JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نحن تكييفها مجموعة من البروتوكولات لقياس أنواع الاكسجين التفاعلية (ROS) التي يمكن تطبيقها في مختلف النماذج الخلوية الاميبا والثدييات للدراسات النوعية والكمية.

Abstract

تشمل أنواع الاكسجين التفاعلية (ROS) مجموعة من، المحتوية على الأوكسجين الجزيئات المتفاعلة وقصيرة الأجل، والتي interconverted أو القضاء عليها إما بشكل عفوي أو حفاز حيوي. ويرجع ذلك إلى فترات حياة قصيرة لمعظم ROS وتنوع مصادرها وتعريب التحت خلوية، ويمكن الحصول على صورة كاملة إلا من خلال قياسات حذرا باستخدام مزيج من البروتوكولات. هنا، فإننا نقدم مجموعة من ثلاثة بروتوكولات مختلفة باستخدام OxyBurst الأخضر (OBG) المغلفة الخرز، أو dihydroethidium (DHE) وAmplex UltraRed (اور)، لمراقبة النوعية والكمية ROS مختلفة في البالعات المهنية مثل Dictyostelium. نحن الأمثل حبات إجراءات طلاء وتستخدم حبات OBG المغلفة والمجهري الحية لتصور حيوي intraphagosomal الجيل ROS على مستوى خلية واحدة. حددنا عديد السكاريد الشحمي (LPS) من E. القولونية باعتباره مشجعا قويا لتوليد ROS في Dictyostelium. بالإضافة إلى ذلك، فإننا دeveloped الوقت الحقيقي، المقايسات المتوسطة الإنتاجية باستخدام DHE واور لقياس كميا الفائق داخل الخلايا وخارج الخلية H 2 O 2 الإنتاج، على التوالي.

Introduction

وتشارك أنواع الاكسجين التفاعلية (ROS) في مجموعة متنوعة واسعة من العمليات البيولوجية مثل الدفاع المضيف، إشارات، وتطوير الأنسجة واستجابة لإصابات فضلا عن ارتفاع ضغط الدم والسرطان. تحرص مدروسة phagosomal NADPH آلات أوكسيديز إلى جيل ROS السريع، والمعروفة باسم انفجار الأكسدة، لقتل البكتيريا بلعها في phagosomes العدلات '1. بالإضافة إلى ذلك، تسرب الإلكترونات كمنتج ثانوي من السلسلة التنفسية الميتوكوندريا كان يعتقد في السابق أن تكون المسؤولة الوحيدة عن مصدر غير المنظم من ROS. لكن في الآونة الأخيرة، تم التعرف عليه باعتباره آلية هامة للمساهمة في قتل البكتيريا intraphagosomal في الضامة الماوس 2. في السنوات الأخيرة، والاميبا الاجتماعية، Dictyostelium، أصبح نموذجا قوية وشعبية لدراسة آليات الجوهرية خلية من الاستجابة المناعية الفطرية. في الواقع، Dictyostelium والبالعات الإنسان مشاركة على مستوى عال من المستغرب من الحفظ في البيولوجياص الأجهزة المسؤولة عن البكتيريا الاستشعار عن بعد، مما أسفر عن مقتل والإحاطة 3،4. وhomologs من البروتينات والإنزيمات المتصلة بالإنتاج ROS أو إزالة السموم، مثل oxidases NADPH، catalases، dismutases الفائق، يمكن العثور عليها في كل من الإنسان وDictyostelium. كما الاميبا أفضل درس، Dictyostelium يقدم العديد من المزايا الفريدة على النظام النموذجي الثدييات. أنها تنمو في درجة حرارة الغرفة دون الحاجة إلى CO 2، مع مضاعفة الوقت من 8-10 ساعة. أنها يمكن أن تبقى بسهولة كما الثقافات ملتصقة أو تعليق. بالإضافة إلى ذلك، بفضل تسلسل الجينوم بالكامل والمشروح بهم فرداني، والتلاعب الجيني سهلة، أصبح Dictyostelium نموذج تجريبي جذابة للغاية الحي.

في الدراسات السابقة، ومختلف المشتقات المكلورة والمفلورة من فلوريسئين (التي تعرف باسم OxyBurst الأخضر، OBG) التي تنبعث مضان بعد الأكسدة التي كتبها ROS، وقد استخدمت كمراسلة ROS. خلية نفيذ بتوقيت شرق الولايات المتحدةوتستخدم المشتقات erified لقياس حشوية ROS، في حين تستخدم ديكستران أو مشتقات البروتين يقترن خلية impermeant لقياس خارج الخلية ROS. على وجه الخصوص، وقد تم بالفعل استخدام الخرز OBG BSA المغلفة للكشف عن إنتاج ROS phagosomal في خلايا الثدييات 5. ومع ذلك، يمكن أن النهج القائم على قارئ صفيحة ميكروسكوبية تعطي فقط بلغ متوسط ​​منحنى الجيل ROS من السكان من الخلايا. مع هذا البروتوكول، وذلك باستخدام Dictyostelium، وهو بلعمية المهنية، وتحسين ظروف تجريبية، ونحن الحصول البلعمة مستقرة وفعالة دون أي التصريف طاهية على الخرز. وقد استخدم DHE في نظم نموذج مختلف، مثل العدلات الثدييات والضامة، للكشف عن إنتاج ريوس 6-9. وفي الوقت نفسه، هناك بعض الجدل حول خصوصية وحساسية الأسلوب 8،10. بوصفها نسخة محسنة من Amplex الأحمر، وكثافة مضان من اور هي أقل حساسية لدرجة الحموضة، مما يجعله أكثر ملاءمة لقياسROS في الأوساط الحمضية أو nonneutral ضعيفة. وقد تم تطبيق اور مؤخرا في عدة أنظمة الثدييات 11،12، ولكن لم يتم الإبلاغ عن استخدامها في نماذج nonmammalian، والتي في كثير من الأحيان تتطلب وسائط النمو حمضية ضعيفة، حتى الآن. بالإضافة إلى ذلك، ليس هناك بروتوكول لنشر كميا وحيوي قياس إنتاج ريوس والتعريب في الاميبا الاجتماعية Dictyostelium.

الهدف من مجموعة قدمت من البروتوكولات هو توفير حل سهل وتنوعا لرصد مختلف ROS والتوطين، وإعطاء مزيد من ونظرة ثاقبة الآليات الخلوية المرتبطة ROS-. لفحص OBG، استخدمنا المجهر الحية لمراقبة العملية برمتها من الجيل phagosomal ROS بعد امتصاص من الخرز OBG المغلفة من قبل خلايا Dictyostelium، وقدمت نهجا جديدا لدراسة آلية القتل intraphagosomal من البكتيريا. قمنا الأمثل المتوسطة الإنتاجية وDHE اور المقايسات في Dictyostelium، لقياس superox داخل الخلايابيئة تطوير متكاملة وخارج الخلية H 2 O 2 الإنتاج، على التوالي، وذلك باستخدام LPS باعتبارها ROS مشجعا قويا. نلاحظ أن LPS وقد تبين مؤخرا لزيادة النشاط جراثيم من البكتيريا المبتلعة Dictyostelium نحو 13. بالإضافة إلى ذلك، مع العلاج DEDTC والكاتالاز أكد صراحة أن هاتين الطريقتين تحديدا قياس أنواع مختلفة وتعريب التحت خلوية من ROS في Dictyostelium. أخيرا، يمكن تكييفها مقايسة OBG إلى أي خلية أكلة ملتصقة، من خلال مزيد من opsonizing الخرز مع يغاندس لمستقبلات البلعمية من الخلايا الحيوانية. من حيث المبدأ، يمكن للDHE واور المقايسات أيضا يكون على ما يرام ضبطها لقياس في أي خلية ملتصقة أو غير ملتصق تحت ظروف تجريبية مناسبة.

Protocol

1. التصور والقياس النوعي للإنتاج ROS في Phagosomes

وينبغي إعداد حبات OBG المغلفة مقدما. يتم تكييفها حبات إجراءات طلاء وتقنية تراكب آغار من المراجع المنشورة 5،14.

  1. إضافة 1 مل تعليق 3.0 ميكرون حبات السيليكا carboxylated (حوالي 1.8 × 10 9 حبات) في أنبوب 1.5 مل، تغسل حبات 3x أخرى مع 1 مل من برنامج تلفزيوني عن طريق زيادة ونقصان سريع وvortexing ل.
  2. resuspend والخرز في 1 مل من برنامج تلفزيوني يحتوي على 25 ملغ / مل سياناميد (لتنشيط حبات السيليكا carboxylated لتساهميا ربط prelabeled BSA)، واحتضان على عجلة لمدة 15 دقيقة.
  3. غسل 3X مع 1 مل من العازلة اقتران (0.1 بورات الصوديوم M، ودرجة الحموضة 8.0) من خلال الدوران السريع (أجهزة الطرد المركزي بسرعة كاملة في أعلى الجدول الطرد المركزي لمدة 5 ثوانى صغيرة أو بدلا من أجهزة الطرد المركزي في 2000 x ج لمدة 1 دقيقة في أعلى الجدول الطرد المركزي) و vortexing للإزالة سياناميد الزائدة.
  4. مزج الخرز غسلها مع 500 ميكرولتر من جoupling العازلة التي تحتوي على 1 ملغ من OxyBurst الأخضر (OBG) H2HFF (ثنائي هيدرو-2 '، 4،5،6،7،7' hexafluorofluorescein) BSA، وملء الأنبوب مع غاز النيتروجين من معيار الغاز يمكن قبل متوجا، و احتضان على عجلة لمدة 14 ساعة (بين عشية وضحاها) في RT في الظلام.
  5. تغسل حبات 2X مع 1 مل من التبريد العازلة (250 ملي glycin في برنامج تلفزيوني) لإزالة غير المتفاعل OBG، ومرتين مع العازلة اقتران لإزالة المخزن المؤقت التبريد عن طريق زيادة ونقصان سريع وvortexing ل.
  6. إضافة 1 مل من العازلة اقتران يحتوي على 50 ميكروغرام من اليكسا فلور 594 succinimidyl استر لتصريف لجيش صرب البوسنة. ملء الأنبوب مع النيتروجين قبل متوجا، واحتضان على عجلة ل1.5 ساعة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
  7. تغسل حبات 3x أخرى مع 1 مل من العازلة تدور التبريد السريع وvortexing للوقف رد الفعل، ثم تغسل حبات 3x أخرى مع 1 مل من برنامج تلفزيوني عن طريق زيادة ونقصان سريع وvortexing ل.
  8. أخيرا، resuspend والخرز في 1 مل من برنامج تلفزيوني مع 2 ميكرولتر من 10٪ ث / ت أزيد للتخزين على المدى الطويل. قياس concentratioن من الخرز في التعليق مع عدادة الكريات (عادة حوالي 1-2 × 10 9 حبات / مل)، وملء الأنبوب مع النيتروجين قبل متوجا، وتخزينها في 4 درجات مئوية في الظلام.
  9. كفاءة الطلاء من فلوريسئين OBG يمكن اختبارها عن طريق التحقق من طيف الانبعاث باستخدام الإثارة في 500 نانومتر. عندما تتأكسد بواسطة H 2 O 2 في وجود الفجل البيروكسيداز (HRP)، كثافة مضان من الخرز أكسدة، في ذروة الانبعاثات (538 نانومتر)، هو 11-12X أعلى من حبات المغلفة nonoxidized.
  10. حصاد الخلايا المتنامية باطراد Dictyostelium من طبق بتري 10 سم، لوحة كثافات مختلفة من الخلايا على 3 سم مع الأطباق البلاستيك واضحة بصريا أو أسفل الزجاج، وتنمو عليها بين عشية وضحاها. اختيار الأطباق التي هي حوالي 80٪ متموجة للتجربة. وقد تم نشر بروتوكول مفصلة لزراعة الخلايا Dictyostelium 15.
  11. استبدال مستنبت مع LoFlo المتوسطة (LF المتوسطة)، واحتضان ل2 ساعة قبل التجربة من أجل تقليل تألق ذاتي خارج الخلية وintraendosomal من مستنبت HL5C.
  12. في موازاة ذلك، تذوب 10 مل 1.5٪ في المتوسط ​​bacto أجار LF، صب أجار على سطح مستو (أي لوحة من الزجاج 10 سم × 10 سم) من أجل تشكيل طبقة أجار حوالي 1 مم، وانتظر لمدة 10-15 دقيقة ليصلب. قطع طبقة أجار إلى 2 سم × 2 سم مربع ومكان في LF المتوسطة لاستخدامها لاحقا.
  13. وفي الوقت نفسه، وإعداد الغزل القرص أو المجهر حقل واسع، تعيين درجة حرارة الغرفة البيئية عند 22 درجة مئوية، وضبط الإعدادات لهذه التجربة. (انظر تعليقات إضافية في المناقشة).
  14. بعد 2 ساعة من الحضانة، نضح المتوسطة LF من 3 سم الطبق، ولكن لا يزال ينبغي أن تغطي أحادي الطبقة الخلية عن طريق طبقة رقيقة من المتوسط. تمييع حبات المغلفة إلى 1.5 × 10 7 حبات / مل، وإضافة 10 ميكرولتر على طبقة الخلايا.
  15. تأخذ ورقة واحدة أجار مربع، واستنزاف السوائل الزائدة ولكن يبقى الرطب. وضع بلطف عشره أجار مربع على أعلى من طبقة الخلايا. لا تتحرك الساحة أجار عندما يكذب على الخلايا. يتم استخدام تراكب آغار لزيادة الاتصال بين الخلايا والخرز، وبالتالي تحسين امتصاص، وأيضا الكمادات قليلا من الخلايا، وحفظ لهم أفضل في المستوى البؤري للهدف.
  16. وضع غطاء على طبق، ووضعه على المسرح المجهر، والتقاط الصور تلقائيا في قنوات الأحمر والأخضر ومرحلة كل 1 دقيقة لمدة 2 ساعة أو أكثر.
  17. تحديد والتركيز على الأحداث الخلوية التي تحتوي على كامل عملية البلعمة. دمج الأمثل 3 قنوات وتجميع الصور في الفيلم باستخدام المهنية برامج معالجة الصور. قياس كثافة مضان من كل حبات مختارة في قنوات الأحمر والأخضر، وسوف نسبة أخضر / أحمر تعكس ديناميكية phagosomal ROS إنتاج الخلايا.

2. القياس الكمي والمتوسطة مرت من بين الخلايا الأكسيد الإنتاج

  1. جمع سشمال شرق 80٪ طبق متموجة من Dictyostelium في 10 مل من HL5C المتوسط. خلايا الطرد المركزي في 850 x ج Dictyostelium لمدة 5 دقائق، ونضح بعناية تماما المتوسطة الزائدة. Resuspend الخلايا في المخزن SS6.4 [0.12 M السوربيتول في المخزن سورنسن (14.69 ملي KH 2 PO 4 و 6.27 ملي نا 2 هبو 4)، ودرجة الحموضة 6.4]، عد الخلايا وتمييع لكثافة النهائي من 6 × 10 6 خلية / مل (انظر تعليقات إضافية في المناقشة).
  2. إضافة 50 ميكرولتر من تعليق خلية في كل بئر من لوحة بيضاء غير شفافة 96 كذلك (انظر تعليقات إضافية في المناقشة).
  3. تمييع DHE الأسهم (30 ملم في DMSO) 500 أضعاف مع SS6.4، ماصة 50 ميكرولتر من المخفف DHE في كل بئر باستخدام ماصة الأقنية إذا لزم الأمر. تركيز النهائي من 30 ميكرومتر DHE هو. يبدأ رد فعل على الفور.
  4. محفزات أو مثبطات يمكن أن تضاف في هذه المرحلة، أو في نقاط زمنية أخرى وفقا لاحتياجات محددة.
  5. استخدام نقطة نهاية "رأس القراءة & #34؛ طريقة قارئ مضان صفيحة ميكروسكوبية، مع مضان الإثارة / الانبعاثات في 522 nm/605 نانومتر، وقراءة كل 2 دقيقة لمدة 1 ساعة، هزة متوسطة 5 ثانية / دقيقة، في 22 درجة مئوية.

3. الكمي وقياس إنتاجية عالية من خارج الخلية H 2 O 2 الإنتاج

  1. اتبع نفس الخطوات كما هو موضح في 2.1 و 2.2.
  2. إعداد HRP المخفف عن طريق إضافة 5 ميكرولتر من الأسهم HRP (100 U / مل في الماء المقطر) في 10 مل من SS6.4، دوامة أو عكس الأنبوب لتخلط جيدا والحفاظ على الجليد لاستخدامها لاحقا. الحل هو في HRP المخفف 0.05 U / مل.
  3. إعداد خليط التفاعل اور عن طريق خلط الأوراق المالية اور (10 ملي اور في DMSO) والحل HRP المخفف في عازلة SS6.4 إلى تركيزات النهائي من 6.25 ميكرومتر، و0.005 U / مل، على التوالي. كمثال، لإعداد خليط التفاعل لمدة 40 ردود الفعل، ومزيج 1600 ميكرولتر من SS6.4 ب 400 ميكرولتر من برنامج الصحة الإنجابية المخفف و 2.5 ميكرولتر من محلول المخزون AUR.
  4. إضافة 50 ميكرولتر من مزيج اورتلح في كل بئر باستخدام ماصة الأقنية إذا لزم الأمر. الآن يبدأ التفاعل.
  5. محفزات أو مثبطات يمكن أن تضاف في هذه المرحلة، أو في نقاط زمنية أخرى وفقا لاحتياجات محددة.
  6. استخدام نقطة وضع نهاية "القراءة أعلى" من مضان قارئ لوحة صغيرة، مع مضان الإثارة / الانبعاثات في 530 نانومتر nm/590، وقراءة كل 2 دقيقة لمدة 1 ساعة، هزة متوسطة 5 ثانية / دقيقة، في 22 درجة مئوية.

النتائج

توليد ROS في phagosomes يمكن تصور نوعيا وبشكل حيوي بواسطة المجهر (S1 ملف). مضان أحمر المنبعثة من اليكسا فلور 594 هو الرقم الهيدروجيني حساسة ويبقى ثابتا في البيئة phagosomal، في حين أكسدة OBG يزيد مضان في قناة خضراء. أطياف انبعاث أكسدة في المختبر وتتم مقارنة nonoxidized الخرز ...

Discussion

بالمقارنة مع الأساليب المذكورة سابقا، وفحص OBG يتصور حيوي في عملية phagosomal الجيل ROS على مستوى خلية واحدة، بدلا من قياس متوسط ​​إشارة ROS من السكان من الخلايا. مثل هذه الأساليب السكان المتوسط ​​تميل إلى حجب المعلومات الهامة التي تسببها البلعمة nonsynchronous. نحن تكييفها بنجاح...

Disclosures

أعلن عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

نحن ممتنون لالدكاترة كارل هاينز كراوس وفنسنت JAQUET طلبا للمساعدة والمشورة لإعداد هذه البروتوكولات، ونشكر أيضا كريستوف باور وجيروم Bosset من منهاج Bioimaging من NCCR والدكتور نافين Gopaldass للحصول على الدعم التقني. ويدعم هذا البحث من خلال منحة ProDoc من مؤسسة العلوم الوطنية السويسرية.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
REAGENTS
OxyBURST Green H2HFF BSAInvitrogenO-13291
Alexa Fluor 594InvitrogenA-20004
Carboxylated silica beadsKisker BiotechPSi-3.0COOH
HL5C mediumForMediumHLC0102
LoFlo mediumForMediumLF1001
Bacto agarBD204010
DihydroethidiumSigma37291-25MG
Amplex UltraRedInvitrogenA36006
Horseradish peroxidaseRoche10108090001
Diethyldithiocarbamate (DEDTC)SigmaD3506-100G
CatalaseSigmaC9322-1G
CyanamideSigma187364-25G
LipopolysaccharidesSigmaL2630-25G
EQUIPMENT
ibidi μ-Dish 35 mm, highibidi81156Bottom made of optically clear plastic
MatTek dish 35 mmMatTek corporationP35G-1.5-14-CBottom made of a glass coverslip
Scepter Cell CounterMerck MilliporePHCC00000
White 96 well plateNunc236108
CentrifugeSORVALLLegend RT
Microplate readerBioTekSynergy Mx

References

  1. Bedard, K., Krause, K. H. The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: physiology and pathophysiology. Physiol. Rev. 87, 245-313 (2007).
  2. West, A. P., et al. TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS. Nature. 472, 476-480 (2011).
  3. Fey, P., Gaudet, P., Pilcher, K. E., Franke, J., Chisholm, R. L. dictyBase and the Dicty Stock Center. Methods Mol. Biol. 346, 51-74 (2006).
  4. Basu, S., et al. dictyBase 2013: integrating multiple Dictyostelid species. Nucleic Acids Res. 41, 676-683 (2013).
  5. VanderVen, B. C., Yates, R. M., Russell, D. G. Intraphagosomal measurement of the magnitude and duration of the oxidative burst. Traffic. 10, 372-378 (2009).
  6. Cohn, C. A., Simon, S. R., Schoonen, M. A. Comparison of fluorescence-based techniques for the quantification of particle-induced hydroxyl radicals. Part. Fibre Toxicol. 5, 2 (2008).
  7. Snyrychova, I., Ayaydin, F., Hideg, E. Detecting hydrogen peroxide in leaves in vivo - a comparison of methods. Physiol. Plant. 135, 1-18 (2009).
  8. Rodrigues, J. V., Gomes, C. M. Enhanced superoxide and hydrogen peroxide detection in biological assays. Free Radic. Biol. Med. 49, 61-66 (2010).
  9. Chen, J., Rogers, S. C., Kavdia, M. Analysis of Kinetics of Dihydroethidium Fluorescence with Superoxide Using Xanthine Oxidase and Hypoxanthine Assay. Ann. Biomed. Eng. , (2012).
  10. Lee, C. W., Chen, Y. C., Ostafin, A. The accuracy of Amplex Red assay for hydrogen peroxide in the presence of nanoparticles. J. Biomed. Nanotechnol. 5, 477-485 (2009).
  11. Guimaraes-Ferreira, L., et al. Short-term creatine supplementation decreases reactive oxygen species content with no changes in expression and activity of antioxidant enzymes in skeletal muscle. Eur. J. Appl. Physiol. 112, 3905-3911 (2012).
  12. Peng, D., et al. Glutathione peroxidase 7 protects against oxidative DNA damage in oesophageal cells. Gut. 61, 1250-1260 (2012).
  13. Walk, A., et al. Lipopolysaccharide enhances bactericidal activity in Dictyostelium discoideum cells. Dev. Comp. Immunol. 35, 850-856 (2011).
  14. Fukui, Y., Yumura, S., Yumura, T. K. Agar-overlay immunofluorescence: high-resolution studies of cytoskeletal components and their changes during chemotaxis. Methods Cell Biol. 28, 347-356 (1987).
  15. Fey, P., Kowal, A. S., Gaudet, P., Pilcher, K. E., Chisholm, R. L. Protocols for growth and development of Dictyostelium discoideum. Nat. Protoc. 2, 1307-1316 (2007).
  16. Bloomfield, G., Pears, C. Superoxide signalling required for multicellular development of Dictyostelium. J. Cell. Sci. 116, 3387-3397 (2003).
  17. Dieckmann, R., Gopaldass, N., Escalera, C., Soldati, T., Deretic, V. Autophagosomes and Phagosomes. Methods in Molecular Biology. 445, 317-328 (2008).
  18. Amir, Y., Edward, O. -. A., Utpal, B. A protocol for in vivo detection of reactive oxygen species. Proto. Exch. , (2008).
  19. Neuhaus, E. M., Soldati, T. A myosin I is involved in membrane recycling from early endosomes. J. Cell Biol. 150, 1013-1026 (2000).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

81 OxyBurst Carboxylated Dihydroethidium Amplex UltraRed Dictyostelium discoideum

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved