieren ^13,14 konserviert. So, die Überwachung der Redox-Zustand und ATP-Konzentrationen von Mitochondrien ist entscheidend für das Verständnis ihrer Funktion und Rolle in Pathologie.

Biochemische Methoden wurden verwendet, um das Redox-Zustand oder ATP-Spiegel von ganzen Zellen oder isolierten Mitochondrien beurteilen. Weit verbreitet Methoden, um die Redox-Zustand von ganzen Zellen oder beurteilen isolierten Mitochondrien sind auf der Messung der Werte des Redoxpaares GSH / GSSG ¹⁵ basiert. Das Luciferin-Luciferase-System wird häufig verwendet, um zu messen mitochondrialenATP-Spiegel entweder in permeabilisierten ganzen Zellen oder isolierten Mitochondrien. ^{16,17,18,19,20} In diesem Assay bindet Luciferase und ATP katalysiert die Oxidation von Luciferin und Chemilumineszenz. ²¹ die Intensität des emittierten Lichts ist proportional zu der Menge von ATP in der Reaktionsmischung. ²²

Diese Methoden wurden grundlegende Informationen zur mitochondrialen Funktion, einschließlich der Feststellung, dass Patienten mit neurodegenerativen Erkrankungen, wie Alzheimer-Krankheit, abnormal niedrigen ATP-Spiegel haben gezeigt. ²³ sie jedoch nicht verwendet werden, um Aufnahmen von lebenden, intakten Zellen werden. Darüber hinaus bieten Methoden Ganzzell-Analyse einen Durchschnitt von Redox-Zustand oder ATP-Spiegel in allen Kammern der Zelle. Messungen in isolierten Organellen sind potentiell problematisch, weil mitochondrialen Redox-Zustand oder ATP-Spiegel während der subzellulären Fraktionierung ändern kann. Schließlich zeigen neuere Studien aus unserem Labor und andere, dieMitochondrien innerhalb der einzelnen Zellen sind in ihrer Funktion heterogen, was sich wiederum auf die Lebensdauer von Mutter und Tochter-Zellen. ³ So gibt es eine Notwendigkeit, mitochondriale ATP-Spiegel und Redox-Status in lebenden Zellen mit subzellulären Auflösung zu messen.

Die Biosensoren für die Funktion der Mitochondrien hier beschrieben werden sowohl auf Basis von GFP. Redox-sensitive GFP (roGFP) ^24,25 ist eine GFP-Variante, in der Oberflächen-exponierten Cysteine ​​an das Molekül angefügt werden. roGFP wie Wildtyp-GFP, zwei Anregung Peaks (bei ~ 400 nm und ~ 480 nm) und ein Emissionsmaximum bei ca. 510 nm liegt. Oxidation der Cysteinreste in roGFP führt zu einer Erhöhung der Erregung bei ~ 400 nm. Reduction dieser Cysteine ​​begünstigt Anregung bei ~ 480 nm. Somit zeigt das Verhältnis von 510 nm Emission bei Anregung roGFP bei 480 nm und 400 nm die relative Menge von reduziertem und oxidiertem roGFP, die die Redox-Zustand des Fluorophors der Umgebung reflektiert.

Zwei versIonen roGFP sind weit verbreitet: roGFP1 und roGFP2. Sowohl die gleichen Cystein Insertionen. roGFP1 auf Wildtyp-GFP und roGFP2 basierend auf S65T-GFP, die eine effizientere Anregung bei 480 nm hat und weniger effiziente Anregung bei 400 nm im Vergleich zu wtGFP ²⁴ basiert. roGFP1 ist weniger empfindlich als pH roGFP2 und seine Dynamikbereich erstreckt sich weiter in die reduzierte Reichweite. So kann roGFP1 mehr nützlich für die Überwachung stärker reduzierenden Kompartimente wie Mitochondrien oder das Cytosol und Fächer mit variablen pH-Wert, wie Endosomen. roGFP2 bietet heller Signal und, in einigen Studien eine größere Dynamik als roGFP1 ^24,26. Studies in Arabidopsis thaliana zeigen, dass die Zeit für das Ansprechen auf Änderungen in Redox-Zustand erforderlich ist ähnlich für beide Sensoren (t ½ für die Oxidation, 65 und 95 sec und t ½ für die Reduktion, 272 und 206 sec für roGFP1 und roGFP2 bezeichnet) ist. ²⁶

MitGO-ATeam2 ist eine minimal-invasive, sichereSensor, der mitochondrialen ATP-Maßnahmen in der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae. GO-ATeam ist ein Förster-Resonanz-Energie-Transfer (FRET)-Sonde, die der ε-Untereinheit des F _o F _{1-ATP-Synthase} besteht die zwischen FRET-Donor und Akzeptor fluoreszierende Proteine ​​(GFP und orange fluoreszierenden Protein (OFP), respectively). ²⁷ Bindung von ATP an der ε-Untereinheit führt zu Konformationsänderungen in dem Protein, das die FRET-Donor bringen in enger Nähe zu dem Akzeptor und damit für Energieübertragung vom Donator zum Akzeptor. Es gibt zwei Varianten von GO-ATeam, GO-GO-ATeam1 und ATeam2. GO-ATeam2 hat eine höhere Affinität für MgATP als GO-ATeam1, so dass es für die Messung der in der Regel niedriger [ATP] in den Mitochondrien im Vergleich zum Cytosol. ²⁷

Um mitochondrialen Redox-Zustand untersuchen, konstruierten wir ein Fusionsprotein (mito-roGFP1), bestehend aus roGFP1 fusioniert mit dem ATP9 Leader-Sequenz einnd ausgedrückt aus einer Zentromer-basierte (low copy number) Hefe-Expressionsplasmid unter Kontrolle des starken Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase (GPD) Promotor (p416GPD, Addgene). Wir verwendeten roGFP1 die Redox-Status von Mitochondrien in zunehmender Alterung des Modells Pilz Saccharomyces cerevisiae sondieren. Wir finden, dass roGFP1 können Veränderungen in der mitochondrialen Redox-Zustand, während des Alterns und in Reaktion auf die Verfügbarkeit von Nährstoffen auftreten, aber keinen offensichtlichen nachteiligen Effekt auf die Hefe-Zellen zu detektieren. Wir sehen auch, Variabilität in der Redox-Zustand der Mitochondrien innerhalb der einzelnen lebenden Hefezellen, ein Befund, der die Bedeutung eines Biosensors mit subzelluläre räumliche Auflösung unterstreicht.

MitGO-ATeam2 ist eine Variante des GO-ATeam2, die die mitochondriale Signalsequenz von Cytochrom c Oxidase Untereinheit VIIIA am Aminoterminus von GO-ATeam2 eingesetzt ist. ²⁷ Wir modifizierten die mitGO-ATeam2 Sonde (freundlicherweise vom Labor bereitgestellt H. Noji, Institut of Scientific and Industrial Research, Osaka University, Japan) zur Verwendung in Hefe durch Subklonierung es über Xba1 und HindIII in den Hefe-Expressionsvektor pAG415GPD-ccdB (Addgene, Cambridge, MA, USA), ein low-copy Plasmid mit dem starken konstitutiven GPD-Promotors. Wir drückten mitGO-ATeam2 in Bäckerhefe, und finden Sie durch Gegenfärbung mit dem DNA-bindenden Farbstoff DAPI, dass es lokalisiert ausschließlich auf Mitochondrien, wo es als ein effektives Sonde zu physiologischen Veränderungen in der mitochondrialen ATP-Spiegel zu messen.

roGFP und GO-ATeam sowohl genetisch codiert. Als Ergebnis können sie eingeführt und stabil beibehalten in intakten Zellen, und Informationen über Redox-Zustand oder ATP-Spiegel in einzelnen lebenden Zellen. Darüber hinaus überwachen beide Biosensoren Änderungen in Redox-Zustand oder ATP-Spiegel, die auftreten, unter physiologischen Bedingungen. ^28. Beide Sonden sind auch ratiometrischen. Als Ergebnis werden die Messungen mit diesen Fühlern aus nicht schwiernges in Biosensor Konzentration oder Probenbeleuchtung oder Dicke. Schließlich bieten beide Biosensoren subzelluläre räumliche Auflösung. Tatsächlich roGFP auf Mitochondrien, ER wurde gezielt Endosomen und Peroxisomen ²⁴ und kann Änderungen in Redox-Zustand von jedem dieser Organellen, weitgehend unabhängig vom pH erkennen.

Protokoll

1. Transformation von Hefezellen mit den Biosensoren

1. Verwandeln Sie den gewünschten Hefestamm mit Plasmid Lager mito-roGFP oder mitGO-ATeam2 mit dem Lithiumacetatverfahren ^27.
2. Zur Transformation mit dem Plasmid-borne Biosensor zu bestätigen und um den Verlust des Plasmids zu verhindern, auszuwählen und aufzubewahren Transformanten auf den entsprechenden selektiven synthetischen Vollmedium (SC-Ura für Mito-roGFP oder SC-Leu für mitGo-ATeam2). Wenn das fluoreszierende Sonde in einem anderen Plasmid als hier beschrieben subkloniert worden, verwenden Sie die entsprechende selektiven Medium. Visualisieren Transformanten mittels Fluoreszenzmikroskopie, um zu bestätigen, dass sie die fluoreszierenden Biosensor ausdrücken und zeigen normale mitochondriale Morphologie.

2. Wachstum von Zellen und Vorbereitung für den Imaging

Zellfunktion und Ansprechen auf medikamentöse Behandlung sind stark abhängig von der Zelldichte und Stoffwechselaktivität. Die besten Ergebnisse werden erhalten, wenn die Zellenaktiv Teilen (mid-log-Phase, ~ 0.5 - 1 x 10 ⁷ Zellen / ml). Der zuverlässigste Weg bis zur mittleren logarithmischen Phase Kulturen gleichmäßige Dichte zu erzeugen, ist von einer stationären Phase pre-Kultur zu impfen.

1. Bereiten Sie einen stationären Phase Vorkultur: wählen Sie eine einzelne Kolonie von transformierten Zellen von einem Teller und impfen selektiven flüssigen Medien (5 ml in einem 50 ml konischen Boden-Rohr). Wachsen bei 30 ° C unter Schütteln bei 225 rpm, bis die optische Dichte der Kultur bei 600 nm (OD ₆₀₀₎ ein Plateau (24-48 h) erreicht hat.
2. Bereiten Sie eine mid-log-Phase Kultur für die Beobachtung: verwenden Sie die entsprechende Volumen Vorkultur bis 5 ml selektives Medium in einem 50 ml konischen Röhrchen-bottom impfen. YPD Medien autofluoreszierenden und sollte nicht für diese Studien eingesetzt werden. Verwenden synthetische vollständige, Glucose basiert, Dropout (SC-Ura) Medien. Wachsen Zellen bei 30 ° C, Schütteln bei 225 rpm für 4-16 h, bis sie Mitte der log-Phase (~ 0.5 - 1 x 10 ⁷ Zellen / ml) zu erreichen. Die Zelldichte bestimmt werdendurch Messung OD _600; kalibrieren Spektralphotometer, um die korrekte Lesung OD ₆₀₀ zu bestimmen. Auf unserer Beckman DU530 (Beckman Coulter, Indianapolis, IN), entspricht mid-log-Phase bis zu einer OD ₆₀₀ von 0,1-0,3.

Mito-roGFP1 Sinne Schwankungen in der Organellen in Reaktion auf metabolische Veränderungen. Zum Beispiel wird in diesem Assay mitochondrialen Redox-Zustand ändert, wenn Hefe auf fermentierbaren Kohlenstoffquellen (zB Glucose, wie in SC-Medien) im Vergleich zu nicht-fermentierbaren Kohlenstoffquellen (zB Glycerin, wie in SGlyc Medien) wachsen, und sogar in verschiedenen Chargen des gleichen Medien. Daher verwenden die gleiche Charge von Medien für alle Experimente.

3. Zellen bereit für die Konzentration (siehe Schritt 2.4) und Bildgebung, wenn keine Behandlung durchgeführt wird. Wenn Zellen behandelt werden, inkubieren Zellen mit der entsprechenden Behandlung und fahren Sie mit dem nächsten Schritt.
4. Konzentrat 1 ml Kultur durch Zentrifugation bei 6.000 xg für 15 sec undResuspension des Zellpellets in 20 ul Medien. Diese Bedingungen zur Maximierung der Anzahl der unterscheidbaren Zellen im Blickfeld.
5. Tragen Sie 2 ul der resuspendierten Zellen auf einen Objektträger. Deckel mit einem Deckglas (Nr. 1,5, vorzugsweise High-Performance 170 ± 5 um Dicke), und die Ränder des Deckglases mit klarem Nagellack oder valap (siehe Reagenzien). Um mit valap versiegeln, schmelzen Sie eine kleine Menge auf einem Metall-Spatel, indem es über einen Bunsenbrenner, dann können Sie ein wenig an den Rändern des Deckglases.
6. Pflegen Zellen bei 30 ° C während der Bildgebung. Ein Ziel Heizer an den 100x Ölimmersionslinse zur Abbildung funktioniert gut für diese Anwendung. Unter diesen Bedingungen bleiben Mitochondrienmorphologie, Redox-Zustand und ATP-Spiegel während der Bildgebung für 10-15 min unverändert.

3. Imaging-Setup

1. Setup for Imaging mito-roGFP1 auf einer Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop
   Die Schritte werden hier zum AxioObse zugeschnittenrver.Z1 Mikroskop mit einer Colibri LED Erregungsquelle, einem Weitwinkel-Kamera und Orca ER Axiovision Erwerb Software ausgestattet. Photobleaching beider Kanäle und Photokonversion oxidiert mito-roGFP1 deutlich mit LED-Beleuchtung im Vergleich zu Quecksilberbogenlampe Beleuchtung (siehe unten) reduziert.
   Um Signal und Auflösung zu maximieren, verwenden Sie die höchste numerische Apertur möglich in das Ziel und die niedrigste Vergrößerung für die ausreichende räumliche Auflösung bietet. Darüber hinaus ist für mito-roGFP Bildgebung, sicherzustellen, dass das Ziel auch bei 365 nm überträgt. Die 100x/1.3NA EG PlanNeofluar Objektiv (Zeiss) funktioniert gut für diese Anwendung.
   Konfigurieren Sie die Software, um die Übernahme oxidierten und reduzierten mito-roGFP1 Arten zu erfassen. Wir verwenden die folgenden Bedingungen.
   1. Konfigurieren Sie den Kanal für oxidierte mito-roGFP der Anregung bei 365 nm (100% LED-Leistung) und einer Emission Filter geeignet für GFP, wie der 38 HE Filter Set (Zeiss) verwenden, mit dem mitgelieferten excitation-Filter aus dem Cube entfernt. Entfernen der Anregungsfilter ermöglicht Anregung bei 365 nm und sowohl 470 nm, ohne dass Filter wechseln, wodurch erreichbar Zeitauflösung.
   2. Konfigurieren Sie den Kanal für reduzierte mito-roGFP auf Anregung bei 470 nm (100% Leistung LED) nutzen und, wie oben erwähnt, das gleiche Emissionsfilters Würfel für die oxidierte mito-roGFP verwendet. Stellen Sie die Kamera auf 1x1 Binning auf räumliche Auflösung zu optimieren.
   3. Set Software az Stapel bestehend aus 11 Scheiben mit 0,5 um Abstand, sammeln beide Kanäle an jeder z-Position zu erwerben. Diese Art der Erfassung ist langsamer als der Erwerb jedes z Stapel wiederum, aber es verhindert Artefakte aus mitochondrialen Bewegung zwischen Erwerb der oxidierten und reduzierten Kanäle.
   4. Bild mehrere Zellen zu bestimmen, eine geeignete Belichtungszeit, die Erzeugung eines starken, aber nicht sättigenden Signals. Es ist wichtig, das Verhältnis der Belichtungszeiten für oxidierten und reduzierten Mito-roGFP1 für alle Experiment erhaltens. Zum Beispiel sollte, wenn die Belichtungszeiten für oxidierten und reduzierten mito-roGFP1 sind 300 und 100 ms, bzw. dann die Belichtungszeit für oxidierte mito-roGFP1 3 mal sein, dass für reduzierte mito-roGFP für alle Experimente.
2. Setup for Imaging mitGO-ATeam2 auf einer spektralen konfokalen Mikroskop
   Um ATP-Spiegel mit mitGO-ATeam2, die Fluoreszenz von GFP (Emissionsmaximum 510 nm) zu quantifizieren müssen aus, dass von OFP (Emissionsmaximum 560 nm) unterschieden werden. Es gibt Fluoreszenzfilter Sätze, die die Fluoreszenz von diesen Fluorophoren emittierte lösen. Allerdings finden wir, dass eine spektrale Detektor, auf vielen konfokalen Laser-Scanning-Mikroskope, funktioniert am besten für diese Anwendung. Eine spektrale Detektor trennt die Fluoreszenzemission in viele Komponenten (typischerweise 32 oder mehr) entsprechend der Wellenlänge. Mehrere benachbarte Wellenlängenbändern kann in einem Bild Kanal kombiniert werden. Die Wellenlängen kombiniert werden empirisch so Signals von G maximiert wirdFP und OFP bei gleichzeitiger Vermeidung von Crossover-Signal, das würde beschämen die FRET-Messung. Verwenden Sie die höchste numerische Apertur Objektiv zur Verfügung. Wir verwenden eine 100x/1.49 oder 60x/1.49 Apo-TIRF Objektiv. Wir verwenden die Nikon A1R konfokalen Mikroskop NIS Elements Software. Konfigurieren Sie die Software, um die Übernahme ATP-gebundenen und ungebundenen ATP-mitGO-ATeam2 Arten zu erfassen. Wir verwenden die folgenden Bedingungen.
   1. Set Lochkamera bis 1,0 Airy-Einheiten (AU), die auf unserem System entspricht az Auflösung von etwa 0,42 um.
   2. Set Scan Zoom, um die Nyquist Grenze, die räumliche Information in das Bild zu maximieren nähern. Auf unserem System die Pixelgröße beträgt 0,12 um.
   3. Weil Mitochondrien während der Bildgebung bewegen kann, kann es hilfreich sein, Imaging Geschwindigkeit durch Beschneiden des Feldes zu 512 x 256 Pixel erhöhen. Die gesamte Zeit benötigt, um Bilder einzeln in unserem System beträgt 1,0 sec, darunter ein 2-fach-Scan Durchschnitt. Je nach gewünschten räumlichen Auflösung kann das Feld weiter zuneh beschnitten werdene Zeitauflösung.
   4. Excite bei 488 nm, und sammeln Emission 500-520 nm für GFP, und 550 bis 580 nm für OFP. Tatsächliche optimalen Werte können mit Merkmalen des bildgebenden Systems variieren.
   5. Die optimale Laserleistung für unser System ist zwischen 6,0 und 6,4%. Die optimale Laserleistung für jede Mikroskopsystem variieren, aber wird idealerweise so niedrig wie möglich und dabei dennoch eine interpretierbare Bild. Eine interne oder externe Leistungsmesser Änderungen der Laserleistung, welche normalerweise im Laufe der Zeit in einem optischen System zu überwachen.
   6. Stellen-Verstärkung und Beleuchtungslichtintensität um den erfassten Bereich von Pixelwerten zu maximieren aber vermeiden Sättigung des Signals, so viele Zellen wie möglich. Nicht analysieren alle Zellen mit mehr als 1% gesättigten Pixel. Bild alle Proben mit dem gleichen Ziel, Laserleistung, Scan Zoom, Pixelgröße, Gain und Offset.

4. Image Acquisition

1. Suchen Sie den Schwerpunkt pla ne von Zellen von Interesse mit Durchlicht zu minimieren Bleichen der fluoreszierenden Sonde.
2. Nach dem Auffinden einer oder mehrerer Zellen von Interesse, muss eine z-Reihe durch die gesamte Tiefe einer typischen Zelle (ca. 7 um) mit einer Schrittweite von 0,5 um.
3. Bild anderen Zellen von Interesse auf der Folie, aber nicht ein einziges Bild Rutsche für länger als 15 min. Nach 15 min auf der Folie, verlieren Zellen Lebensfähigkeit.

5. Analyse

Mitochondriale ATP-Ebene wird durch die Messung des Verhältnisses der mitGO-ATeam2 Emission bei 560 nm zu der bei 510 nm bestimmt ²⁷ Die Redox-Zustand der Organellen als oxidiert (R / O)-Verhältnis von Mito-roGFP reduziert gemessen wird;. Dh Emission bei 510 nm nach Anregung bei 470 nm Emission bei 510 nm nach Anregung bei 365 nm unterteilt. Vor der Berechnung des Verhältnisses, subtrahieren wir Hintergrund und Bestimmen eines Schwellenwertes für Pixel, die zu der fluoreszierenden Mitochondrien.

Zelt "> Public Domain (zB ImageJ ³⁰⁾ oder im Handel erhältlich (z. B. Volocity, Perkin-Elmer) Software für die Analyse von Mito-roGFP1 oder mitGO-ATeam2. Je nach Software für die Bildaufnahme verwendet und für die Analyse verwendet werden können, werden die Bilder können müssen zunächst in ein anderes Format umgewandelt werden, wie z. B. TIFF, vor dem Öffnen in der Analyse-Software. Werden Bilder umgewandelt werden, ist es wichtig zu überprüfen, ob Pixelwerte nicht während der Konvertierung geändert. Analyse der mito-roGFP1 Daten mit beide Programme ist unten beschrieben. Die Programm-Menüs und Optionen innerhalb jedes Menü in fett und kursiv hervorgehoben.

5.1 ImageJ Analyse

1. Öffnen von Bildern und Art der Änderung auf 32-Bit: Bild → Typ → 32 bit.
2. Zeichnen Sie eine Region of Interest (ROI) in einem Gebiet, wo es keine Zellen. Berechnen Sie die mittlere Intensität in dieser ROI: Analysieren → Messen.
3. Subtrahieren Sie die berechnete Mittelwert Hintergrund aus dem Stapel: Prozess → Math → Subtrahieren.
4. Mit dem Z-Stapel abgezogen, um den mittleren Scheibe und die Schwelle von Mitochondrien: Bild → Einstellen → Threshold und klicken Sie an der Schwelle Fenster auf Übernehmen. Auf alle Scheiben in dem Stapel. Prüfen Set Hintergrund Pixel auf NaN.
5. Erstellen Sie das Verhältnis z Stapel: Prozess → Bild Calculator Teilen Sie die reduzierten Stapel durch den oxidierten für Z-Stapel für mito-roGFP1 Analyse. Teilen Sie die 560 nm (ATP gebundenen) Bild von den 510 nm (ATP ungebundenen) für mitGO-ATeam2 Analyse.
6. Zeichnen Sie eine ROI um den Bereich von Interesse. Wählen Analysieren → Extras → ROI-Manager, und klicken Sie auf Hinzufügen, um den ROI aufzeichnen. Mehrere Bereiche können im Manager gespeichert werden. In ROI-Manager, wählen Sie alle ROIs, dann wählen Sie MErz → Multi-Measure, um alle Stapel Scheiben zu messen. Exportieren von Daten in eine Tabellenkalkulation für die Analyse.

5.2 Volocity Analyse

1. Importieren von Bildern in einem Volocity Bibliothek und erstellen Sie eine Bildsequenz mit 2 Kanälen.
2. Zeichnen Sie eine Region of Interest (ROI) in einem Gebiet, wo es keine Zellen. Wählen Sie: Extras → Verhältnis.
3. Verwenden Volocity, um den Hintergrund zu berechnen: Holen Von ROI.
4. Stellen Sie die Schwelle zur mitochondrialen Strukturen umfassen.
5. Aktivieren Sie die Option, um einen Regenbogen LUT dem Verhältnis Kanal anwenden. Die intensitätsmoduliert Kanal kann einen weniger laut Bild für Präsentations-, aber es sollte nicht zur Quantifizierung der durchschnittlichen Verhältnis verwendet werden.
6. Wählen Sie die Registerkarte Messung, wählen Sie das Verhältnis Kanal und ziehen eine ROI um den Bereich von Interesse. Messen Sie den Kanal-Verhältnis, ohne Null-Werte. Mehrere Bereiche können ausgewählt und gemessen werdengleichzeitig. Exportieren von Daten in eine Tabellenkalkulation für die Analyse.

Ergebnisse

Messen mitochondrialen Redox-Zustand mit Mito-roGFP

Hier zeigen wir, dass mito-roGFP1 den dynamischen Bereich hat, um Änderungen in der mitochondrialen Redox-Zustand von vollständig oxidiert zu erfassen, um in lebenden Hefezellen reduziert, ohne die Hefe das Zellwachstum oder die mitochondriale Morphologie. Zunächst finden wir Zellen, Mitochondrien gezielte GFP und roGFP1 wachsen zu normalen Tarifen (Abbildung 1A). Die maximale Wachstumsrate, wie maximale Steigung der Wachst...

Diskussion

Hier beschreiben wir Methoden, um mito-roGFP1 und mitGO-ATeam2 als Biosensoren nutzen zu mitochondrialen Redox-Zustand und ATP-Spiegel in lebenden Hefezellen zu beurteilen. Wir finden, dass die Expression von Plasmid-borne mito-roGFP1 oder mitGO-ATeam Ergebnisse in quantitativer Ausrichtung auf Mitochondrien, ohne offensichtliche Wirkung auf die mitochondriale Morphologie oder die Verbreitung oder auf zellulären Wachstumsraten. ³ Mito-roGFP1 können Änderungen in der mitochondrialen Redox-Zustand von stark ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Reagents
Antimycin A	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)	1397-94-0	Dissolved in ethanol to a 2 mg/ml stock solution.
SGlyc (synthetic glycerol-based) yeast growth medium *omit for SGlyc-Ura **omit for SGlyc-Leu			Dissolve in H2O. Adjust pH to 5.5 with NaHCO3. Autoclave. Ingredients: 0.67% Yeast nitrogen base without amino acids 3% Glycerol 0.05% Glucose 2 mg/ml adenine 2 mg/ml uracil* 1 mg/ml L-arginine 1 mg/ml L-histidine 1 mg/ml L-leucine** 3 mg/ml L-lysine 2 mg/ml L-methionine 4 mg/ml L-phenylalanine 2 mg/ml L-tryptophan 3 mg/ml L-tyrosine
SC (synthetic complete, glucose-based) yeast growth medium *omit for SGlyc-Ura **omit for SGlyc-Leu			Dissolve in H2O. Adjust pH to 5.5 with NaHCO3. Autoclave. Ingredients: 0.67% Yeast nitrogen base without amino acids 3% Glucose 2 mg/ml adenine 2 mg/ml uracil* 1 mg/ml L-arginine 1 mg/ml L-histidine 1 mg/ml L-leucine** 3 mg/ml L-lysine 2 mg/ml L-methionine 4 mg/ml L-phenylalanine 2 mg/ml L-tryptophan 3 mg/ml L-tyrosine
Valap			Combine ingredients in a 1:1:1 (w:w:w) ratio. Melt by submerging in a 70 °C H2O bath. Aliquot into glass petri dishes. Store at room temperature. Ingredients: Vaseline petroleum jelly, hard paraffin, lanolin
			Equipment and Software
Precleaned Gold Seal Rite-on Micro Slides	Thomas Scientific (Swedesboro, NJ)	3050	Size: 25 x 75 mm; Thickness: 0.93 to 1.05 mm
High-performance coverslips, No. 1.5, 18x18 mm	Zeiss (Thornwood, NY)	474030-9000-000	These are less variable in thickness (170±5 μm) than standard coverslips, reducing spherical aberration and improving 3D imaging performance
Fisherbrand Microscope Cover Glass, No. 1.5	Fisher Scientific (Pittsburgh, PA)	12-545E	Size: 22 x 22 mm, No. 1.5 thickness (170 μm)
A1 laser scanning confocal microscope with spectral detector and 100x/1.49 NA Apo-TIRF objective	Nikon (Melville, NY)
AxioObserver.Z1 microscope equipped with a 100x/1.3NA EC Plan-Neofluar objective (Zeiss) and Orca ER cooled CCD camera (Hamamatsu) and controlled by Axiovision software	Zeiss (Thornwood, NY); Hamamatsu (Hamamatsu City, Japan)
Volocity 3D Image Analysis software	Perkin Elmer (Waltham, MA)		Restoration module for deconvolution; Quantitation module for ratio calculation and measurement
ImageJ software	National Institutes of Health (Bethesda, MD)		http://rsb.info.nih.gov/ij/