Langzeit-Potenzierung der perforant Pathway-Gyrus dentatus Synapse in Frei Behaving Mäuse

Zusammenfassung

Transgene und Knockout-Mausmodellen von neurologischen Erkrankungen nützlich sind für die Untersuchung der Rolle von Genen in normalen und abnormalen Neurophysiologie. Dieser Artikel beschreibt Methoden, die verwendet werden können, um Langzeit-Potenzierung, eine zelluläre Mechanismus, Lernen und Gedächtnis zugrunde liegen, in transgenen und Knockout frei verhalten Maus-Modellen der Neuropathologie studieren.

Zusammenfassung

Untersuchungen der Langzeit-Potenzierung der synaptischen Wirksamkeit, eine leistungsabhängige synaptische Phänomen mit Eigenschaften, die es attraktiv als potentielle zelluläre Mechanismus zugrunde liegende Lern-und Informationsspeicher machen, sind seit langem verwendet worden, um die Physiologie der verschiedenen neuronalen im Hippocampus, Amygdala aufzuklären und anderen limbischen und kortikalen Strukturen. In diesem Sinne, transgenen Mausmodellen für neurologische Erkrankungen stellen nützliche Plattformen, um Langzeit-Potenzierung (LTP) Studien durchzuführen, um ein besseres Verständnis der Rolle von Genen in normalen und abnormalen synaptische Kommunikation in neuronalen Netzwerken in Lernen, Emotion und Information beteiligt entwickeln Verarbeitung. Dieser Artikel beschreibt Methoden für die Induktion von LTP zuverlässig in der frei verhalten Maus. Diese Methoden können in den Studien von transgenen verwendet werden und Knockout Mausmodelle verhalten frei von neurodegenerativen Erkrankungen.

Einleitung

Die Entwicklung der Technik, um Gene zu manipulieren hat transgenen und Knockout-Mausmodellen von fast jedem neurodegenerative und neurologische Krankheiten hergestellt. Dies hat Übersetzung von elektrophysiologischen Forschungstechniken zuvor in größeren Nagetieren zur Maus-Tiermodell verwendet wird, bedingt. Ein solcher neurophysiologische Untersuchung Technik ist die Verwendung Langzeitpotenzierung (LTP), die Wirksamkeit der synaptischen Verbindungen im neuronalen Netzwerken in verschiedenen neuropathologischen Störungen beteiligt testen. Dieses Protokoll beschreibt Techniken für zuverlässige elektrophysiologische Untersuchung von LTP in frei verhalten Mäusen. Der Vorteil dieses Protokolls über andere ist, dass es einfach und leicht zu implementieren, es ist auch eher weniger kostspielig, da es weder die Verwendung von teuren computergesteuerten Mikroantriebssystems oder Feldeffekttransistor headstages erfordern, und unseres Wissens ist die erste Video-Protokoll von chronischen elektrophysiologischen Ableitungen to studieren LTP in frei verhalten Mäusen. Zu diesem Zweck beschreiben wir in diesem Artikel einfache Methoden zur Untersuchung von Langzeit-Potenzierung im frei verhalten Mäusen. Diese Methoden leicht an transgenen und Knockout-Mausmodellen der neuropathologischen Störungen übersetzt werden.

Protokoll

Dieses Protokoll ist für Mäuse von 3 und 18 Monate alt sind und die ungefähre Körpergewicht von 30-50 g) geeignet. Mäuse können von The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) bezogen werden. Alle chirurgischen und experimentelle Protokolle wurden von der Trinity College Animal Care und Verwenden Ausschuss genehmigt und wurden in Übereinstimmung mit der NIH Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren.

1. Tier Vorbereitung und chirurgische Verfahren

1. Vorbereitung Anästhesie Cocktail Ketamin (25 mg / ml), Xylazin (2,5 mg / ml) und Acepromazin (0,5 mg / ml) enthält. Spritzen 1 ml / kg Körpergewicht in der rechten unteren Quadranten des Bauches ergänzt durch 0,2 ml / kg Injektionen alle 45 min danach, eine stabile Narkosetiefe mit dem Pedal Rückzugsreflex halten.
2. Bereiten narkotisierten Maus für Chirurgie durch Rasieren das Fell auf seine Schädeldecke mit einem elektrischen Rasierer. Die rasierte Fläche sollte die Mitte der Augen auf die Mitte der Ohren umfassen. Achten Sie darauf, nicht zu rasieren Whiskers, da sie Teil des Maus-Lauf sensorischen Systems sind.
3. Verwenden Sie Wattestäbchen zu Isopropyl-Alkohol, gefolgt von Betadine auf die rasierte Fläche auf dem Kopf an. Dann auch mit Wattestäbchen, eine kleine Menge von Mineralöl auf die Augen, um die Augäpfel aus Austrocknen zu verhindern.
4. Verwenden Sie Babyratte Ohr Manschetten anstelle der normalen Ohr Bars, den Kopf des Tieres auf der stereotaktischen Rahmen Gerät zu montieren. Um dies zu tun, zuerst montieren linken Ohr am linken Ohr Manschette. Dann vorsichtig mit dem rechten Ohr auf die rechte Manschette vorsichtig unterstützt den Kopf des Tieres mit einer Hand und Förderung der Ohr-Manschette mit der anderen Hand. Als nächstes legen Sie ein Heizkissen unter den Körper des Tieres und stellen Sie es auf 86 ° C Körpertemperatur aufrecht zu erhalten.
5. Überprüfen Sie dann für bilaterale Steifigkeit durch den Versuch, den Kopf Seite zu Seite. Das Tier richtig auf dem stereotaktischen Rahmen montiert, wenn der Kopf ist starr und kann nicht bewegt Seite zu Seite, kann aber leicht nach oben und unten schwenken.
6. Sanft ruhen dieMaus Schnauze auf die Nase / Zahnstangenanordnung, sicherzustellen, dass die Schneidezähne sind sanft, aber sicher in der Zahn Öffnung der Nase / Zahnleiste ruht.
7. Mit einem sterilen Skalpell ein Mittellinienschnitt von der Mitte des Auges zu der Mitte der Ohren. Stellen Sie sicher, das Skalpell in einem 45 °-Winkel statt und gelten genügend Druck, um durch die darunterliegende Faszie, aber nicht durch den Schädel geschnitten als dass starke Blutungen verursachen.
8. Verwenden Sie Wattestäbchen, um die Blende zu trennen und setzen den Schädel. Schädel der Sehenswürdigkeiten Bregma und Lambda muss deutlich sichtbar (Abbildung 1A) sein. Stellen Sie sicher, dass das Tier in den Schädel flachen Position, indem die Nase / Zahnleiste, so dass Bregma und Lambda Wahrzeichen sind bei gleichen dorsoventraler (DV)-Position (+ 0,1 mm).
9. Eine kleine Menge steriler Kochsalzlösung auf den Bereich und verwenden Sie Wattestäbchen vorsichtig reinigen den Schädel. Dann warten Sie 2-3 Minuten für den Schädel vollständig an der Luft trocknenbevor Sie fortfahren.
10. Montieren Sie eine Nadel auf der linken stereotaktischen Arm um die DV-Position des Bregma und Lambda messen. Das DV-Positionierung dieser beiden Wahrzeichen sollte innerhalb von 0,1 mm voneinander entfernt sein. Wenn nicht, wird der Nasenleiste des stereotaktischen Rahmen nach oben und unten eingestellt werden, um dies zu erreichen.
11. Positionieren Sie die Nadel auf Bregma seiner anterior-posterioren (AP), lateral (LAT) und dorsoventralen (DV)-Messungen aufzeichnen. Seien Sie sicher, dass die Nadel gerade berührt den Schädel und nicht es zu durchdringen.
12. Verwenden Sie eine Maus Hirnatlas, wie "Gehirn der Maus in Stereotaktische Koordinaten" ^ein, um die Koordinaten für die Zielstrukturen bestimmen: medial perforant Weg (MPP) in der Winkelbündels und Gyrus dentatus (DG) des Hippocampus, bezogen auf Lambda und Bregma, bzw. (siehe auch Tabelle 1). Dann, mit einem feinen Kugelschreiber oder Bleistift, diese Punkte auf dem Schädel zu markieren.
13. Außerdem kennzeichnen zwei weitere Punkte auf der kontralateralen Seite des Schädels. Diese Punkte wird als Masse (GND) und Referenz (REF) dienen sollte etwa 3 mm von der Mittellinie angeordnet sein und in Längsrichtung relativ zueinander (Fig. 1A, Tabelle 1).
14. Entfernen Sie die Nadel Marker von links stereotaktischen Arm und ersetzen Sie es mit einem elektrischen Zahnbohrer mit einer stereotaktischen Halterung ausgestattet. Setzen Sie den Bohrer über jeden markierten Punkt und kleine Bohrlöcher von ca. 0,5 mm im Durchmesser. Beim Bohren mit einem sich wiederholenden Auf-und-Ab-Bewegung und überprüfen Sie häufig, ob der Bohrer den Schädel eingedrungen, um die Gehirnoberfläche freizulegen.
15. Sanft, aber bestimmt eine Schraube Elektrode (# 0-80 1/8 Edelstahl-Maschinenschrauben, Schlitz Rundkopf) in jedem der kontralateralen Löcher (GND und REF) zu fahren, dass sie den kortikalen Oberfläche gerade berühren, ohne ihn zu durchdringen (Abbildung 1A ). Diese beiden Schrauben Elektroden dienen als Grund-und Referenz.
16. Berg anregende und Aufzeichnungselektroden in elektrode Halter an den linken und rechten stereo Arme sind.
17. Verbinden die stimulierenden Elektrodenanschlüsse an eine elektro Stimulator mit Stromisolierung und dem Aufzeichnungselektrodenanschluss mit einem elektroDifferenzVerstärker (Verstärkung = 1.000, Bandpaßfilter = 1 Hz-3 kHz) und dann zu einem Digital-Oszilloskop zur visuellen Inspektion von evozierten Reaktionen. Außerdem verbinden GND und REF Elektrodenanschlüsse an den Differenzverstärker.
18. Sanft und langsam unteren stimulierende und Aufzeichnungselektroden in 0,5 mm-Schritten, während visuell evozierten Überwachung der Reaktion auf einen Reiz Schock von 600-800 uA. Weiterhin jede Elektrode zu senken, bis sie ihre jeweiligen DV Zielposition zu erreichen und eine stereo Signal wird auf dem Oszilloskop (1B) beobachtet.
19. Danach können Zahnacrylzement, eine Kappe zu machen, um die Elektrodenanschlüsse in Position zu halten, jede Zahnzement, die die Haut berührt, sollte abgewischt werdensofort. Sobald die Zahnzement vollständig ausgehärtet übertragen Sie die Tier aus dem stereotaktischen Rahmen für eine saubere Nagerkäfig. Verwenden Sie eine Wärmelampe oder-Pad, um die Kerntemperatur aufrecht zu erhalten.
20. Überwachung der dem Tier jede Stunde, bis er das Bewusstsein wiedererlangt. Eine Injektion von Flunixin können als Analgetikum verabreicht werden.

2. LTP Induktion

1. Lassen Sie das Tier 5-7 Tage, um sich von der Operation zu erholen. Legen Sie das Tier in der Aufnahmeumgebung, bestehend aus einem Faraday-Käfig (122 cm x 43 cm x 43 cm) mit Schallschutzmaterial ausgestattet und ein 5-Kanal-Drehkollektorverbindungs ​​die Elektrode führt zu der stimulierenden / Aufnahme-Setup.
2. Lassen Sie das Tier, um für 1-2 Stunden in der Aufnahmeumgebung, bevor Sie die Elektroden an den anregenden und Aufzeichnungsgeräten (siehe Schritt 1.17) akklimatisieren.
3. Stellen Sie die Kontrollen Stimulator zur Ausgabe 400 uA und notieren Sie die Amplitude von durchschnittlich 10 hervorgerufenen Reaktionen dafür, dass than mindestens 10 Sekunden verstreichen zwischen Reizen. Die in Abbildung 1C dargestellten Verfahren, die evozierte Reaktion zu quantifizieren. Wiederholen Sie diesen Vorgang für 600, 800, 1.000, 1.200 und 1.400 uA.
4. Konstrukt eine Eingangs / Ausgangskurve durch Auftragen der mittleren Amplitude der evozierten Reaktion gegen Reizstärke. Aus diesem Diagramm zu bestimmen, die Reizstärke auf 50% der Maximalamplitude gemessen wird, entspricht. Verwenden des 50%-Intensität für den Rest des Experiments.
5. Dann, mit 50% Reizintensität, erhalten eine Basislinie durch die Aufnahme die mittlere Amplitude von 5 evozierte jede Minute für 15 min. Wieder stellen Sie sicher, dass mindestens 10 Sekunden verstreichen zwischen Reizen.
6. Anschließend liefern die tetanische Stimulation, bestehend aus 10 Ausbrüche von 10 Impulsen bei 400 Hz mit einer Burst-Rate von 5 Hz bis der medialen perforant Weg ausgeliefert. Überwachen Sie die Tier engmaschig auf Anzeichen der Beschlagnahme, einschließlich nasser Hund schüttelt. Wenn das Tier einen Anfall hat die experiment sollte beendet werden und alle Daten von diesem Tier sollte von den Ergebnissen der Studie ausgeschlossen werden.
7. Dann weiterhin aufzeichnen die mittlere Amplitude von 5 evozierte jede Minute für 30 Minuten posttetanization. Danach Vergleichen dieses Amplitude zur Grundlinie Amplitude im Schritt 2.5 durch Berechnen der prozentualen Änderung von der Basislinie (Fig. 2) erhalten.
8. Nach Abschluss der Experimente wird das Tier durch Inhalation von Isofluran-Methode, die im Einklang mit den Leitlinien für Euthanasie von der American Veterinary Medical Association ist eingeschläfert.

Ergebnisse

Tabelle 1 zeigt die Koordinaten für DG und mPP wie in diesem Protokoll verwendet 1A zeigt die Markierungen für die Zielstrukturen auf den Schädel;.. Auch gezeigt, sind die Lage der Boden-und Referenzelektroden 1B zeigt repräsentativ hervorgerufene Reaktion zeichnet sowohl vor und posttetanization im gleichen Tier. Beachten Sie, dass die posttetanization evozierte Antwort größer als der pretetanization Antwort, die anzeigt, Induktion von LTP ² ist.

Diskussion

In diesem Protokoll haben wir eine zuverlässige und einfache Methode zur Untersuchung LTP in der GD in frei verhalten Mäusen gezeigt. Während viele Studien von LTP an wachen Ratten durchgeführt wurden ^3,4, haben nur sehr wenige an wachen Mäusen vor allem aufgrund der technischen Komplexität durch die begrenzte Hirn Immobilien in Mäusen und dem Gewicht der Elektrode headstages bezogen auf das durchschnittliche Gewicht der gestellten durchgeführt worden ⁵ Mäuse. Die wenigen Studien, die LTP ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamine (100 mg/ml)	Henry Schein	10177
Xylazine (20 mg/ml)	Henry Schein	33197
Acepromazine (10 mg/ml)	Henry Schein	2177
Dental acrylic powder	Lang Dental Manufacturing Co.	1330CLR
Dental acrylic liquid	Lang Dental Manufacturing Co.	1306CLR
Tungsten wire (0.127 mm)	World Precision Instruments	TGW0515
Stainless Steel Hypodermic Tubing (0.286 mm)	World Precision Instruments	832400
Flunixin (50 mg/ml)	Henry Schein	14165
Epoxilyte	Superior Essex	EP 6001-M
Stainless steel wire insert (0.2 mm)	World Precision Instruments	792900
Stereotaxic frame apparatus	Kopf Instruments	Model 902
Ear cuffs (ear cups)	Kopf Instruments	Model 921
Electrophysiological stimulator	Astro-Med, Inc.	S88
Digital oscilloscope	B K Precision Corp.	2542
Current isolation unit	Astro-Med, Inc.	PSIU-6
Differential amplifier	World Precision Instruments, Inc.	DAM-50
Commutator	Plastics One	SLC6
Dental drill	Stoelting	58650