التقوية طويلة الأمد من المسار الثاقب-التلفيف المسنن سنبس في يتصرفون بحرية الفئران

Summary

المعدلة وراثيا وخروج المغلوب نماذج الماوس من الأمراض العصبية هي مفيدة لدراسة دور الجينات في الفسيولوجيا العصبية العادية وغير العادية. يصف هذا المقال المنهجيات التي يمكن استخدامها لدراسة التقوية طويلة الأمد، وهي آلية الخلوية التي قد تكمن وراء التعلم والذاكرة، وبالضربة القاضية في المعدلة وراثيا بحرية التصرف نماذج الماوس من أمراض الأعصاب.

Abstract

دراسات التقوية على المدى الطويل من فعالية متشابك، ظاهرة تعتمد على النشاط متشابك وجود الخصائص التي تجعلها جذابة كآلية الخلوية الكامنة التعلم وتخزين المعلومات المحتملة، منذ فترة طويلة تستخدم لتوضيح علم وظائف الأعضاء من مختلف الدوائر العصبية في الحصين، اللوزة ، والهياكل الحوفي والقشرية الأخرى. مع هذا في الاعتبار، ونماذج الماوس المعدلة وراثيا من الأمراض العصبية تمثل منصات المفيد إجراء التقوية على المدى الطويل (الكمونية) دراسات لتطوير فهم أكبر لدور الجينات في الاتصالات متشابك العادية وغير العادية في الشبكات العصبية المشاركة في التعلم، والعاطفة والمعلومات المعالجة. يصف هذا المقال منهجيات لإحداث موثوق الكمونية في الماوس يتصرف بحرية. هذه المنهجيات يمكن استخدامها في دراسات المعدلة وراثيا وخروج المغلوب يتصرف نماذج الماوس من أمراض الاعصاب بحرية.

Introduction

وقد أنتجت تطوير تكنولوجيا الجينات المعدلة وراثيا لمعالجة وخروج المغلوب نماذج الماوس من الأمراض العصبية والعصبية تقريبا. وقد استلزم هذه الترجمة من تقنيات البحث الكهربية المستخدمة سابقا في أنواع القوارض أكبر للنموذج حيواني الماوس. واحدة من هذه التقنية التحقيق العصبية هو استخدام التقوية على المدى الطويل (الكمونية) لاختبار فعالية الاتصالات متشابك داخل الشبكات العصبية المعنية في مختلف اضطرابات عصبية مرضية. يصف هذا البروتوكول تقنيات التحقيق الكهربية يمكن الاعتماد عليها من الكمونية في الفئران يتصرف بحرية. ميزة هذا البروتوكول على الآخرين هو أنه بسيطة وسهلة التنفيذ، بل هو أيضا بدلا أقل تكلفة كما أنها لا تتطلب ولا استخدام نظم مكلفة ميكرودريفي الكمبيوتر التي تسيطر عليها ولا تأثير الحقل headstages الترانزستور، و، على حد علمنا، هو البروتوكول الأول من الفيديو المزمنة التسجيلات الكهربية رس دراسة الكمونية في الفئران يتصرف بحرية. تحقيقا لهذه الغاية، وصفنا في هذه المقالة منهجيات بسيطة لدراسة التقوية على المدى الطويل في الفئران يتصرف بحرية. يمكن بسهولة أن تترجم هذه المنهجيات لنماذج الماوس المعدلة وراثيا وخروج المغلوب من اضطرابات عصبية مرضية.

Protocol

هذا البروتوكول هو مناسبة للفئران من 3 و 18 شهرا من العمر ووزن الجسم التقريبية 30-50 غ). ويمكن الحصول على الفئران من مختبر جاكسون (بار هاربور، ME). تمت الموافقة على جميع البروتوكولات الجراحية والتجريبية من قبل لجنة رعاية الحيوان واستخدام كلية ترينيتي وكانت وفقا لدليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية.

1. إعداد الحيوان والعمليات الجراحية

1. إعداد التخدير كوكتيل يحتوي على الكيتامين (25 ملغ / مل)، زيلازين (2.5 ملغ / مل) وآسيبرومازين (0.5 ملغ / مل). حقن 1 مل / كجم من وزن الجسم في الربع السفلي الأيمن من البطن تكملها 0.2 الحقن مل / كغ كل 45 دقيقة بعد ذلك للحفاظ على عمق مستقرة التخدير باستخدام دواسة منعكس الانسحاب.
2. إعداد الماوس تخدير لعملية جراحية من قبل حلق الفراء على الجمجمة وذلك باستخدام ماكينة حلاقة كهربائية. وينبغي أن تشمل منطقة حلق منتصف العينين إلى منتصف الأذنين. تأكد من عدم حلق whiskeالتمرير لأنها جزء من الجهاز الحسي الماوس برميل.
3. استخدام مسحات القطن لتطبيق ايزوبروبيل تليها بتدين إلى منطقة حلق على رأسه. ثم، أيضا باستخدام قطعة قطن، وتطبيق كمية صغيرة من الزيت المعدني على العيون لمنع مقل العيون من التجفيف.
4. استخدام الأصفاد الأذن الفئران الرضع بدلا من قضبان الأذن العادية لتركيب رأس الحيوان على جهاز التجسيمي الإطار. للقيام بذلك، جبل أول الأذن اليسرى على الكفة الأذن اليسرى. ثم تخفيف بلطف الأذن اليمنى على الكفة الحق من خلال دعم بلطف رأس الحيوان مع يد واحدة ودفع الكفة الأذن مع جهة أخرى. المقبل، ووضع وسادة التدفئة تحت جسم الحيوان وتعيينها إلى 86 درجة فهرنهايت إلى الحفاظ على درجة حرارة الجسم.
5. ثم، تحقق من صلابة الثنائية من خلال محاولة لتحريك الجانب الرأس إلى جنب. هي التي شنت هذا الحيوان بشكل صحيح على الإطار التجسيمي عند الرأس هو جامد ولا يمكن نقل جنبا إلى جنب ولكن يمكن الإرتكاز بسهولة صعودا وهبوطا.
6. راحة بلطفخطم الماوس على شريط الأنف / الأسنان التجمع والتأكد من أن القواطع ويستريح بلطف ولكن بشكل آمن داخل الفتحة الأسنان من شريط الأنف / الأسنان.
7. باستخدام مشرط معقم، وجعل شق خط الوسط بدءا من منتصف العين إلى منتصف الأذنين. تأكد من أن تعقد مشرط في زاوية 45 درجة والضغط بما فيه الكفاية لقطع طريق اللفافة الكامنة ولكن ليس من خلال الجمجمة لأن ذلك سوف يسبب النزيف.
8. استخدام مسحات القطن لفصل اللفافة وفضح الجمجمة. معالم الجمجمة bregma وامدا يجب أن تكون واضحة للعيان (الشكل 1A). تأكد من أن الحيوان هو في موقف الجمجمة المسطحة من خلال تعديل شريط الأنف / الأسنان بحيث معالم bregma وامدا هي في نفس ظهري بطني (DV) موقف (+ 0.1 ملم).
9. تنطبق على كمية صغيرة من ملحي معقم للمنطقة المكشوفة واستخدام مسحات القطن لتنظيف بلطف الجمجمة. ثم الانتظار لمدة 2-3 دقيقة الجمجمة إلى الهواء الجاف تماماقبل المتابعة.
10. جبل إبرة في الذراع التجسيمي غادر لقياس موقف DV من bregma وامدا. يجب أن تكون المواقع DV هذه المعالم اثنين في 0.1 ملم من بعضها البعض. إن لم يكن، شريط الأنف من الإطار التجسيمي يمكن تعديلها صعودا وهبوطا لتحقيق ذلك.
11. ضع الإبرة على bregma لتسجيل له في الخلفية الأمامية (ا ف ب)، الجانبي (LAT) وظهري بطني (DV) القياسات. تأكد من أن إبرة يمس فقط الجمجمة وأنها لا تخترق.
12. استخدام ماوس أطلس الدماغ، مثل "الفأر الدماغ في التجسيمي إحداثيات" ^1، لتحديد الإحداثيات للهياكل الهدف: مسار وسطي الثاقب (القسط) في حزمة الزاوي والتلفيف المسنن (DG) من الحصين، نسبة إلى امدا وbregma، على التوالي (انظر أيضا الجدول 1). ثم، استخدم قلم غرامة نقطة أو قلم رصاص بمناسبة هذه النقاط على الجمجمة.
13. أيضا، علامة اثنين المزيد من النقاط على الجانب المقابل من الجمجمة. هذه النقاط ثhich سيكون بمثابة الأرض (GND) والمرجعية (REF) ينبغي أن تكون حوالي 3 مم من خط الوسط ووضع طولي بالنسبة لبعضها البعض (1A الشكل، وأيضا الجدول 1).
14. إزالة علامة الإبرة من ذراع التجسيمي اليسار واستبدالها حفر الأسنان الكهربائية مجهزة جبل التجسيمي. ضع الحفر على كل نقطة ملحوظ وجعل الثقوب لدغ صغيرة من حوالي 0.5 ملم في القطر. عند الحفر، واستخدام الحركة صعودا ونزولا والمتكررة في كثير من الأحيان تحقق ما إذا كان الحفر قد اخترقت الجمجمة لفضح سطح الدماغ.
15. بلطف ولكن بحزم قيادة القطب المسمار (# 0-80 1/8 في براغي آلة الفولاذ المقاوم للصدأ، مشقوق الفرزة الرأس) في كل من الثقوب المقابل (GND وREF) بحيث أنها مجرد لمس السطح القشري دون اختراق ذلك (الشكل 1A ). هذه أقطاب المسمار اثنين بمثابة الأرض والمرجعية.
16. جبل محفزة وتسجيل الأقطاب الكهربائية فيأصحاب دي على الأسلحة التجسيمي اليسار واليمين، على التوالي.
17. ربط المحطات تحفيز الكهربائي إلى مشجعا الكهربية مع العزلة الحالية ومحطة القطب تسجيل لمكبر للصوت التفاضلية الكهربية (كسب = 1،000، ممر الموجة مرشح = 1 هرتز، 3 كيلو هرتز) ومن ثم إلى الذبذبات الرقمية للتفتيش البصري للاستجابات أثار. أيضا، الاتصال GND ومحطات القطب المرجع إلى مكبر للصوت التفاضلية.
18. بلطف وببطء أقل حد سواء محفزة وأقطاب تسجيل في 0.5 ملم بزيادات في حين رصد بصريا الاستجابة للمنبهات المسموعة لصدمة التحفيز من 600-800 تعميم الوصول إلى الخدمات. الاستمرار في خفض كل قطب كهربائي حتى يصلوا موقف DV هدف لكل منهما ولكن لوحظ أنه إشارة النمطية على الذبذبات (الشكل 1B).
19. بعد ذلك، استخدم الاسمنت الأسنان الاكريليك لجعل الحد الأقصى لعقد محطات الكهربائي في المكان؛ يجب أن تمحى أي الاسمنت الأسنان التي تلامس الجلد قبالةعلى الفور. مرة واحدة يتم الشفاء الاسمنت الأسنان تماما نقل الحيوان من الإطار التجسيمي إلى القوارض القفص نظيفة. استخدام مصباح التدفئة أو وسادة للحفاظ على درجة الحرارة الأساسية.
20. رصد الحيوان كل ساعة حتى يستعيد وعيه. حقنة من فلونيكسين يمكن أن تدار بمثابة مسكن.

2. الكمونية التعريفي

1. تسمح الأيام الحيوان 5-7 للتعافي من الجراحة. وضع الحيوان في البيئة تسجيل تتألف من قفص فاراداي (122 سم × 43 سم × 43 سم) تجهيزه بمواد عازلة للصوت والدورية العاكس 5 قناة ربط الكهربائي يؤدي إلى الإعداد محفزة / تسجيل.
2. السماح للحيوان حتى يتأقلم لمدة 1-2 ساعة في بيئة التسجيل قبل توصيل الأقطاب الكهربائية إلى الصكوك محفزة وتسجيل (راجع الخطوة 1.17).
3. تعيين الضوابط مشجعا لإخراج 400 تعميم الوصول إلى الخدمات وتسجيل اتساع بمتوسط ​​10 أثار ردود التأكد عشرفي لا يقل عن 10 ثانية بين مرور المحفزات. استخدام الأسلوب هو موضح في الشكل 1C لقياس استجابة أثار. كرر هذا الإجراء ل600، 800، 1،000، 1،200، 1،400 وتعميم الوصول إلى الخدمات.
4. بناء منحنى الإدخال / الإخراج بواسطة المتهم بالتآمر في متوسط ​​مدى الاستجابة أثار مقابل كثافة التحفيز. من هذه المؤامرة تحديد كثافة التحفيز الذي يتوافق مع 50٪ من الحد الأقصى لسعة قياسها. استخدام كثافة 50٪ للفترة المتبقية من التجربة.
5. ثم، وذلك باستخدام كثافة التحفيز 50٪، للحصول على خط الأساس عن طريق تسجيل متوسط ​​السعة من 5 أثار ردود كل دقيقة لمدة 15 دقيقة. جعل مرة أخرى من أن لا يقل عن 10 ثانية بين مرور المحفزات.
6. في وقت لاحق بتسليم التحفيز كزازي يتكون من 10 رشقات نارية من البقول 10 ألقاها في 400 هرتز مع معدل ابلا من 5 هرتز إلى مسار الثاقب وسطي. مراقبة الحيوانات عن كثب بحثا عن علامات على الاستيلاء، بما في ذلك يهز الكلب الرطب. إذا كان الحيوان لديه استيلاء experimينبغي إنهاؤها والأنف والحنجرة وينبغي استبعاد كافة البيانات من هذا الحيوان من نتائج الدراسة.
7. ثم، والاستمرار في تسجيل متوسط ​​السعة من 5 أثار ردود كل دقيقة لمدة 30 دقيقة posttetanization. بعد ذلك، قارن هذه السعة إلى السعة الأساسية التي تم الحصول عليها في الخطوة 2.5 عن طريق حساب نسبة التغير من الأساس (الشكل 2).
8. عقب اختتام التجارب، والموت الرحيم للحيوان عن طريق استنشاق isoflurane و-الطريقة التي هي متسقة مع المبادئ التوجيهية بشأن القتل الرحيم للجمعية الأميركية للطب البيطري.

النتائج

ويبين الجدول 1 الإحداثيات لDG والقسط كما هو مستخدم في هذا البروتوكول ويبين الشكل 1A علامات للهياكل الهدف على الجمجمة؛. أظهرت أيضا هي موقع الأقطاب الأرضية والمرجعية ويوضح الشكل 1B أثار ممثل استجابة يتتبع سواء قبل وposttetanization في نفس الحيوان. لاح?...

Discussion

في هذا البروتوكول، ونحن أثبتت طريقة موثوقة وبسيطة لدراسة الكمونية في DG في الفئران يتصرف بحرية. في حين أن العديد من الدراسات الكمونية في الفئران مستيقظا وقد أجريت ^3،4، وقد أجريت في عدد قليل جدا من الفئران مستيقظا يرجع أساسا إلى التعقيد التقني الذي يشكله العقارات...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamine (100 mg/ml)	Henry Schein	10177
Xylazine (20 mg/ml)	Henry Schein	33197
Acepromazine (10 mg/ml)	Henry Schein	2177
Dental acrylic powder	Lang Dental Manufacturing Co.	1330CLR
Dental acrylic liquid	Lang Dental Manufacturing Co.	1306CLR
Tungsten wire (0.127 mm)	World Precision Instruments	TGW0515
Stainless Steel Hypodermic Tubing (0.286 mm)	World Precision Instruments	832400
Flunixin (50 mg/ml)	Henry Schein	14165
Epoxilyte	Superior Essex	EP 6001-M
Stainless steel wire insert (0.2 mm)	World Precision Instruments	792900
Stereotaxic frame apparatus	Kopf Instruments	Model 902
Ear cuffs (ear cups)	Kopf Instruments	Model 921
Electrophysiological stimulator	Astro-Med, Inc.	S88
Digital oscilloscope	B K Precision Corp.	2542
Current isolation unit	Astro-Med, Inc.	PSIU-6
Differential amplifier	World Precision Instruments, Inc.	DAM-50
Commutator	Plastics One	SLC6
Dental drill	Stoelting	58650