Biosensors רציומטרי שלמדוד את מצב חיזור מיטוכונדריאלי וה-ATP בתאי שמרי חיים

Summary

אנו מתארים את השימוש בשני חיישנים ביולוגיים, מקודדים גנטי ratiometric, המבוססים על ה-GFP, כדי לפקח על מצב חיזור המיטוכונדריה ורמות ה-ATP ברזולוציה subcellular בתאי שמרי חיים.

Abstract

יש לי המיטוכונדריה תפקידים בתהליכים תאיים רבים, מחילוף חומרים של אנרגיה והומאוסטזיס סידן לשלוט של הסלולר תוחלת חיים ומות תאים מתוכנת. תהליכים אלה משפיעים ומושפעים מהמצב של חיזור וייצור ATP במיטוכונדריה. כאן, אנו מתארים את השימוש בשני חיישנים ביולוגיים ratiometric, מקודדים גנטי שיכול לזהות מצב חיזור המיטוכונדריה ורמות ה-ATP ברזולוציה subcellular בתאים חי שמרים. מדינת חמזור מיטוכונדריאלי נמדדת באמצעות חלבון פלואורסצנטי ירוק חיזור רגיש (roGFP) כי הוא ממוקד למטריקס המיטוכונדריה. מיטו-roGFP מכיל cysteines בעמדות 147 ו -204 של ה-GFP, אשר עוברות חמצון הפיך ותלוי בסביבה וצמצום, אשר בתורו משנה את ספקטרום העירור של החלבון. MitGO-ATeam היא העברת פורסטר תהודה אנרגיה (סריג) בדיקה שבמקטע של ε _o F F-ATP synthase ₁ הוא דחוקה בין סריג תורם acceptor fluoחלבוני rescent. כריכה של ה-ATP לתוצאות מקטע ε בשינויי קונפורמציה בחלבון המביאים סריג תורם acceptor בסמיכות ומאפשרת העברת אנרגיה תהודה הקרינה מהתורם לacceptor.

Introduction

המיטוכונדריה הם אברונים חיוניים לייצור ה-ATP, סינתזה של חומצות אמינו, חומצות שומן, heme, ברזל וגופרית אשכולות pyrimidines. מיטוכונדריה גם לשחק תפקידים מרכזיים בומאוסטזיס סידן, וברגולציה של אפופטוזיס. ¹ קישורי ראיות הגדלת מיטוכונדריה למחלות הזדקנות וקשורות לגיל, כולל מחלת פרקינסון, אלצהיימר, טרשת לרוחב amyotrophic, ומחלת הנטינגטון. ² בעוד אנשים חיים את כל חייהם עם מוטציות בחלבוני המיטוכונדריה הקשורים למחלות ניווניות, את תסמיני המחלה מתרחשות רק מאוחר יותר בחיים. זה מצביע על כך ששינויים מתרחשים במיטוכונדריה עם גיל שיאפשר מחלת הפתולוגיה לצוץ. ואכן, כושר המיטוכונדריה הוא מתואם עם בריאות כללית תא ותוחלת חיים בשמרים ותאי יונקים. ^3,4 כאן, אנו מתארים כיצד להשתמש בחיישנים ביולוגיים גנטי מקודדים, רציומטרי ניאון כדי להעריך שני מאפיינים קריטיים של mitochondria בתאים חי שמרים: מדינת חיזור ורמות ה-ATP.

תפקוד המיטוכונדריה בגיוס אנרגיה אירובי הוא מבוסס היטב. מדינת חמזור מיטוכונדריאלי היא תוצר של הפחתת חמצון ומינים באברון, כולל NAD ⁺ / NADH, FAD / FADH _2, NADP ⁺ / NADPH, דיסולפיד גלוטתיון / גלוטתיון (GSH / GSSG) ומיני חמצן תגובתי (ROS). שחרר את סוגר המיטוכונדריה או היפוקסיה משפיע על פעילות נשימה המיטוכונדריה ומשנה את היחס בין NAD ⁺ ל NADH באברון. ROS, אשר מיוצרים מהעברת אלקטרון בין קומפלקסים לא יעילה של שרשרת העברת האלקטרונים בקרום המיטוכונדריה הפנימית, כמו גם מdeamination של אמינים באמצעות מונואמין אוקסידאז בקרום החיצוני של המיטוכונדריה ^5, שומנים, חלבונים, נזק וחומצות גרעין ויש לי נקשר להזדקנות ומחלות ניווניות גיל הקשורים ^6,7,8. ROS גם לשחק תפקיד בהעברת אותות במ 'itochondria, באמצעות חמצון של GSH. לדוגמה, NADH דהידרוגנז לא רק תורם לייצור ROS אלא גם מוסדר באמצעות אינטראקציות עם בריכת גלוטתיון ^9,10. דהידרוגנז וaconitase α-ketoglutarate, רכיבים של מחזור TCA, מפגינים פעילות מופחתת בחמצון סביבות ^11,12.

ואכן, תקנת חיזור תלויה של פעילות aconitase נשמרת מחיידקים ליונקים ^13,14. לפיכך, ניטור מצב חיזור ורמות ה-ATP של המיטוכונדריה הוא חיוני להבנת תפקודם והתפקיד במחלת פתולוגיה.

שיטות ביוכימיות שמשו כדי להעריך את מצב חיזור או רמות ה-ATP בתאים שלמים או מבודד מיטוכונדריה. שיטות המשמשות באופן נרחב כדי להעריך את מצב חיזור של תאים או שלמים מבודדת המיטוכונדריה מבוססות על מדידת הרמות של זוג חמזור GSH / GSSG ^15. המערכת נמצאת בשימוש luciferin-לוציפראז נפוץ למדידת המיטוכונדריהרמות ה-ATP בכל תאים שלמים permeabilized או מבודד המיטוכונדריה. ^{16,17,18,19,20} ב assay זה, לוציפראז נקשר ה-ATP ומזרזת חמצון של וchemiluminescence מluciferin. ²¹ עוצמת האור הנפלט הוא ביחס ישר לכמות של ה-ATP בתערובת התגובה. ²²

שיטות אלה חשפו מידע מהותי בנוגע לתפקוד המיטוכונדריה, כולל מציאת כי בחולים עם מחלות ניווניות, כמו מחלת אלצהיימר, יש רמות נמוכות באופן חריג ה-ATP. ²³ עם זאת, הם לא יכולים לשמש למגורים, תמונת תאים שלמים. יתר על כן, שיטות המבוססות על ניתוח כל התא מספקות ממוצעת של מדינת חיזור או רמות ה-ATP בכל התאים של התא. מדידות באברונים מבודדים הן פוטנציאל בעייתיים משום שמדינת חמזור המיטוכונדריה או רמות ה-ATP עשויה להשתנות במהלך חלוקה subcellular. לבסוף, מחקרים שנעשה לאחרונה מהמעבדה ועוד מצביעים על כךהמיטוכונדריה בתוך תאים בודדים הן הטרוגנית בפונקציה, אשר בתורו משפיעה על תוחלת החיים של תאים אם ובתה. ³ לפיכך, יש צורך למדוד את רמות ה-ATP והמיטוכונדריה מדינת חיזור בתאים חיים עם הרזולוציה subcellular.

את biosensors לתפקוד המיטוכונדריה מתואר כאן הם על בסיס ה-GFP. GFP חיזור רגיש (roGFP) ^24,25 הוא גרסת ה-GFP שבו מוסף החשוף על פני השטח cysteines למולקולה. roGFP, כמו פראי סוג של GFP, יש שתי פסגות עירור (ב ~ 400 ננומטר ו ~ 480 ננומטר) ושיא פליטה אחד ב~ 510 ננומטר. חמצון של שאריות ציסטאין בתוצאות roGFP בעלייה בעירור ב ~ 400 ננומטר. הפחתה של cysteines האלה מעדיפה עירור ב ~ 480 ננומטר. לפיכך, היחס בין פליטת ננומטר 510 על עירור של roGFP ב480 ננומטר ו -400 ננומטר מגלה את הכמות היחסית של חמצון מופחת וroGFP, המשקף את מצב חיזור של הסביבה של fluorophore.

שני versיונים של roGFP נמצאים בשימוש נרחב: roGFP1 וroGFP2. שניהם מכילים את אותם הוספות ציסטאין. roGFP1 מבוסס על פראי סוג GFP וroGFP2 מבוסס על S65T GFP, שבו יש עירור יעיל יותר ב480 ננומטר ופחות יעיל בעירור 400 ננומטר לעומת wtGFP ^24. roGFP1 הוא פחות רגיש מאשר pH roGFP2 והטווח הדינמי שלה מרחיב עוד יותר לתוך הטווח המופחת. לפיכך, roGFP1 עשויה להיות שימושי יותר לניטור תאים יותר להפחתה כגון המיטוכונדריה או cytosol, ותאים בעלי חומציות משתנה, כגון endosomes. roGFP2 מציע אות בהירה, בחלק מהמחקרים, טווח דינמי גדול יותר מroGFP1 ^24,26. מחקרים בthaliana ארבידופסיס מצביעים על כך שהזמן הנדרש לתגובה לשינויים במצב חיזור הוא דומה בשני החיישנים (t ½ לחמצון, 65 ו -95 שניות ולא ½ להפחתה, 272 ו 206 שניות, לroGFP1 וroGFP2, בהתאמה). ²⁶

MitGO-ATeam2 הוא פולשנית, אמינהחיישן שמודד את המיטוכונדריה ה-ATP בcerevisiae Saccharomyces שמרי ניצנים. GO-ATeam הוא העברת פורסטר תהודה אנרגיה (סריג) בדיקה שמורכבת המקטע של ε F _o F-ATP synthase ₁ דחוקה בין סריג תורם וחלבוני ניאון acceptor (GFP וכתום חלבון פלואורסצנטי (OFP), בהתאמה). ²⁷ כריכה של ה-ATP לתוצאות מקטע ε בשינויי קונפורמציה בחלבון המביאים סריג תורם בסמיכות לacceptor ולאפשר להעברת אנרגיה מתורם לacceptor. ישנן שתי גרסאות של Go-ATeam, GO-ATeam1 וללכת-ATeam2. יש GO-ATeam2 זיקה גבוהה יותר לMgATP מאשר ללכת-ATeam1, מה שהופך אותו מתאים יותר למדידה בדרך כלל נמוכים יותר [ATP] במיטוכונדריה לעומת cytosol. ²⁷

לחקור מדינת חמזור המיטוכונדריה, אנו נבנו חלבון היתוך (מיטו-roGFP1) בהיקף של roGFP1 התמזג רצף מנהיג ATP9ND הביע מביטוי שמרי centromere מבוסס (מספר עותק נמוך) פלסמיד תחת שליטה של ​​דהידרוגנז glyceraldehyde-3-פוספט החזק (GPD) האמרגן (p416GPD, Addgene). אנחנו השתמשנו roGFP1 לחקור את מצב חיזור של המיטוכונדריה בהקשר של הזדקנות של cerevisiae Saccharomyces פטריית המודל. אנו מוצאים כי roGFP1 יכול לזהות שינויים במצב חיזור המיטוכונדריה המתרחשים במהלך הזדקנות ובתגובה לזמינות חומרי הזנה, אבל אין כל השפעה מזיקה לכאורה על תאי שמרים. כמו כן, אנו רואים השתנות במצב חיזור של המיטוכונדריה בתוך תאי שמרי חיים בודדים, ממצא זה מדגיש את החשיבות של biosensor עם רזולוציה מרחבית subcellular.

MitGO-ATeam2 הנו נגזרת של GO-ATeam2, שבו יש רצף של המיטוכונדריה אות VIIIA מקטע מונואמין ג ציטוכרום הוכנס בתחנה הסופית של אמין GO-ATeam2. ^-27 שונה חללית mitGO-ATeam2 (בחביבות על ידי המעבדה של ח Noji, מכון OF מדע ומחקר תעשייתי, אוניברסיטת אוסקה, יפן) לשימוש בשמרים על ידי subcloning, באמצעות Xba1 ואתרי HindIII, לתוך וקטור ביטוי שמרי pAG415GPD-ccdB (Addgene, קיימברידג', מסצ'וסטס, ארה"ב), שהוא נמוך עותק פלסמיד המכיל את אמרגן GPD המכונן החזק. אנחנו הביעו mitGO-ATeam2 בשמרי ניצנים, ולמצוא, לפי counterstaining עם הצבע DAPI-DNA המחייב, כי זה localizes באופן בלעדי למיטוכונדריה, שם היא משמשת כבדיקה יעילה למדידת שינויים פיסיולוגיים ברמות ה-ATP המיטוכונדריה.

roGFP וללכת-ATeam שניהם מקודדים גנטי. כתוצאה מכך, הם יכולים להיות הציגו ומתוחזק ביציבות בתאים שלמים, ולספק מידע על מצב חיזור או רמות ה-ATP בתאים בודדים, המתגוררים. יתר על כן, שני biosensors לעקוב אחר שינויים במצב חיזור או רמות ה-ATP שמתרחשות בתנאים פיסיולוגיים. ²⁸ שתי הבדיקות גם ratiometric. כתוצאה מכך, מדידות שנעשו עם בדיקות אלה אינן מושפעות על ידי צ'הnges בריכוז biosensor או תאורת מדגם או עובי. לבסוף, שני biosensors לספק רזולוציה מרחבית subcellular. ואכן, roGFP כבר ממוקד למיטוכונדריה, ER, endosomes וperoxisomes ^24, ויכול לזהות שינויים במצב חיזור של כל אחד מהאברונים האלה, בלתי תלויים ברמת החומציות.

Protocol

1. טרנספורמציה של תאי שמרים עם Biosensors

1. להפוך את זן השמרים הרצויים עם פלסמיד נושא מיטו-roGFP או mitGO-ATeam2 בשיטה אצטט ליתיום ^27.
2. כדי לאשר את השינוי עם biosensor פלסמיד הנישא ועל מנת למנוע אובדן של פלסמיד, לבחור ולשמור על transformants הבינוני המלאה המתאימה סלקטיבית הסינטטי (SC-Ura למיטו-roGFP, או SC-Leu לmitGo-ATeam2). אם הבדיקה הניאון כבר subcloned בפלסמיד שונה מאלה המתוארים כאן, להשתמש במצע סלקטיבי המתאים. דמיין transformants על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לאשר שהם מביעים biosensor הניאון ולהציג מורפולוגיה המיטוכונדריה נורמלית.

2. צמיחה של תאים והכנה להדמיה

תפקוד תא ותגובה לטיפול תרופתי תלויים מאוד בצפיפות תאים ופעילות מטבולית. התוצאות הטובות ביותר מתקבלות כאשר תאיםבאופן פעיל בחלוקה (שלב אמצע יומן, ~ 0.5 - 1 x 10 ⁷ תאים / מ"ל). הדרך אמינה ביותר ליצירת תרבויות שלב אמצע יומן, של צפיפות עולה בקנה אחד היא לחסן ממראש תרבות נייחת שלב.

1. הכן מראש תרבות נייחת שלבים: פיק מושבה אחת של תאים הפכו מצלחת ולחסן תקשורת נוזלית סלקטיבית (5 מ"ל בשפופרת 50 מיליליטר חרוטי התחתון). לגדול ב 30 ° C עם הרועד בסל"ד 225 עד הצפיפות האופטית של התרבות ב 600 ננומטר (OD ₆₀₀₎ הגיעה לרמה (24-48 שעות).
2. הכן את תרבות שלב אמצע יומן לתצפית: להשתמש בנפח המתאים של טרום התרבות לחסן 5 מ"ל של תקשורת סלקטיבית בצינור חרוטי התחתון 50 מ"ל. תקשורת YPD היא autofluorescent ולא אמור לשמש ללימודים אלה. השתמש שלמה, סוכר, המבוסס נשירה (SC-אורה) תקשורת סינטטי. לגדל תאים על 30 מעלות צלזיוס, רועד ב225 סל"ד, 4-16 לשעה, עד שהם מגיעים לשלב אמצע יומן (~ 0.5 - 1 x 10 ⁷ תאים / מ"ל). ניתן לקבוע צפיפות תאיםעל ידי מדידת קוטר _600; לכייל ספקטרופוטומטר כדי לקבוע את קריאת OD ₆₀₀ הנכונה. בקמן DU530 (Beckman Coulter, אינדיאנפוליס, אינדיאנה), שלב אמצע יומן מתאים לOD ₆₀₀ של 0.1-0.3.

מיטו-roGFP1 תנודות חושים באברון בתגובה לשינויים מטבוליים. לדוגמה, בשינויי מצב חיזור המיטוכונדריה assay זה כאשר שמרים גדלים על מקורות פחמן (למשל תסיס גלוקוז, כמו בתקשורת SC) לעומת מקורות פחמן שאינו תסיס גליצרול (למשל, כמו בתקשורת SGlyc), ואפילו בקבוצות של אותו שונים תקשורת. לכן, השתמש באותה הקבוצה של אמצעי תקשורת לכל הניסויים.

3. תאים מוכנים לריכוז (ראה שלב 2.4) והדמיה אם מתבצע ללא טיפול. אם מטופלי תאים, דגירה תאים עם הטיפול המתאים ולהמשיך לשלב הבא.
4. להתרכז 1 מ"ל של התרבות על ידי צנטריפוגה XG ב 6000 במשך 15 שניות וresuspension של גלולה התא ב20 μl של תקשורת. תנאים אלה למקסם את מספר התאים להבחנה בשדה הראייה.
5. החל 2 μl של תאי resuspended לשקופית. לכסות עם coverslip (מס '1.5, רצוי בעל ביצועים גבוהים 170 ± עובי 5 מיקרומטר), וסוגר את הקצוות של coverslip עם לק או ברורים valap (ראה ריאגנטים). לאטום עם valap, להמס כמות קטנה במרית מתכת על ידי מחזיק אותו מעל להבת מבער בונזן, ולאחר מכן התפשט בכמות קטנה לאורך הקצוות של coverslip.
6. שמור על תאים על 30 מעלות צלזיוס במהלך ההדמיה. דוד אובייקטיבי על עדשת טבילת שמן 100x משמשת להדמיה עובד היטב עבור יישום זה. בתנאים אלה, מורפולוגיה המיטוכונדריה, מדינת חיזור ורמות ה-ATP יישארו ללא שינוי במהלך הדמיה למשך 10-15 דקות.

3. התקנת הדמיה

1. התקנה להדמית מיטו-roGFP1 על מיקרוסקופ פלואורסצנטי רחב בתחום
   השלבים כאן הם מותאמים לAxioObserver.Z1 מיקרוסקופ מצויד במקור Colibri LED עירור, אורקה ER מצלמה רחבת שדה ותוכנת רכישת AxioVision. Photobleaching של שני הערוצים וphotoconversion של חמצון מיטו-roGFP1 מצטמצם משמעותי שימוש בתאורת LED בהשוואה לתאורת כספית קשת מנורה (ראה להלן).
   על מנת למקסם את האות ורזולוציה, השתמש בצמצם הגבוה ביותר המספרי האפשרי במטרה, וההגדלה הנמוכה ביותר המספקת רזולוציה מרחבית מספיק. בנוסף, למיטו-roGFP הדמיה, ודא שהמטרה מעבירה היטב ב365 ננומטר. 100x/1.3NA EC PlanNeofluar האובייקטיבי (Zeiss) עובד היטב עבור יישום זה.
   הגדר את תוכנת הרכישה כדי ללכוד את מיני מיטו-roGFP1 חמצון ומצטמצמים. אנו משתמשים בתנאים הבאים.
   1. הגדר את הערוץ לחמצון מיטו-roGFP להשתמש עירור ב 365 ננומטר (100% כוח LED) ומסנן פליטה מתאים לGFP, כגון 38 הם לסנן סט (Zeiss), עם excitatio הכלולהn המסנן הוסר מהקובייה. הסרת מסנן העירור מאפשרת עירור ב 365 ננומטר ושני 470 ננומטר, ללא הצורך לעבור מסננים, וכך להגדיל את הרזולוציה זמן השגה.
   2. הגדר את הערוץ למופחת מיטו-roGFP להשתמש עירור ב 470 ננומטר (100% כוח LED), וכפי שהוזכר לעיל, אותה קוביית מסנן הפליטה המשמשת לחמצון מיטו-roGFP. להגדיר את המצלמה ל1x1 binning כדי לייעל את הרזולוציה מרחבית.
   3. הגדר את התוכנה לרכישת AZ מחסנית בהיקף של 11 פרוסות עם מרווח 0.5 מיקרומטר, איסוף שני ערוצים בכל עמדת z. מצב זה של רכישה הוא איטי יותר מאשר רכישת כל ערימת z בתורו, אבל הוא מונע חפצים הנובעים מתנועה המיטוכונדריה בין רכישת ערוצי חמצון ומצטמצמים.
   4. תמונת מספר תאים כדי לקבוע זמן חשיפה מתאים, הפקת אות להרוות חזקה, אבל לא. חשוב לשמור על היחס של זמני חשיפה לחמצון והקטין מיטו-roGFP1 לכל הניסויים. לדוגמה, אם מתחמצנים את זמני החשיפה ולהקטינו מיטו-roGFP1 הם 300 ו -100 אלפיות שני, בהתאמה, ולאחר מכן את זמן החשיפה לחמצון מיטו-roGFP1 צריך להיות 3 פעמים שהקטין למיטו-roGFP לכל הניסויים.
2. התקנה להדמית mitGO-ATeam2 על מיקרוסקופ confocal רפאים
   כדי לכמת רמות ה-ATP באמצעות mitGO-ATeam2, הקרינה מGFP (ננומטר הפליטה המרבי 510) יש להבחין בין שמOFP (ננומטר הפליטה המרבי 560). ישנן מערכות סינון הקרינה שתפתורנה את הקרינה הנפלטת מfluorophores אלה. עם זאת, אנו מוצאים כי גלאי רפאים, נגיש בליזר רבים סריקה מיקרוסקופי confocal, עובד הכי טוב עבור יישום זה. גלאי רפאים מפריד בין פליטת הקרינה למרכיבים רבים (בדרך כלל 32 או יותר) על פי אורך גל. כמה להקות גל סמוכות ניתן לשלב ערוץ תמונה אחת. אורכי הגל שנבחרו באופן אמפירי בשילוב כדי למקסם אות GFP וOFP תוך הימנעות מוצלב של אות שהייתי לבלבל סריג מדידה. השתמש בעדשת הצמצם המספרית הגבוהה ביותר הקיימת. אנו משתמשים ב100x/1.49 או 60x/1.49 עדשת Apo-TIRF. אנו משתמשים במיקרוסקופ confocal A1R ניקון פועל תוכנת אלמנטי ש"ח. הגדר את תוכנת הרכישה כדי ללכוד את מיני mitGO-ATP ATeam2 בכריכות וATP-מאוגד. אנו משתמשים בתנאים הבאים.
   1. הגדר חריר ל1.0 יחידות אווריריות (AU), אשר במערכת שלנו תואמות את AZ הרזולוציה של כ 0.42 מיקרומטר.
   2. הגדר זום סריקה כדי להתקרב לגבול דגימת נייקוויסט, אשר תהיה למקסם את המידע המרחבי בתמונה. במערכת שלנו הוא בגודל פיקסל 0.12 מיקרומטר.
   3. בגלל המיטוכונדריה עשויה לעבור במהלך הדמיה, זה יכול להיות מועיל כדי להגביר את מהירות הדמיה על ידי חיתוך לשדה 512 x 256 פיקסלים. הזמן הכולל נדרש לתמונת מסגרת אחת במערכת שלנו הוא 1.0 שניות, כולל סריקה ממוצעת פי 2. בהתאם לרזולוציה מרחבית רצויה, השדה יכול להיות קצוץ נוסף לincreasדואר רזולוציה זמן.
   4. אקסייט ב 488 ננומטר, ולאסוף פליטה 500-520 ננומטר עבור ה-GFP, ו550-580 ננומטר לOFP. ערכים אופטימליים בפועל עשויים להשתנות עם מאפיינים של מערכת ההדמיה.
   5. כוח לייזר האופטימלי למערכת שלנו הוא בין 6.0 ו 6.4%. כוח לייזר האופטימלי ישתנה עבור כל מערכת מיקרוסקופ, אבל באופן אידיאלי להיות נמוך ככל האפשר, תוך הפקת תמונה לפירוש. השתמש במד כוח פנימי או חיצוני כדי לפקח על שינויים בכוח לייזר, אשר מתרחשים בדרך כלל על פני זמן בכל מערכת אופטית.
   6. התאם רווח גלאי ועוצמת אור תאורה על מנת למקסם את הטווח של ערכים המזוהה פיקסל אך להימנע להרוות את האות, כלתאים רבים ככל האפשר. לא לנתח כל תאים המכילים יותר מ 1% פיקסלים רוויים. תמונה כל הדגימות באמצעות אותה מטרה, כוח לייזר, סריקת זום, גודל פיקסל, רווח, ולקזז.

4. רכישת תמונה

1. איתור מוקדי PLA ne של תאים בעלי עניין באמצעות אור מועבר כדי למזער הלבנת הבדיקה הניאון.
2. לאחר איתור תא אחד או יותר של עניין, לאסוף Z-סדרה באמצעות כל עומקו של תא טיפוסי (כ 7 מיקרומטר) באמצעות גודל צעד של 0.5 מיקרומטר.
3. תמונת תאים אחרים בעלי עניין בשקופית, אבל אין תמונה בשקופית אחת למשך זמן ארוך יותר מ -15 דקות. לאחר 15 דקות בשקופית, תאים מאבדים את יכולת קיום.

5. אנליזה

רמת ה-ATP מיטוכונדריאלי נקבעת על ידי מדידת היחס בין פליטת mitGO-ATeam2 ב 560 ננומטר כדי שב 510 ננומטר ²⁷ מדינת חיזור של אברון נמדדת כיחס מצטמצם לחמצון (R / O) של מיטו-roGFP;. כלומר פליטה ב 510 ננומטר על עירור ב 470 ננומטר מחולק בפליטה ב 510 ננומטר על עירור ב 365 ננומטר. לפני חישוב היחס, אנו לחסר רקע ולקבוע ערך סף לפיקסלים השייכים למיטוכונדריה ניאון.

אוהל "> ברשות ציבור (למשל ImageJ ³⁰⁾ או זמינה מסחרי (Volocity למשל, פרקין אלמר) תוכנה יכולה לשמש לניתוח של מיטו-roGFP1 או mitGO-ATeam2. בהתאם לתוכנה המשמשת לרכישת תמונה ולניתוח, את התמונות ייתכן שיצטרך להיות מומר לפורמט אחר, כמו TIFF, לפני פתיחתם בתוכנת הניתוח. אם תמונות מומרות, זה חיוני כדי לוודא שערכי הפיקסלים לא משתנה במהלך ההמרה. ניתוח של נתונים מיטו-roGFP1, באמצעות שתי התוכניות מתוארת להלן. תפריטי תכנית ואפשרויות לבחירה בתוך כל תפריט מודגשים בכתב נטוי מודגש.

ניתוח ImageJ 5.1

1. פתיחת תמונות ולשנות את סוג ל32 סיביות: תמונת → → סוג 32 ביט.
2. צייר אזור של עניין (ROI) באזור שבו אין תאים. לחשב את עוצמת הממוצעת בהחזר על השקעה זו: נתח → מדוד.
3. הפחת את הרקע הממוצע מחושב מהמחסנית: תהליך → המתמטיקה → לחסר.
4. באמצעות Z-המחסנית נגרעה, למצוא את הפרוסה אמצעית ועל סף מיטוכונדריה: תמונת → התאם → הסף ולחץ על החל על סף החלון. אחול על כל הפרוסות בערימה. בדקו הגדרת פיקסלים רקע לנאן.
5. ליצור יחס z ערימה: תהליך → מחשבון תמונה מחלקים את הערימה המופחתת על ידי הערימה מתחמצנת z לניתוח מיטו-roGFP1. מחלקים את תמונת 560 ננומטר (ATP המאוגד) על ידי 510 ננומטר (מאוגד ATP) תמונה לניתוח mitGO-ATeam2.
6. צייר את ההחזר על ההשקעה מסביב לאזור של עניין. בחר לנתח → כלים → ROI מנהל, ולחץ על הוסף כדי להקליט את ההחזר על ההשקעה. אזורים מרובים עשויים להיות מאוחסנים במנהל. במנהל החזר על השקעה, בחר את כל ROIs, ואז לבחור Mעפרות → Multi-מדוד למדוד כל פרוסות המחסנית. יצוא נתונים לגיליון אלקטרוני לניתוח.

ניתוח Volocity 5.2

1. יבוא תמונות לתוך ספריית Volocity וליצור תמונה ברצף עם 2 ערוצים.
2. צייר אזור של עניין (ROI) באזור שבו אין תאים. בחר: כלים → יחס.
3. השתמש Volocity כדי לחשב את הרקע: קבל מהחזר על ההשקעה.
4. התאם את הסף לכלול מבני המיטוכונדריה.
5. בדקו את האפשרות להחיל LUT קשת לערוץ היחס. ערוץ עוצמת-מווסת עשוי להפיק תמונה פחות רועשת לpresenta tion, אבל זה לא צריך להיות בשימוש כדי לכמת את היחס ממוצע.
6. בחר בכרטיסייה המדידה, בחר בערוץ יחס החזר על השקעה ולצייר מסביב לאזור של עניין. מדוד את ערוץ היחס, למעט ערכים אפס. אזורים מרובים עשויים להיות נבחרו ונמדדובאותו הזמן. יצוא נתונים לגיליון אלקטרוני לניתוח.

תוצאות

מדידת מדינת חמזור המיטוכונדריה עם מיטו-roGFP

כאן, אנו מראים שיש לו מיטו-roGFP1 הטווח הדינמי כדי לזהות שינויים במצב חיזור המיטוכונדריה מחמצון מופחת באופן מלא לחיים בתאי שמרים, מבלי להשפיע על צמיחת תאי שמרים או במורפולוגיה של המיטוכונדרי...

Discussion

כאן, אנו מתארים שיטות לשימוש מיטו-roGFP1 וmitGO-ATeam2 כחיישנים ביולוגיים להערכת מצב חיזור המיטוכונדריה ורמות ה-ATP בתאים חי שמרים. אנו מוצאים את ביטוי שתוצאות פלסמיד שמקורן מיטו-roGFP1 או mitGO-ATeam בכמותית המיקוד למיטוכונדריה, ללא כל השפעה ברורה על מורפולוגיה של המיטוכונדריה או הפ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Reagents
Antimycin A	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)	1397-94-0	Dissolved in ethanol to a 2 mg/ml stock solution.
SGlyc (synthetic glycerol-based) yeast growth medium *omit for SGlyc-Ura **omit for SGlyc-Leu			Dissolve in H2O. Adjust pH to 5.5 with NaHCO3. Autoclave. Ingredients: 0.67% Yeast nitrogen base without amino acids 3% Glycerol 0.05% Glucose 2 mg/ml adenine 2 mg/ml uracil* 1 mg/ml L-arginine 1 mg/ml L-histidine 1 mg/ml L-leucine** 3 mg/ml L-lysine 2 mg/ml L-methionine 4 mg/ml L-phenylalanine 2 mg/ml L-tryptophan 3 mg/ml L-tyrosine
SC (synthetic complete, glucose-based) yeast growth medium *omit for SGlyc-Ura **omit for SGlyc-Leu			Dissolve in H2O. Adjust pH to 5.5 with NaHCO3. Autoclave. Ingredients: 0.67% Yeast nitrogen base without amino acids 3% Glucose 2 mg/ml adenine 2 mg/ml uracil* 1 mg/ml L-arginine 1 mg/ml L-histidine 1 mg/ml L-leucine** 3 mg/ml L-lysine 2 mg/ml L-methionine 4 mg/ml L-phenylalanine 2 mg/ml L-tryptophan 3 mg/ml L-tyrosine
Valap			Combine ingredients in a 1:1:1 (w:w:w) ratio. Melt by submerging in a 70 °C H2O bath. Aliquot into glass petri dishes. Store at room temperature. Ingredients: Vaseline petroleum jelly, hard paraffin, lanolin
			Equipment and Software
Precleaned Gold Seal Rite-on Micro Slides	Thomas Scientific (Swedesboro, NJ)	3050	Size: 25 x 75 mm; Thickness: 0.93 to 1.05 mm
High-performance coverslips, No. 1.5, 18x18 mm	Zeiss (Thornwood, NY)	474030-9000-000	These are less variable in thickness (170±5 μm) than standard coverslips, reducing spherical aberration and improving 3D imaging performance
Fisherbrand Microscope Cover Glass, No. 1.5	Fisher Scientific (Pittsburgh, PA)	12-545E	Size: 22 x 22 mm, No. 1.5 thickness (170 μm)
A1 laser scanning confocal microscope with spectral detector and 100x/1.49 NA Apo-TIRF objective	Nikon (Melville, NY)
AxioObserver.Z1 microscope equipped with a 100x/1.3NA EC Plan-Neofluar objective (Zeiss) and Orca ER cooled CCD camera (Hamamatsu) and controlled by Axiovision software	Zeiss (Thornwood, NY); Hamamatsu (Hamamatsu City, Japan)
Volocity 3D Image Analysis software	Perkin Elmer (Waltham, MA)		Restoration module for deconvolution; Quantitation module for ratio calculation and measurement
ImageJ software	National Institutes of Health (Bethesda, MD)		http://rsb.info.nih.gov/ij/