Обнаружение, Визуализация и количественного генерации активных форм кислорода в модельной системе Amoeba

Резюме

Мы адаптировали набор протоколов для измерения активных форм кислорода (АФК), которые могут применяться в различных амебы и млекопитающих клеточных моделях для качественных и количественных исследований.

Аннотация

Активные формы кислорода (ROS), включают различные реактивных и короткоживущих, кислородсодержащих молекул, которые динамически друг в друга или устранены либо каталитически или спонтанно. Из-за коротких из продолжительности жизни большей АФК и разнообразие их источников и субклеточных локализаций, полная картина может быть получена только путем тщательных измерений, используя комбинацию протоколов. Здесь мы представляем набор из трех различных протоколов, используя OxyBurst зеленый (OBG) покрытием бисер, или dihydroethidium (DHE) и Amplex Ultrared (AUR), чтобы контролировать качественно и количественно различные ROS в профессиональных фагоцитов, таких как Dictyostelium. Мы оптимизировали процедуры покрытия бисер и использовали бисер OBG-покрытием и живой микроскопии динамически визуализировать intraphagosomal ROS поколения на уровне одной клетки. Мы определили липополисахарида (ЛПС) из Е. палочка как мощный стимулятор для генерации АФК в Dictyostelium. Кроме того, мы гeveloped реального времени, средне-пропускной анализ с использованием DHE и ОЗМ количественно измерить внутриклеточный супероксид и внеклеточный H ₂ O ₂ производства, соответственно.

Введение

Активные формы кислорода (ROS) участвуют в самых разнообразных биологических процессов, таких как иммунной защиты, сигнализации, развитие тканей и ответ на повреждение, а также гипертензии и рака. Хорошо изучены phagosomal НАДФН оксидазы техника посвящена быстрой генерации АФК, известный как окислительный взрыв, чтобы убить бактерии поступать в организм в нейтрофилов фагосом ^1. Кроме того, утечка электронов как побочный продукт дыхательной цепи митохондрий Ранее считалось, что отвечает только за нерегулируемой источника АФК. Но в последнее время, он был идентифицирован как важного механизма содействия intraphagosomal убийства бактерий в макрофагах мыши ^2. В последние годы социальная амеба, Dictyostelium, стала мощным и популярная модель для изучения клеток внутренние механизмы врожденного иммунного ответа. Действительно, Dictyostelium и человека фагоциты поделиться удивительно высокий уровень сохранения в молекулег механизмы, ответственные за бактерии чувствуя, поглощения и уничтожения ^3,4. В гомологи белков и ферментов, связанных с производством или ROS детоксикации, такие как NADPH оксидазы, каталазы, супероксиддисмутаза, можно найти в обоих человеческих и Dictyostelium. Как наиболее изученного амебы, Dictyostelium представлены несколько уникальных преимуществ по сравнению млекопитающих модельной системы. Они растут при комнатной температуре без необходимости CO _2, с временем удвоения 8-10 часов. Они могут быть легко сохранены как прилипшие или суспензионных культур. Кроме того, благодаря своей полностью секвенировали и аннотированный гаплоидный геном, и в легкой генетических манипуляций, Dictyostelium стал очень привлекательным экспериментальная модель организм.

В предыдущих исследованиях, различные хлорированные и фторированные производные флуоресцеина (известных под общим названием OxyBurst Грин, OBG), которые излучают флуоресценции после окисления АФК, были использованы в качестве репортера АФК. Сотовый проникающий Предполагаемоеerified производные используются для измерения цитоплазматический ROS, в то время как декстран-или-белком производные клеток-impermeant используются для измерения внеклеточной ROS. В частности, бусы OBG BSA покрытием уже используется для обнаружения phagosomal производство АФК в клетках млекопитающих ^5. Однако читатель подход микропланшет может дать только усредненную поколения РОС кривой от популяции клеток. С помощью настоящего протокола, с помощью Dictyostelium, профессиональный фагоцитов и оптимизированные условия эксперимента, получаем стабильную и эффективную фагоцитоз без сопряжения любой опсонин на шарики. ДНЕ был использован в различных модельных системах, таких как нейтрофилы и макрофаги млекопитающих, для обнаружения АФК ^6-9. Между тем, есть некоторые разногласия по поводу специфичности и чувствительности метода ^8,10. В качестве улучшенной версии Amplex красный, интенсивности флуоресценции AUR меньше чувствительны к рН, что делает его более подходящим для измеренияРОС в nonneutral или слабокислотных кругах. AUR был недавно применен в нескольких млекопитающих систем ^11,12, но его использование в nonmammalian моделей, которые довольно часто требуют слабо кислой среде роста, не сообщалось еще. Кроме того, нет опубликован протокол количественно и динамично измерить АФК и локализацию в социальной амебы Dictyostelium.

Целью представленной набором протоколов, чтобы обеспечить легкий и универсальное решение для мониторинга различных АФК и их локализацию, а в дальнейшем дать понимание РОС-связанных клеточных механизмов. Для анализа OBG, мы использовали живую микроскопии для наблюдения за всем процессом производства phagosomal ROS После поглощения OBG покрытием бисера Dictyostelium клеток, и при условии, новый подход к изучению механизма intraphagosomal убийства бактерий. Мы оптимизировали среднего пропускной DHE и AUR анализы в Dictyostelium, для измерения внутриклеточного СуперОксIDE и внеклеточный H ₂ O ₂ производство, соответственно, с помощью LPS в качестве мощного стимулятора ROS. Обратите внимание, что ЛПС Недавно было показано, увеличить бактерицидную активность Dictyostelium к фагоцитированы бактерий ^13. Кроме того, лечение с DEDTC и каталазы явно подтвердили, что эти два метода специально измерять различные типы и субклеточных локализаций АФК в Dictyostelium. Наконец, анализ OBG могут быть адаптированы к любой клейкого фагоцитарной клетки, путем дальнейшего opsonizing шарики с лигандов рецепторов фагоцитирующих клеток животных. В принципе, DHE и AUR анализы также могут быть доработаны для измерений в любой приверженец или неадгезивных клетки при соответствующих условиях эксперимента.

протокол

1. Визуализация и качественные Измерение продукции АФК в фагосом

Шарики OBG покрытием должны быть подготовлены заранее. Процедуры покрытия бисер и агар техника наложения адаптированы из опубликованных ссылок ^5,14.

1. Добавьте 1 мл суспензии 3,0 мкм карбоксилированных бисером кремнезема (около 1,8 х 10 ⁹ бусы) в 1,5 мл трубки, мыть шарики 3x 1 мл PBS быстрым спином и встряхивания.
2. Ресуспендируют бусины в 1 мл PBS, содержащего 25 мг / мл цианамид (чтобы активировать карбоксилированные шарики кремнезема ковалентно связываться prelabeled BSA), инкубировать на колесе в течение 15 мин.
3. Wash 3x 1 мл буфера для связывания (0,1 М натрий-боратного, рН 8,0) путем быстрого вращения (центрифуги на полной скорости в верхней части таблицы мини-центрифуге в течение 5 сек или, альтернативно, центрифуге при 2000 х г в течение 1 мин в настольной центрифуге) и встряхиванием, чтобы удалить лишнюю цианамида.
4. Смешайте промытых бусы с 500 мкл сoupling буфер, содержащий 1 мг OxyBurst Грин (OBG) H2HFF (дигидро-2 ', 4,5,6,7,7'-hexafluorofluorescein)-BSA, заполнить трубу с азотом из стандартного газового можете до укупорки, и инкубировать на колесе в течение 14 часов (в течение ночи) при комнатной температуре в темноте.
5. Промыть шарики 2x 1 мл закалки буфера (250 мМ глицин в PBS) для удаления непрореагировавшего OBG и дважды буфера для связывания для удаления буфера закалки быстрым спином и вортексе.
6. Добавьте 1 мл буфера для связывания, содержащие 50 мкг Alexa Fluor 594 сукцинимидиловым эфиром к сопряженным с БСА. Заполните трубку азотом до укупорки, и инкубируют на колесе в течение 1,5 ч при комнатной температуре в темноте.
7. Вымойте бисером 3x 1 мл закалки буфер быстрого спина и встряхивая, чтобы остановить реакцию, затем промыть шарики 3x 1 мл PBS быстрым спином и встряхивания.
8. Наконец, ресуспендируют бисером в 1 мл PBS с 2 мкл 10% вес / объем азида для долговременного хранения. Измерьте concentratioн из бисера в суспензии с гемоцитометре (как правило, около 1-2 х 10 ⁹ бисер / мл), заполнить трубу азотом до укупорки, и хранить при температуре 4 ° С в темноте.
9. Эффективность покрытие флуоресцеина OBG может быть проверена путем проверки спектр излучения с использованием возбуждения при 500 нм. Когда окисляется H ₂ O ₂ в присутствии пероксидазы хрена (HRP), интенсивность флуоресценции окисленных шариков, при пика эмиссии (538 нм), составляет 11-12x выше, чем у неокисленных шариков с покрытием.
10. Урожай растет в геометрической прогрессии Dictyostelium клетки от блюдо 10 см Петри, плиты различной плотности клеток на 3 см чашки с оптически прозрачного пластика или стеклянным дном, и выращивать их на ночь. Отберите блюда, которые около 80% сливной для эксперимента. Подробный протокол для культивирования Dictyostelium клетки была опубликована ^15.
11. Замените культуральной среды с LoFlo среды (LF среда), инкубировать2 часа до эксперимента в целях снижения внеклеточный и intraendosomal аутофлюоресценция в HL5C культуральной среде.
12. Параллельно растопите 10 мл 1,5% Bacto агара в LF среды, залить агар на плоскую поверхность (например стеклянной пластины 10 см х 10 см), с тем, чтобы сформировать слой агара толщиной около 1 мм, ждать 10-15 мин затвердеть. Разрежьте агар слой в 2 см х 2 см площадей и место в LF среды для дальнейшего использования.
13. Между тем, подготовить вращающимся диском или широкий поле микроскопа, установить температуру окружающей камере при 22 ° С и настройки для этого эксперимента. (См. дополнительные комментарии в дискуссии).
14. После 2 ч инкубации аспирации среды из LF 3-см чашку, но клеточный монослой должны еще быть покрыта тонкой пленкой среды. Развести шарики, покрытые 1,5 х 10 ⁷ бисер / мл и добавляют 10 мкл на клеточном слое.
15. Возьмите один квадратный агар лист, процедить лишнюю жидкость, но держать влажной. Осторожно положите йе агар квадрат в верхней части слоя клеток. Не перемещайте агар квадрат, когда он лежит на клетках. Агара используется для увеличения контакта между бисером и клеток, тем самым улучшая усвоение, и это также немного сжимает клетки, сохраняя их лучше в фокальной плоскости объектива.
16. Поместите крышку на блюдо, положите его на столике микроскопа, и автоматически принимать фотографии в красной, зеленой и фазовых каналов каждый 1 мин в течение 2 часов или больше.
17. Выберите и сосредоточиться на клеточных событий, которые содержат весь процесс фагоцитоза. Слияние оптимизированные 3 канала и собрать фотографии в фильм с помощью профессионального программного обеспечения для обработки изображений. Количественная интенсивность флуоресценции каждого выбранного бисером в красных и зеленых каналов, и отношение зеленый / красный будет отражать динамичный phagosomal АФК клеток.

2. Количественный и среднего пропускная Измерение внутриклеточного супероксид производства

1. Сбор Oпе 80% сливной блюдо Dictyostelium в 10 мл HL5C среды. Центрифуга Dictyostelium клетки в 850 мкг в течение 5 мин, внимательно и полностью аспирации избыточного среды. Ресуспендируют клеток в SS6.4 буфера [0.12 М сорбита в Соренсен буфера (14.69 мМ KH ₂ PO ₄ и 6,27 мМ Na ₂ HPO _4), рН 6,4], подсчета клеток и разбавляют до конечной плотности 6 х 10 ⁶ клеток / мл (см. дополнительные комментарии в дискуссии).
2. Добавить 50 мкл клеточной суспензии в каждую лунку белой непрозрачной 96-луночный планшет (см. дополнительные комментарии в дискуссии).
3. Развести DHE акции (30 мм в ДМСО) в 500 раз с SS6.4, пипетки 50 мкл разбавленного DHE в каждую лунку с помощью многоканальной пипетки при необходимости. Конечная концентрация ДНЕ 30 мкМ. Реакция начинается сразу.
4. Стимулы или ингибиторы могут быть добавлены в этот момент, а также на другие моменты времени в соответствии с конкретными потребностями.
5. Используйте пункт "верхнюю чтение & # END34; режим флуоресцентного микропланшет-ридера, с возбуждения флуоресценции / эмиссии в 522 нм nm/605, читать каждые 2 мин в течение 1 ч, средний дрожания 5 сек / мин, при 22 ° С

3. Количественный и пропускная способность измерения Температура внеклеточной Н ₂ О ₂ Производство

1. Выполните те же действия, как описано в 2.1 и 2.2.
2. Подготовка разбавленный HRP, добавив 5 мкл HRP складе (100 ед / мл в дистиллированной воде) в 10 мл SS6.4, вихря или инвертировать трубку к хорошо перемешать и держать на льду для последующего использования. Разбавленный раствор HRP находится на 0,05 Ед / мл.
3. Подготовьте AUR реакционной смеси путем смешивания запас AUR (10 мМ в ДМСО AUR) и разбавленный раствор HRP в SS6.4 буфера в конечной концентрации 6,25 мкМ и 0,005 ед / мл, соответственно. Например, для приготовления реакционной смеси в течение 40 реакций, смешать 1600 мкл SS6.4 с 400 мкл разбавленного HRP и 2,5 мкл исходного раствора AUR.
4. Добавить 50 мкл AUR смесиры в каждую лунку с помощью многоканальной пипетки, если это необходимо. Теперь начала реакции.
5. Стимулы или ингибиторы могут быть добавлены в этот момент, а также на другие моменты времени в соответствии с конкретными потребностями.
6. Используйте точку режим конец "сверху прочтения» флуоресцентным микро-ридере, с возбуждения флуоресценции / эмиссии при 530 нм nm/590, читать каждые 2 мин в течение 1 ч, средний встряски 5 сек / мин, при 22 ° С

Результаты

Генерация АФК в фагосом могут быть визуализированы качественно и динамично с помощью микроскопа (File S1). Красной флуоресценции, испускаемый Alexa Fluor 594 является рН от регистра и остается постоянным в среде phagosomal, в то время как окисление OBG увеличивает его флуоресценцию в зеленом ?...

Обсуждение

По сравнению с ранее описанными методами, анализ OBG динамически визуализирует процесс phagosomal ROS поколения на уровне одной клетки, вместо измерения среднего сигнала ROS из популяции клеток. Такие методы населения-усреднения, как правило, чтобы скрыть важную информацию, вызванного несинхр?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
OxyBURST Green H2HFF BSA	Invitrogen	O-13291
Alexa Fluor 594	Invitrogen	A-20004
Carboxylated silica beads	Kisker Biotech	PSi-3.0COOH
HL5C medium	ForMedium	HLC0102
LoFlo medium	ForMedium	LF1001
Bacto agar	BD	204010
Dihydroethidium	Sigma	37291-25MG
Amplex UltraRed	Invitrogen	A36006
Horseradish peroxidase	Roche	10108090001
Diethyldithiocarbamate (DEDTC)	Sigma	D3506-100G
Catalase	Sigma	C9322-1G
Cyanamide	Sigma	187364-25G
Lipopolysaccharides	Sigma	L2630-25G
EQUIPMENT
ibidi μ-Dish 35 mm, high	ibidi	81156	Bottom made of optically clear plastic
MatTek dish 35 mm	MatTek corporation	P35G-1.5-14-C	Bottom made of a glass coverslip
Scepter Cell Counter	Merck Millipore	PHCC00000
White 96 well plate	Nunc	236108
Centrifuge	SORVALL	Legend RT
Microplate reader	BioTek	Synergy Mx