Долгосрочный Потенцирование перфорантных Pathway-зубчатой ​​извилине Synapse в свободно Поступая Мышей

Резюме

Трансгенные и нокаут мышиные модели неврологических заболеваний полезны для изучения роли генов в нормальных и ненормальных нейрофизиологии. В этой статье описываются методики, которые могут быть использованы для изучения долгосрочного потенцирования, сотовый механизм, который может лежать в основе обучения и памяти, в трансгенных и нокаутом свободно себя модели мыши невропатологии.

Аннотация

Исследования долгосрочного потенцирования синаптической эффективности, зависимым от активности синаптической явление со свойствами, которые делают его привлекательным в качестве потенциального сотовой механизм, лежащий обучения и хранения информации, уже давно используются для выяснения физиологию различных нейронных цепей в гиппокампе, миндалине и другие лимбических и корковых структур. Имея это в виду, трансгенные модели мыши неврологических заболеваний представляют полезные платформы для проведения долгосрочного потенцирование (LTP) исследования в целях разработки более глубокое понимание роли генов в нормальных и ненормальных синаптической связи в нейронных сетей, участвующих в обучении, эмоций и информации обработка. В этой статье описываются методики надежно вызывая LTP в свободно ведет себя мыши. Эти методики могут быть использованы в исследовании трансгенных и нокаут свободно себя модели мыши нейродегенеративных заболеваний.

Введение

Развитие технологии манипулировать генами произвела трансгенных и нокаут модели мыши почти каждый нейродегенеративных и неврологических заболеваний. Это потребовало перевод электрофизиологических методов исследования ранее использованных в больших видов грызунов в животной модели мыши. Один из таких методов нейрофизиологические исследование является использование долговременной потенциации (LTP), чтобы проверить эффективность синаптических соединений в пределах нейронных сетей, вовлеченных в различные нейропатологических расстройств. Этот протокол описывает методы для надежной электрофизиологического исследования LTP в свободно себя мышей. Преимущество этого протокола над другими в том, что это просто и легко осуществить, это также довольно дешевле, так как не требует ни использования дорогих управляемых компьютером Microdrive систем, ни полевой транзистор головкам, и, насколько нам известно, первое видео протокол хронических Электрофизиологические записи то изучить LTP в свободно себя мышей. С этой целью мы описываем в этой статье простые методики изучения долговременную потенциацию в свободно ведут себя мышей. Эти методики могут быть легко переведены на трансгенных и нокаут мышиных моделях нейропатологических расстройств.

протокол

Этот протокол подходит для мышей 3 и 18 месяцев и приближенного массы тела 30-50 г). Мыши могут быть получены из Лаборатории Джексона (Bar Harbor, ME). Все хирургические и экспериментальные протоколы были одобрены Комитетом по Тринити-колледж уходу и использованию животных в общем и были в соответствии с Руководством по NIH по уходу и использованию лабораторных животных.

1. Подготовка животных и хирургические процедуры

1. Подготовка анестезии коктейль, содержащий кетамином (25 мг / мл), ксилазина (2,5 мг / мл) и ацепромазина (0,5 мг / мл). Введите 1 мл / кг массы тела в нижнем правом квадранте брюшной полости, дополненной 0,2 мл / кг инъекций каждые 45 мин после этого, чтобы поддерживать стабильную глубину анестезии с помощью педали вывода рефлекс.
2. Подготовка наркозом мышь для хирургии после бритья мех на его черепе с помощью электробритвы. Побрился площадь должна включать середину глаз до середины ушей. Убедитесь, что не брить whiskeRS, как они являются частью ствола мыши сенсорной системы.
3. Используйте ватные тампоны, чтобы применить изопропиловый спирт с последующим Бетадин строганого области по голове. Тогда, также используя ватные тампоны, нанесите небольшое количество минерального масла на глазах, чтобы предотвратить глазные яблоки от высыхания.
4. Используйте детские манжеты крыса уха вместо обычных баров уха смонтировать голову животного на стереотаксической рамы устройства. Чтобы сделать это, сначала установите левое ухо на левом ухе манжеты. Затем осторожно ослабить правое ухо на правое манжеты, осторожно поддерживая голову животного с одной стороны, и продвижение уха манжеты с другой стороны. Далее, поместите грелку под тела животного и установить его на 86 ° F для поддержания температуры тела.
5. Затем проверьте двустороннего жесткости, пытаясь переместить головой из стороны в сторону. Животное правильно установлен на стереотаксической рамы, когда головка является жестким и не может быть перемещен из стороны в сторону, но может легко поворачиваться вверх и вниз.
6. Аккуратно отдохнутьморда мыши на панели нос / зуб сборка убедившись, что резцы отдыхают мягко, но надежно в зубной апертурой баре нос / зуба.
7. Используя стерильный скальпель, сделать срединный разрез, начиная с середины глаза до середины ушей. Убедитесь, что скальпель состоится под углом 45 ° и применять достаточно давления, чтобы прорваться через основной фасции, но не через череп, как это вызовет чрезмерное кровотечение.
8. Используйте ватные тампоны, чтобы отделить фасции и подвергать черепа. Череп достопримечательностями брегмы и лямбда должен быть отчетливо виден (рис. 1А). Убедитесь, что животное находится в черепа плоским положение, регулируя бар нос / зуб такой, что брегмы и лямбда достопримечательности находятся на таком же дорсовентральной позиция (DV) (+ 0,1 мм).
9. Нанесите небольшое количество стерильного физиологического раствора в пораженном участке и использовать ватные тампоны, чтобы аккуратно очистить череп. Затем подождите 2-3 мин для черепа, чтобы полностью высохнуть на воздухепрежде чем продолжить.
10. Установите иглу на левом стереотаксической руку, чтобы измерить положение DV из брегмы и лямбда. DV позиционирование этих двух ориентиров должно быть в пределах 0,1 мм друг от друга. Если нет, то бар нос стереотаксической рамы можно отрегулировать вверх и вниз, чтобы добиться этого.
11. Расположите иглу на темени, чтобы записать его передне-задней (AP), боковой (LAT) и дорсовентральных (DV) измерений. Убедитесь, что игла не коснется череп и не проникает его.
12. Использовать мышь атлас мозга, такие как "мозга мыши в стереотаксической Координаты" ^1, для определения координат для целевых структур: медиальной перфорантных пути (MPP) в угловом расслоения и зубчатой ​​извилине (ГД) гиппокампа, относительно лямбда и брегма соответственно (см. также таблицу 1). Затем с помощью тонкой ручкой или карандашом, чтобы отметить эти точки на черепе.
13. Кроме того, отмечают еще две точки на противоположной стороне черепа. Эти точки шHICH будет служить землю (GND) и опорного (REF) должен быть около 3 мм от средней линии и расположены в продольном направлении относительно друг друга (рис. 1А, также табл. 1).
14. Снимите игольную маркер от левого стереотаксической руку и заменить его с электрическим бормашины, оснащенного стереотаксической горе. Расположите дрель над каждой отмеченной точке и делать небольшие заусенцев отверстия примерно 0,5 мм в диаметре. Когда бурение, использовать повторяющиеся вверх и вниз движение и проверьте часто имеет ли дрель проникли в череп подвергать поверхность мозга.
15. Осторожно, но твердо управлять винт электрода (# 0-80 1/8 в крепежных винтов из нержавеющей стали, щелевые Винт) в каждом из контралатеральных отверстия (GND и REF), что они просто коснуться поверхности коры, не проникая его (рис. 1А ). Эти два винтовых электроды служат землю и ссылки.
16. Mount стимулирующие и записи электроды в электроде держатели на левой и правой стереотаксической оружия, соответственно.
17. Подключение стимулирующий электрод клеммы для электрофизиологического стимулятора с действующим изоляции и терминалом записи электрода к электрофизиологического дифференциального усилителя (усиление = 1,000, полосовой фильтр = 1 Гц, 3 кГц), а затем цифровой осциллограф для визуального осмотра вызванных ответов. Кроме того, подключить GND и REF электродных выводов для дифференциального усилителя.
18. Аккуратно и медленно опустите одновременно стимулирующее и записи электроды с шагом 0,5 мм в то время как визуально мониторинга вызванной реакции на раздражитель шока 600-800 мкА. Продолжайте опускать каждый электрод, пока они не достигают соответствующих целевой позиции DV и стереотипное сигнал наблюдается на экране осциллографа (рис. 1В).
19. После этого используйте зубную акриловый цемент сделать крышку для хранения электродов терминалов в месте, любой зубной цемент, который соприкасается с кожей должен быть стертнемедленно. После того, как зубной цемент полностью вылечить передать животное от стереотаксической рамы на чистую клетку с грызунами. Используйте нагревательную лампу или прокладку для поддержания внутренней температуры.
20. Монитор животному каждый час, пока он не приходит в сознание. Впрыска флуниксина можно вводить в качестве анальгетика.

2. LTP индукции

1. Позволяют животному 5-7 дней, чтобы оправиться от операции. Поместите животное в среде записи, состоящей из клетки Фарадея (122 см х 43 см х 43 см), оснащенного звукоизолирующим материалом и вращающимся коммутатора 5-канального соединительного электрода приводит к установке стимулирующим / записи.
2. Разрешить животное, чтобы акклиматизироваться в течение 1-2 ч в среде записи, прежде чем подключать электроды к стимулирующих и регистрирующих приборов (см. шаг 1,17).
3. Установите регуляторы стимулятор для вывода 400 мкА и записать амплитуду в среднем на 10 вызвали ответы убедившись тыс.по меньшей мере, 10 сек пройти между стимулами. Используйте метод, показанный на рисунке 1С количественно вызванной реакции. Повторите эту процедуру для 600, 800, 1000, 1200, и 1400 мкА.
4. Построить ввода / вывода кривую, откладывая среднюю амплитуду вызванной реакции против интенсивности стимула. Из этого графика определения интенсивности стимула, который соответствует 50% от максимальной амплитуды, измеренной. Используйте интенсивность 50% на оставшуюся часть эксперимента.
5. Затем, используя интенсивность стимула 50%, получить базовые путем записи средняя амплитуда 5 вызвали ответы каждую минуту в течение 15 мин. Снова убедитесь, что по крайней мере 10 сек пройти между стимулами.
6. Впоследствии доставить тетаническое стимуляции, состоящий из 10 очередей из 10 импульсов, оказываемых на 400 Гц со скоростью серийной съемки 5 Гц до медиальной перфорантного пути. Мониторинг животного тесно признаков захвата, в том числе влажных трясет собак. Если животное имеет захват в ЭксперимЛОР должно быть прекращено и все данные из этого животного должны быть исключены из результатов исследования.
7. Тогда, продолжать запись средняя амплитуда 5 вызвали ответы каждую минуту в течение 30 мин posttetanization. После этого, сравнить эту амплитуду с базовым амплитуды, полученной на стадии 2.5, вычисляя процентное изменение по сравнению с исходным (рис. 2).
8. После завершения экспериментов, животное усыпляют с помощью ингаляции изофлурана-метода, который согласуется с Руководящими принципами по эвтаназии Американской Ветеринарной Медицинской Ассоциации.

Результаты

В таблице 1 приведены координаты для ГД и MPP, используемые в настоящем протоколе рис. 1А показывает маркировку для целевых структур на черепе;.. Также показаны расположение земельных и электродов рис. 1В иллюстрирует представитель вызвала отклик прослеживает ?...

Обсуждение

В этом протоколе, мы продемонстрировали надежный и простой метод для изучения LTP в ГД в свободно ведут себя мышей. Хотя многие исследования LTP в бодрствующих крыс были выполнены ^3,4, очень немногие из них были проведены в бодрствующих мышей в первую очередь из-за технической сложнос...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamine (100 mg/ml)	Henry Schein	10177
Xylazine (20 mg/ml)	Henry Schein	33197
Acepromazine (10 mg/ml)	Henry Schein	2177
Dental acrylic powder	Lang Dental Manufacturing Co.	1330CLR
Dental acrylic liquid	Lang Dental Manufacturing Co.	1306CLR
Tungsten wire (0.127 mm)	World Precision Instruments	TGW0515
Stainless Steel Hypodermic Tubing (0.286 mm)	World Precision Instruments	832400
Flunixin (50 mg/ml)	Henry Schein	14165
Epoxilyte	Superior Essex	EP 6001-M
Stainless steel wire insert (0.2 mm)	World Precision Instruments	792900
Stereotaxic frame apparatus	Kopf Instruments	Model 902
Ear cuffs (ear cups)	Kopf Instruments	Model 921
Electrophysiological stimulator	Astro-Med, Inc.	S88
Digital oscilloscope	B K Precision Corp.	2542
Current isolation unit	Astro-Med, Inc.	PSIU-6
Differential amplifier	World Precision Instruments, Inc.	DAM-50
Commutator	Plastics One	SLC6
Dental drill	Stoelting	58650