Individuare, visualizzare e quantificare la generazione di specie reattive dell'ossigeno in un modello di sistema di Amoeba

Riepilogo

Abbiamo adattato una serie di protocolli per la misurazione delle specie reattive dell'ossigeno (ROS) che possono essere applicate in vari modelli cellulari amebe e di mammifero per studi qualitativi e quantitativi.

Abstract

Le specie reattive dell'ossigeno (ROS) comprendono una gamma di molecole contenenti ossigeno reattive e di breve durata, che sono interconvertiti o eliminati sia catalitica o spontaneamente in modo dinamico. A causa delle brevi durate di più ROS e la diversità delle loro fonti e localizzazioni subcellulari, un quadro completo può essere ottenuto solo da misure accurate utilizzando una combinazione di protocolli. Qui, vi presentiamo una serie di tre protocolli diversi con OxyBurst Green (OBG) rivestite perline, o dihydroethidium (DHE) e Amplex Ultrared (AUR), di monitorare qualitativamente e quantitativamente diversi ROS in fagociti professionali come Dictyostelium. Abbiamo ottimizzato le perline procedure di rivestimento e perle di OBG rivestite occasione e la microscopia diretta di visualizzare dinamicamente intraphagosomal generazione di ROS a livello di singola cellula. Abbiamo identificato lipopolisaccaride (LPS) da E. coli come stimolatore potente per la generazione di ROS in Dictyostelium. Inoltre, Dtempo reale eveloped, saggi medio-throughput utilizzando DHE e AUR per misurare quantitativamente superossido intracellulare ed extracellulare H ₂ O ₂ produzione, rispettivamente.

Introduzione

Le specie reattive dell'ossigeno (ROS) sono coinvolti in una vasta gamma di processi biologici quali la difesa ospite, la segnalazione, lo sviluppo del tessuto e la risposta al danno, così come l'ipertensione e il cancro. Il macchinario ossidasi phagosomal NADPH ben studiato è dedicato alla generazione di ROS rapido, conosciuto come il burst ossidativo, per uccidere i batteri ingeriti in phagosomes neutrofili ^'1. Inoltre, la perdita di elettroni come sottoprodotto della catena respiratoria mitocondriale è stato precedentemente ritenuto responsabile solo per una fonte regolamentata di ROS. Ma di recente, è stato identificato come un importante meccanismo per contribuire all'uccisione intraphagosomal dei batteri nei macrofagi del mouse ^2. Negli ultimi anni, l'ameba sociale, Dictyostelium, è diventata un modello potente e popolare per studiare i meccanismi cellulari intrinseche della risposta immunitaria innata. Infatti, Dictyostelium e fagociti umani condividono un sorprendentemente elevato livello di conservazione in moleculamacchinari r responsabili per i batteri rilevamento, fagocitazione e uccidendo ^3,4. Gli omologhi di proteine ​​ed enzimi legati alla produzione di ROS o di detossificazione, come ossidasi NADPH, catalasi, superossido dismutasi, possono essere trovati in umano e Dictyostelium. Come l'ameba più studiato, Dictyostelium presenta diversi vantaggi unici rispetto sistema modello mammiferi. Crescono a temperatura ambiente senza la necessità di CO _2, con un tempo di raddoppio di 8-10 ore. Possono essere facilmente mantenute come colture aderenti o sospensione. Inoltre, grazie alla loro genoma aploide completamente sequenziato e annotato, e alla manipolazione genetica facile, Dictyostelium è diventata una molto attraente sperimentale organismo modello.

In studi precedenti, vari derivati ​​clorurati e fluorurati di fluoresceina (collettivamente noti come OxyBurst verde, OBG) che emettono fluorescenza dopo ossidazione da ROS, sono stati utilizzati come reporter ROS. Cell-permeante estDerivati ​​erified vengono utilizzati per misurare citoplasmatica ROS, che destrano-o derivati ​​cellule impermeant accoppiati a proteine ​​sono utilizzati per misurare extracellulare ROS. In particolare, perline OBG BSA-rivestite sono già stati utilizzati per rilevare phagosomal produzione di ROS in cellule di mammifero ^5. Tuttavia, l'approccio lettore-su micropiastra può solo dare una curva di generazione di ROS mediata da una popolazione di cellule. Con la presente protocollo base Dictyostelium, un fagocita professionale, e le condizioni sperimentali ottimizzate, otteniamo fagocitosi stabile ed efficiente senza coniugando qualsiasi opsonina sulle perline. DHE è stato utilizzato in vari sistemi modello, come neutrofili e macrofagi mammiferi, per rilevare la produzione di ROS ^6-9. Nel frattempo, vi sono alcune controversie sulla specificità e sensibilità del metodo ^8,10. Come una versione migliorata del Amplex Red, l'intensità di fluorescenza di RUA è meno sensibile al pH, che lo rende più adatto da misurareROS in ambienti nonneutral o debolmente acide. AUR è stato recentemente applicato in diversi sistemi di mammifero ^11,12, ma il suo uso in modelli non mammiferi, che spesso richiedono mezzi di crescita debolmente acido, non è stato ancora riportato. Inoltre, non esiste un protocollo pubblicato per quantitativamente e dinamicamente misurare la produzione di ROS e la localizzazione nel ameba sociale Dictyostelium.

L'obiettivo del set di protocolli presentato è quello di fornire una soluzione semplice e versatile per il controllo di diversi ROS e la loro localizzazione, e in seguito invia intuizioni meccanismi cellulari ROS-correlati. Per il saggio OBG, abbiamo usato la microscopia diretta a monitorare l'intero processo di generazione phagosomal ROS, dopo l'assorbimento di perline OBG rivestite da cellule di Dictyostelium, e fornito un nuovo approccio per studiare il meccanismo di uccisione intraphagosomal dei batteri. Abbiamo ottimizzato medio-throughput DHE e AUR saggi in Dictyostelium, per misurare superox intracellulareide extracellulare e H ₂ O ₂ produzione, rispettivamente, utilizzando LPS come un potente stimolatore ROS. Si noti che LPS è stato recentemente mostrato di aumentare l'attività battericida del Dictyostelium verso batteri fagocitati ^13. Inoltre, il trattamento con DEDTC e catalasi esplicitamente confermato che questi due metodi specificamente misurano diversi tipi e localizzazioni subcellulari di ROS in Dictyostelium. Infine, il saggio OBG può essere adattato a qualsiasi cellula fagocitica aderente per ulteriori opsonizzare le perline con ligandi per recettori di fagocitosi di cellule animali. In linea di principio, i saggi DHE e AUR può anche essere ottimizzati per misure in qualsiasi cella aderenti o non aderenti sotto appropriate condizioni sperimentali.

Protocollo

1. Visualizzazione e misurazione qualitativa del ROS Produzione in fagosomi

Le perle OBG-rivestite devono essere preparati in anticipo. Le procedure di rivestimento perline e la tecnica di sovrapposizione agar sono adattati dai riferimenti pubblicati ^5,14.

1. Aggiungere 1 ml di sospensione di 3,0 micron sfere di silice carbossilati (circa 1,8 x 10 ⁹ sfere) in una provetta da 1,5 ml, lavare le perle 3x con 1 ml di PBS da giro veloce e vortex.
2. Risospendere le sfere in 1 ml di PBS contenente 25 mg / ml cianammide (per attivare le perle di silice carbossilati di legarsi in modo covalente prelabeled BSA), incubare su una ruota per 15 minuti.
3. Lavare 3x con 1 ml di tampone di accoppiamento (0,1 M borato di sodio, pH 8,0) mediante rotazione rapida (centrifugare a piena velocità in una mini centrifuga da tavolo per 5 sec oppure centrifugare a 2000 xg per 1 minuto in una centrifuga da tavolo) e vortex per rimuovere l'eccesso cyanamide.
4. Mescolare le perline lavati con 500 ml di coupling tampone contenente 1 mg di OxyBurst Green (OBG) H2HFF (diidro-2 ', 4,5,6,7,7'-hexafluorofluorescein)-BSA, riempire il tubo con gas di azoto da un gas-can standard prima tappatura, e incubare su una ruota per 14 ore (una notte) a temperatura ambiente al buio.
5. Lavare le perline 2x con 1 ml di tampone di tempra (250 mM glicina in PBS) per rimuovere reagito OBG, e due volte con tampone di accoppiamento per rimuovere il tampone quenching dalla rotazione veloce e vortex.
6. Aggiungere 1 ml di tampone di accoppiamento contenenti 50 mg di Alexa Fluor 594 succinimidyl estere di coniugare al BSA. Riempire il tubo con azoto prima del livellamento, e incubare su una ruota per 1,5 ore a temperatura ambiente al buio.
7. Lavare le perline 3x con 1 ml di tempra buffer giro veloce e vortex per fermare la reazione, poi lavare le perle 3x con 1 ml di PBS da giro veloce e vortex.
8. Infine, risospendere le sfere in 1 ml di PBS con 2 ml di 10% w / v azide per conservazione a lungo termine. Misurare la concentration di perline in sospensione con un emocitometro (solitamente intorno 1-2 x 10 ⁹ perline / ml), riempire il tubo con azoto prima del livellamento, e conservare a 4 ° C al buio.
9. L'efficienza del rivestimento della fluoresceina OBG può essere verificata controllando lo spettro di emissione con eccitazione a 500 nm. Quando ossidato da H ₂ O ₂ in presenza di perossidasi di rafano (HRP), l'intensità di fluorescenza di perline ossidati, al picco di emissione (538 nm), è 11-12x superiore a quella di perline rivestite nonoxidized.
10. Harvest esponenziale crescita delle cellule Dictyostelium da un piatto di 10 centimetri Petri, piastra diverse densità di celle su tre centimetri piatti con un materiale plastico otticamente trasparente o con fondo di vetro, e crescere durante la notte. Scegli i piatti che sono circa l'80% confluenti per l'esperimento. Un protocollo dettagliato per la coltivazione di cellule di Dictyostelium è stato pubblicato ^{il 15.}
11. Sostituire il terreno di coltura con LoFlo medio (LF), incubare per2 ore prima dell'esperimento al fine di diminuire l'autofluorescenza extracellulare e intraendosomal del terreno di coltura HL5C.
12. Parallelamente, sciogliere 10 ml 1,5% Bacto agar in mezzo LF, versare l'agar su una superficie piana (cioè una lastra di vetro di 10 cm x 10 cm) in modo da formare uno strato di agar dello spessore di circa 1 mm attendere 10-15 min a solidificare. Tagliare lo strato di agar in 2 cm x 2 centimetri quadrati e posto in LF medio per un uso successivo.
13. Nel frattempo, preparare la filatura-disk o microscopio a campo largo, impostare la temperatura della camera ambientale a 22 ° C e regolare le impostazioni per questo esperimento. (Vedi ulteriori commenti nella discussione).
14. Dopo 2 ore di incubazione, aspirare il terreno LF dal piatto 3 cm, ma il monostrato cellulare dovrebbe ancora essere coperta da una pellicola sottile di supporto. Diluire le perle rivestite da 1,5 x 10 ⁷ perline / ml e aggiungere 10 ml sullo strato di cellule.
15. Prendete un foglio agar quadrato, drenare i liquidi in eccesso, ma mantenere bagnato. Mettere delicatamente the agar quadrato sulla parte superiore dello strato di cellule. Non spostare la piazza agar quando è sdraiato sulle cellule. L'agar molle viene utilizzato per aumentare il contatto tra le perle e cellule, migliorando così l'assorbimento, ed inoltre comprime leggermente le cellule, mantenendoli meglio nel piano focale dell'obiettivo.
16. Mettere il coperchio sul piatto, posizionarlo sul palco microscopio, e automaticamente scattare foto nei canali rosso, verde e fase ogni 1 min per 2 ore o più.
17. Selezionare e concentrarsi su eventi cellulari che contengono l'intero processo di fagocitosi. Unire i 3 canali ottimizzati e assemblare le immagini in un filmato utilizzando software professionale di elaborazione delle immagini. Quantificare intensità di fluorescenza di ciascun perline selezionati canali rosso e verde, e il rapporto di verde / rosso rifletterà la phagosomal dinamica ROS produzione delle cellule.

2. Throughput medio quantitativa e misurazione dei intracellulare Superossido Produzione

1. Raccogliere one 80% piatto confluenti di Dictyostelium in 10 ml di terreno HL5C. Cellule Centrifuga Dictyostelium a 850 xg per 5 minuti, con attenzione e completamente aspirare eccesso di terreno. Risospendere le cellule in tampone SS6.4 [0.12 M sorbitolo in tampone Sorensen (14,69 mM KH ₂ PO ₄ e 6,27 mM Na ₂ HPO _4), pH 6,4], contare le celle e diluire ad una densità finale di 6 x 10 ⁶ cellule / ml (vedi ulteriori commenti nella discussione).
2. Aggiungere 50 ml di sospensione cellulare in ciascun pozzetto di una non trasparente 96 pozzetti bianco (vedi ulteriori commenti nella discussione).
3. Diluire DHE magazzino (30 mM in DMSO) 500 volte con SS6.4, pipetta 50 ml di DHE diluito in ciascun pozzetto utilizzando una pipetta multicanale, se necessario. La concentrazione finale di DHE è di 30 micron. La reazione inizia immediatamente.
4. Stimoli o inibitori possono essere aggiunti a questo punto, o in altri punti temporali in funzione delle esigenze specifiche.
5. Utilizzare il punto "top lettura & # end34; modalità di un lettore di fluorescenza per micropiastre, con fluorescenza eccitazione / emissione a 522 nm nm/605, letto ogni 2 min per 1 ora, medio shake 5 sec / min, a 22 ° C.

3. Quantitativa e High Throughput Misura della extracellulare H ₂ O ₂ Produzione

1. Seguire gli stessi passi descritti in 2.1 e 2.2.
2. Preparare HRP diluita con l'aggiunta di 5 ml di HRP magazzino (100 U / ml in acqua distillata) in 10 ml di SS6.4, vortex o capovolgere la provetta per mescolare bene e tenere in ghiaccio per un uso successivo. La soluzione di HRP diluita è di 0,05 U / ml.
3. Preparare la miscela di reazione AUR miscelando il magazzino AUR (AUR 10 mM in DMSO) e la soluzione di HRP diluita in tampone SS6.4 alle concentrazioni finali di 6,25 mM, e 0.005 U / ml, rispettivamente. A titolo di esempio, per preparare la miscela di reazione per 40 reazioni, mescolare 1.600 ml di SS6.4 con 400 ml di HRP diluita e 2,5 ml di soluzione madre AUR.
4. Aggiungere 50 ml di mix AURTure in ogni pozzetto usando una pipetta multicanale, se necessario. Ora la reazione si inneschi.
5. Stimoli o inibitori possono essere aggiunti a questo punto, o in altri punti temporali in funzione delle esigenze specifiche.
6. Utilizzare il punto finale modalità "lettura top" di un lettore di fluorescenza piatto micro, con fluorescenza di eccitazione / emissione a 530 nm nm/590, leggere ogni 2 min per 1 ora, medio scossa 5 sec / min, a 22 ° C.

Risultati

La generazione di ROS in fagosomi può essere visualizzato qualitativamente e dinamicamente mediante microscopia (S1 File). La fluorescenza rossa emessa da Alexa Fluor 594 è pH-sensibile e rimane costante nell'ambiente phagosomal, mentre l'ossidazione di OBG aumenta la fluorescenza nel canale verde. Gli spettri di emissione di in vitro ossidato e perline OBG rivestite nonoxidized sono confrontati in Figura 1B, mostrando un significativo aumento di intensità dopo l'...

Discussione

Rispetto ai metodi precedentemente descritti, il saggio OBG visualizza dinamicamente il processo di phagosomal generazione di ROS a livello di singola cellula, invece di misurare un segnale medio ROS da una popolazione di cellule. Tali metodi popolazione calcolo della media tendono a oscurare le informazioni critiche causate dalla fagocitosi nonsynchronous. Abbiamo adattato con successo DHE e AUR saggi di Dictyostelium e ottimizzato i protocolli. Soprattutto, abbiamo specificato i tipi e localizzazioni subcellu...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
OxyBURST Green H2HFF BSA	Invitrogen	O-13291
Alexa Fluor 594	Invitrogen	A-20004
Carboxylated silica beads	Kisker Biotech	PSi-3.0COOH
HL5C medium	ForMedium	HLC0102
LoFlo medium	ForMedium	LF1001
Bacto agar	BD	204010
Dihydroethidium	Sigma	37291-25MG
Amplex UltraRed	Invitrogen	A36006
Horseradish peroxidase	Roche	10108090001
Diethyldithiocarbamate (DEDTC)	Sigma	D3506-100G
Catalase	Sigma	C9322-1G
Cyanamide	Sigma	187364-25G
Lipopolysaccharides	Sigma	L2630-25G
EQUIPMENT
ibidi μ-Dish 35 mm, high	ibidi	81156	Bottom made of optically clear plastic
MatTek dish 35 mm	MatTek corporation	P35G-1.5-14-C	Bottom made of a glass coverslip
Scepter Cell Counter	Merck Millipore	PHCC00000
White 96 well plate	Nunc	236108
Centrifuge	SORVALL	Legend RT
Microplate reader	BioTek	Synergy Mx