نموذج تجريبي لدراسة الملاريا والسل عدوى مرافقة على انتقال الطبيعية السل المتفطرة و المتصورة berghei</i

Summary

والسل، والملاريا وهما من الإصابات الأكثر انتشارا في البشر والأسباب الرئيسية للمراضة والوفيات في السكان الفقراء في المناطق المدارية. أنشأنا نظام نموذج تجريبي لدراسة نتائج عدوى مرافقة الملاريا والسل في الفئران بعد التحدي مع كل مسببات الأمراض عبر الطريق الطبيعية للعدوى.

Abstract

Coinfections تحدث بشكل طبيعي بسبب التداخل الجغرافي للأنواع متميزة من الكائنات الحية المسببة للأمراض. العدوى المتزامنة على الأرجح تعدل الاستجابة المناعية منها إلى كل الممرض واحد، وبالتالي قد تؤثر المرضية ونتائج المرض. المرضى المصابون قد تستجيب بشكل مختلف أيضا للتدخلات المضادة للعدوى. لم يدرس عدوى مرافقة بين السل الناجم عن المتفطرات وطفيل الملاريا المتصورة، وكلاهما coendemic في أجزاء كثيرة من أفريقيا جنوب الصحراء الكبرى، بالتفصيل. من أجل الاقتراب من التحدي ولكن علميا وسريريا مسألة ذات أهمية كبيرة كيف عدوى مرافقة الملاريا السل تعدل الحصانة المضيفة وبالطبع من كل مرض، أنشأنا نموذجا الماوس التجريبية التي تسمح لنا لتشريح الاستجابات المناعية أثارت لكلا مسببات الأمراض في البلد المضيف المصابون . من المذكرة، من أجل تقليد الأكثر تحديدا الإصابات البشرية المكتسبة بشكل طبيعي، ونحن أداء التجريبيةالعدوى من الفئران مع كل مسببات الأمراض من خلال مساراتها الطبيعية للعدوى، أي الهباء الجوي ودغة البعوض، على التوالي.

Introduction

نادرا ما يتعرض البشر لالممرض واحد فقط. ولا سيما في المناطق التي يرتفع فيها عدد الإصابات مثل أفريقيا جنوب الصحراء الكبرى، coinfections تمثل مشكلة صحية عامة ولكن رئيس بالتقدير للغاية. والسل، والملاريا هي الالتهابات البكتيرية والطفيلية الأكثر انتشارا في البشر، على التوالي وما زالت الأسباب الرئيسية للمراضة والوفيات في السكان الفقراء في المناطق المدارية. على الرغم من تداخل جغرافي واسع بين السل والملاريا وعدد كبير من الأفراد المعرضين لخطر عدوى مرافقة، والقليل جدا هو المعروف عن التفاعلات بين مختلف وغالبا مواجهة المنظمين والمستجيبات المناعي أثارت في وقت واحد ضد طفيليات الملاريا والعصيات السلية في الأفراد المصابون.

نماذج القوارض من الإصابات المختلطة تسمح تميز الفرق التفاعلات المناعية ضد مسببات الأمراض متميزة في مضيف واحد، وبالتالي تسليط الضوء على influ المتبادلةبسبب الخلافات تحوير علم الأمراض والنتائج السريرية للمرض الفردية، والتي سوف تساعد أيضا على تحديد توصيات جديدة لعلاج والوقاية. أنشأنا نموذج الفأر التجريبية التي تمكننا من تحقيق في تداعيات الناجمة عن العدوى المتزامنة مع المتفطرة السلية (MTB) وأنواع القوارض المتصورة ضمن نفس المضيف ^1. الأهم من ذلك، لمحاكاة الإصابات البشرية المكتسبة بشكل طبيعي قدر الإمكان، نموذجنا تنفذ الطرق الطبيعية للعدوى يستخدمها كل من مسببات الأمراض. السل هو عدوى المحمولة جوا، وبالتالي الذي يظهر أساسا في الرئتين. العامل المسبب، تبث MTB من قبل أشخاص يعانون من مرض نشطة عبر الطريق الهباء الجوي عندما طرد قطرات المعدية أثناء السعال أو العطس. وهكذا، والعدوى الهباء الجوي هو الأسلوب المفضل لتقليد العدوى الطبيعية. لا يمكن أن يتحقق جيل من الجسيمات العالقة في الهواء التي تحتوي على MTB عن طريق استخدامنظام التعرض للاستنشاق. هذا كله غرفة تعرض الجسم يسمح تعريض حيوانات التجارب لMTB التي تحتوي على قطرات المعدية (الشكل 1) والتي يتم استنشاقها إلى الحويصلات الهوائية في الرئتين حيث يبدأ المرض ^2.

الملاريا من ناحية أخرى هي الأمراض المنقولة بالنواقل الناجمة عن الأوالي، apicomplexan طفيلي المتصورة التي تبث بشكل طبيعي عن طريق لدغة أنثى البعوض أنوفيلي. خلال وجبة الدم، تترسب sporozoites المعدية تحت الجلد وتصل في وقت لاحق المضيف الكبد عن طريق مجرى الدم. داخل خلايا الكبد أن تتطور وتتكاثر بسرعة في schizonts مرحلة الكبد. في نهاية المطاف، schizonts ناضجة تمزق والافراج عن الآلاف من الإمراض merozoites الجيل الأول في مجرى الدم حيث بدء دورة التدريجي للغزو الخلية الحمراء، والنسخ، وتمزق الخلايا الحمراء، والاجتياح ^3. في دورة حياة المتصورة continUES لبعض merozoites تتطور إلى مراحل الطفيلي الجنسي، من الذكور والإناث gametocytes، والتي يمكن تناولها عن طريق البعوض خلال وجبات الدم. في البعوض، sporozoites المتصورة تطوير داخل بيض التوكسوبلازما المقيمين في المعي المتوسط ​​البعوض ويهاجر في نهاية المطاف إلى الغدد اللعابية لإحالتها إلى ^3،4 مضيف آخر.

بينما في النماذج الحيوانية التجريبية تسليم MTB عبر الأيروسول والطريق وبالتالي الأكثر أهمية هو شائع جدا، وقد أجريت العديد من الدراسات العدوى القوارض المتصورة بما في ذلك الدراسات التجريبية على عدوى مرافقة الملاريا السل ^5-7 خارج عن طريق إصابة الفئران مع الكريات الحمراء مطفول، مما أدى لعدوى الملاريا مرحلة الدم مع استبعاد مرحلة مرحلة الكبد سريريا الصامتة. ومع ذلك، فإن المرحلة الكبد هو خطوة إلزامية خلال العدوى وذات الصلة لمكافحة الحصانة متصوري ^8-11. لذا نعتبر أنه من المهم أن تشمل فتاه كبديبورصة عمان من انتقال الملاريا والصيانة في دراسات كل من الملاريا وعدوى مرافقة الملاريا السل، على التوالي. بالإضافة إلى ذلك، فقد تبين أن تنتقل بشكل طبيعي sporozoites هي أكثر من تلك المعدية التي تنتقل عن طريق العدوى إبرة ^12، والتي دفعتنا إلى تأسيس عدوى الملاريا من قبل لدغة البعوض بدلا من حقن معزولة الغدة اللعابية sporozoites مشتقة. الطريقة الوحيدة للحصول على البعوض المعدية للانتقال الطبيعية من طفيليات الملاريا هو الحفاظ على دورة الحياة الكاملة للطفيل في كل من الفقاريات المضيف (هنا الماوس) والبعوض الناقل للمرض. وبالتالي، الوصول إلى معمل الحشرات للصيانة الطفيلي أمر لا مفر منه من أجل أداء الإرسال الطبيعية عن طريق لدغة.

وقد وضعت لدينا بروتوكول الموصوفة هنا لمعرفة كيف عدوى مرافقة مع المتصورة sporozoites التأثيرات على السل المزمن ^1. للقيام بذلك، يصاب الفئران الهباء الجوي مع م. السل و4في وقت لاحق 0 يوم، عندما M. وصلت عدوى السل المرحلة المزمنة، ويتعرض الفئران لبعوض الملاريا المعدية. يمكن اتباعها نتائج كل من الملاريا والسل في الحيوانات المصابون من خلال رصد الطفيل في الدم والحمل البكتيري في الأنسجة، على التوالي. في بروتوكول لدينا، فإننا سوف تصف بالتفصيل كيفية تصيب الفئران مع كل مسببات الأمراض من طريق العدوى الطبيعية، وكيف لتأكيد انتقال الممرض ناجحة. في أيدينا، وحققت معدل الإصابة عادة لكلا الالتهابات التجريبية هو 100٪. ويمكن تطبيق هذه البروتوكولات لدراسة كل على حدة أو الالتهابات، كما نفعل، لنموذج ودراسة عدوى مرافقة بين اثنين من الأمراض المعدية الأكثر تحديا الإنسان. هذا النموذج ينطبق على الأنواع المتفطرة والقوارض المتصورة أخرى خارجة عن تلك الموصوفة في هذا البروتوكول.

Protocol

تدابير السلامة وبيان الأخلاق

الدراسات المقدمة في هذه الوثيقة تنطوي على العمل مع الممرض الإنسان MTB والطفيلي الملاريا القوارض المتصورة berghei (P. berghei). التجارب مع MTB (سلالة H37Rv) وP. berghei يجب أن تنفذ تحت الظروف الملائمة للسلامة الأحيائية. مستوى السلامة الأحيائية (BSL) مطلوبة 2 مختبرات للطفيليات الملاريا القوارض مثل P. berghei وBSL 3 لMTB، وبالتالي، لجميع الدراسات عدوى مرافقة الموصوفة هنا. ملاحظة: الفئران المصابة مع MTB لا تنتشر العدوى إلى الفئران الأخرى داخل المنطقة المجاورة مباشرة (المراقبة الخاصة بنا). وبالتالي، يمكن لانتشار المجرب استبعادها؛ الملابس الواقية المناسبة ولكن لابد من يرتديها داخل المختبر BSL 3 في جميع الأوقات. وفقا لقواعدنا، المجربون ارتداء الدعك الجراحية، وشبكات الشعر، وأجهزة التنفس القابل للتصرف، واثنين من أزواج من القفازات، ومنها يتم تجاهل احد الخارجي في أي وقت ليتم سحب التربيعي من مجلس الوزراء. يتم وضع أخرى جديدة على مجلس الوزراء قبل الدخول مرة أخرى. مستعدون للمخلفات السائلة والمعدية واحدة لإزالة التلوث السطح، قبل التجربة وضعت داخل مجلس الوزراء: حاويتين، واحدة مع 2٪ Buraton (المطهرات الأخرى وافقت على تعطيل MTB يمكن استخدامها في تركيز افق ملاحظة). بالإضافة إلى ذلك، سيتم استخدام أكياس البلاستيك للنفايات الصلبة غير المعدية. وفقا لقواعد الألمانية، إصابة كل عمل يستدعي تداول وتجهيز الثقافات MTB أو الأنسجة المستمدة من المواضيع المتميزة يجب أن يتم من الفئران في خزانة الدرجة 2 السلامة الأحيائية داخل مختبر BSL3. أثناء التعامل مع المتفطرات، والتدابير التي يتعين اتخاذها لتجنب توليد الهباء الجوي في جميع الأوقات.

واستخدمت الإناث C57BL / 6 الفئران (تشارلز ريفر) الذين تتراوح أعمارهم بين 6-8 أسابيع لجميع التجارب عدوى مرافقة والحفاظ في ظل ظروف محددة في حاجز BSL 3 مرافق. وكانت رعاية الحيوان والتجريب المؤسسة العامةrformed وفقا للبروتوكولات التي وافقت عليها لجنة الأخلاقيات للتجارب على الحيوانات في وزارة الزراعة، والبيئة، والمناطق الريفية في ولاية شليسفيغ هولشتاين

للحصول على مراحل البعوض الملاريا، تم شراؤها من الفئران NMRI مختبر نهر تشارلز، Sulzfeld، ألمانيا وتبقى في ظل ظروف معينة خالية من مسببات الأمراض داخل المرفق الحيوان جامعة هايدلبرغ (اتحاد الملاكمة العالمي). أجريت جميع التجارب على الحيوانات وفقا للوائح الأوروبية والتي وافقت عليها السلطات ولاية بادن فورتمبيرغ (Regierungspräsidium كارلسروه).

1. العدوى الهباء الجوي من الفئران مع MTB باستخدام غرفة الهباء غلاس كولونيل

أفضل وسيلة لتوحيد العدوى الهباء الجوي من حيوانات التجارب مع MTB هو استخدام المتفطرات من الأسهم المجمدة مع التتر كفو المعروفة. لإعداد الثقافات الأوراق المالية، والثقافة MTB في ميدلبروك 7H9 مرق تستكمل مع OADC (الأوليكحامض، زلال، سكر العنب، الكاتلاز) تخصيب المتوسطة و 0.05٪ توين 80، مصدر الكربون لالمتفطرات وقياس لتجنب تراكمها البكتيرية في نفس الوقت. وينبغي أن يكون على الثقافات ≤ OD 1 في وقت الحصاد. في أعلى OD، ويزيد من تكتل البكتيرية وانخفاض قدرتها على البقاء. مخزن 1 مل aliquots في -80 درجة مئوية. تحديد عدد مستعمرة تشكيل وحدات قابلة للحياة (كفو) في الأسهم المجمدة بواسطة الطلاء سلسلة من التخفيفات 10 أضعاف من ثلاث قوارير المستقلة على لوحات أجار 7H11 تستكمل مع 0.5٪ الجلسرين، 1 غرام / لتر الأسباراجين، وOADC وتعداد المستعمرات بعد 4 أسابيع من الحضانة عند 37 درجة مئوية. أداء العدوى الهباء الجوي كما هو موضح أدناه.

1. الأسهم ذوبان الجليد MTB المعروفة من عيار كفو وبعناية مزيج تعليق خمس مرات لتفريق كتل البكتيرية باستخدام حقنة 1 مل مزودة إبرة G 27. تجنب إنتاج الهباء.
2. اعتمادا على جرعة العدوى المطلوب، ونقل حجم المطلوب من الأسهم في المتفطراتأنبوب 50 مل تحتوي على برنامج تلفزيوني العقيمة. الحجم النهائي هو 6 مل. ملاحظة: من خلال تغيير عدد من الكائنات الحية الدقيقة في هذا التعليق، وتتنوع نسبة البكتيريا تحمل قطرات. نحن عادة ما تستهدف على امتصاص 100 عصيات قادرة على البقاء في الرئة (التهاب جرعة منخفضة). في تجربتنا، وهذا يتطلب حوالي 1-2 × 10 ⁶ MTB / مل في الحجم الكلي لل6 مل منها مرذذ 5.5 مل (انظر أدناه). فمن المستحسن للقيام بسلسلة من التحديات الهباء الجوي التجريبية مع تركيزات مختلفة من البكتيريا إلى إيجاد الظروف المثلى للعدوى الخاص بك. في حين أن العدوى جرعة عالية مع ما يصل إلى 5،000 المتفطرات يمكن القيام به لتسريع عملية المعدية، وعدد قليل من 5 البكتيريا يمكن استخدامها لتصيب بنجاح الفئران عن طريق الهباء الجوي. معدل العدوى شيوعا بنسبة 100٪.
3. إزالة حجم كاف (أعدت تتجاوز الحجم النهائي المطلوب) لطلاء لتحديد عيار اللقاح، ونحن عادة إزالة 500 ميكرولتر لوحة يثلث التقنية.
4. وضع الحيوانات فيسلة مجزا شبكة (الماوس واحد في سلة) داخل غرفة دائرية والهباء الجوي إغلاق غطاء غرفة الهباء الجوي. ملاحظة: تم تجهيز نماذج أخرى مع سلة على شكل دائري تتكون من خمس مقصورات فردية، كل منها يمكن أن تستوعب 20 الفئران.
5. إرفاق وحدة فنتوري-البخاخات لمفاصل مأخذ ثلاثة الفولاذ المقاوم للصدأ.
6. إزالة التعليق المتفطرات من أنبوب 50 مل مع حقنة 10 مل مزودة إبرة حادة 18 G وتحمل حقنة لغرفة الهباء الجوي في مربع نقل مغلقة.
7. إزالة الغطاء المسمار وحدة البخاخات وبعناية حقن تعليق المتفطرات في البخاخات. تجنب توليد الهباء. تجاهل حقنة في وعاء الأدوات الحادة التي تحتوي على 2٪ Buraton. ختم البخاخات مع غطاء المسمار.
8. تشغيل مفتاح الطاقة الرئيسي ومصباح الأشعة فوق البنفسجية. عرض على لوحة المفاتيح السيطرة يظهر "جهاز غلاس كولونيل التعاون".
9. أدر مفتاح البرنامج على. إرادة العرضتظهر "هل البخاخات مستعد؟" "هل سلة محملة؟" دخول الصحافة عندما تصبح جاهزة ". دخول الصحافة.
10. يظهر على الشاشة "أدخل سخن الوقت 900"، وهذا يعني أن الوقت سخن للمحرقة (التي إزالة التلوث من عادم الهواء) هو 900 ثانية. دخول الصحافة.
11. سوف تظهر على الشاشة "أدخل الوقت Nebulizing 1،800"، وهذا يعني ضبط الوقت nebulizing إلى 1،800 ثانية كما الافتراضي. من أجل تمديد الوقت nebulizing، أدخل "2،400" ودخول الصحافة. ملاحظة: خلال دورة nebulizing والهواء تحت ضغط يفتت التعليق، مما يولد قطرات صغيرة تحتوي على المتفطرات. مع تدفق الهواء الرئيسية، وتتم هذه قطرات (حوالي 2-5 ميكرون في الحجم) في غرفة الهباء الجوي.
12. سوف تظهر على الشاشة "أدخل CD التوقيت 1،800"، وهذا يعني أن دورة تسوس يأخذ 1،800 ثانية. تعيين "2،400" ودخول الصحافة. ملاحظة: خلال هذه الدورة، وقد تم بناء السحابة التي شع في غرفة الهباء الجوي خلال دورة nebulizing يمكن الاضمحلال. يتم استنشاق قطرات صغيرة من حيوانات التجارب.
13. سوف تظهر على الشاشة "أدخل التوقيت ديسمبر 900"، وهذا يعني أن دورة ضوء الأشعة فوق البنفسجية التطهير سوف تستغرق 900 ثانية. دخول الصحافة. الجهاز سوف تبدأ ركوب الدراجات من خلال سخن، nebulizing، وتسوس سحابة والتطهير بالأشعة فوق البنفسجية.
    تنبيه: الفراغ تدفق متر ينبغي أن تبين 60 قدم مكعب / ساعة (فحص عند بدء دورة سخن؛ ضبط صمام التحكم الفراغ إذا لزم الأمر) وضغط تدفق الهواء متر 10 قدم مكعب / ساعة (فحص عند nebulizing يبدأ دورة؛ ضبط صمام التحكم في الهواء وفقا لذلك ).
14. عندما دورة كاملة، وسوف تظهر لوحة المفاتيح "عملية كاملة - إزالة عينة". إيقاف البرنامج والأشعة فوق البنفسجية ومفتاح الطاقة الرئيسي.
15. تحقق مما إذا تم مرذذ تعليق الفطرية تماما، وإذا لم يكن كذلك، تسجيل الصوت المتبقية عن طريق إزالة بعناية تعليق مع حقنة مناسبة مزودةإبرة 18 G حادة. لا ينبغي أن يكون حجم المتبقية أكثر من 1 مل.
16. إزالة البخاخات من المفاصل ووضعه في وعاء يحتوي على 2٪ Buraton مدة لا تقل عن 2 ساعة، ويتم ذلك عادة التطهير O / N. بعد ذلك، نقل البخاخات لعموم الطازجة وشطف جيدا بالماء. ترك البخاخات إلى الهواء الجاف.
17. فتح غرفة الهباء الجوي والعودة إلى الحيوانات أقفاصها. حقيبة السلال في أكياس التعقيم والأوتوكلاف. مسح تنظيف الأسطح من داخل غرفة الهباء الجوي مع 2٪ Buraton ملاحظة: لأسباب تتعلق بالسلامة، يجب أن ترتديه لتنقية الهواء للتنفس الصناعي بالطاقة أثناء هذا الإجراء.
18. باستخدام 500 ميكرولتر المتبقية من تعليق الفطرية (انظر الخطوة 1.3) لوحة التخفيفات 10 أضعاف من ثلاث نسخ التقنية (3 × 100 ميكرولتر) على لوحات أجار 7H11.

2. تحقق من امتصاص كفو المرغوب في الرئتين

يوم واحد بعد الإصابة الهباء الجوي من حيوانات التجارب تحديد الصغرى البكتيريةالإعلان في الرئتين للحيوانات السيطرة المعينة من أجل التحقق من امتصاص كفو من المطلوب. ملاحظة: نحن عادة تعيين مجموعة إضافية من 3-5 الفئران ليوم 1 تقرير كفو.

لرصد مسار عدوى MTB مع مرور الوقت، يمكن فحص الأنسجة عبء الفطرية بواسطة الطلاء التخفيفات التسلسلي للجهاز الخليط كله من أجل تقرير كفو. الرئة هو الموقع الأساسي لمظاهر المرض في مرض السل ولكن عادة ما يتم تحليل الطحال والكبد والغدد الليمفاوية وفقا لذلك. تعتمد التخفيفات أن مطلي على الحمل المتفطرات المتوقع في الأجهزة التي تعتمد على اللقاح الأولي (جرعة منخفضة مقابل جرعة عالية)، والذي يؤدي إلى الأحمال البكتيرية المختلفة في الأنسجة، وكذلك على الجهاز ونقطة زمنية ل يتم تحليلها. عند الإصابة جرعة منخفضة، الحمولة الجرثومية من MTB H37Rv في الرئة عادة ما تصل إلى الهضبة بين يوم 25-30.

1. وضع الحيوانات الموت الرحيم (القتل الرحيم: CO ₂ أو الاختناقالتخدير محطة) على ورقة ماصة على لوحة تشريح في مجلس الوزراء من الدرجة الثانية للسلامة الأحيائية وتطهير الفئران مع الايثانول 70٪. ملاحظة: 70٪ كحول هو لتطهير السطح فقط، وسوف لا تقتل MTB.
2. إجراء شق صغير في منتصف البطن وسحب الجلد الماوس فوق الرأس.
3. فتح البطن والقفص الصدري مع مقص جراحي وإزالة الجدار الصدري بحيث الرئتين يمكن الوصول إليها.
4. إزالة الرئتين ونقل في أنبوب 15 مل مع تجانس العازلة (الماء المعقم / 1٪ ت / ت توين 80/1٪ ث / ت الزلال).
5. باستخدام المكبس من 5 الرئتين مل سلالة حقنة من خلال 100 ميكرون المناخل في طبق بتري الصغيرة.
6. المناخل دافق عدة مرات باستخدام ماصة 1 مل مجهزة مع طرف الحاجز وتوزيع جناسة الرئة بين 8 لوحات أجار (كاليفورنيا 250 ميكرولتر / لوحة؛ تأكد لديهم سطح تجفف جيدا).
7. لوحة بعناية العينات باستخدام الاسمدة القابل للتصرف والتي يتم التخلص منها في 2٪Buraton.
8. ترك لوحات أجار لتجف داخل مجلس الوزراء. ختم كل لوحة واحدة مع parafilm، والتفاف في رقائق الألومنيوم واحتضان تستقيم عند 37 درجة مئوية لمدة 4 أسابيع على الأقل.

3. بناء أقفاص واقية من البعوض الهروب

سلالات القوارض المتصورة ليست مؤذية للبشر. ومع ذلك، منذ الفئران المصابة MTB هي المستفيدين من الطفيليات والعمل يتم تحت BSL 3 شروط، هي الاحتياطات اللازمة لمنع البعوض من الهرب أقفاصها. اعتمادا على نظام العدوى المخطط لها، والتي يمكن إعادة استخدامها autoclavable أقفاص معدنية الإطار أو أقفاص المتاح عصامي يمكن استخدامها. وأوصت تلك الأخيرة عن طريق العدوى إذا دغة حيوانات التجارب هو مطلوب لأن يقوم بها عدد محدد من البعوض في الماوس. إذا كانت هناك حاجة أقفاص عصامي، وإعداد أقفاص للمواصفات بالضبط كما في الصحة من البعوض وسلامة المختبر يعتمد على الدانق بهمالثانية بناء (الشكل 2).

1. اتخاذ الكرتون مثل نصف باينت الآيس كريم الكرتون أو كوب القهوة الورق (الشكل 2).
2. قطع فتحة صغيرة في جانب من الكرتون وتغطي بطبقة مزدوجة من اللاتكس مع فتحة قطع في كل قطعة لإنشاء مدخل آمن للبعوض. ملاحظة: فتح لديها الحجم الكلي من 2 سم × 2 سم، وأنابيب (جهاز الشافطة) التي نستخدمها لجلب و / أو إخراج البعوض هو تعديل أنبوب 15 مل فالكون تعلق على مضخة الفراغ وبالتالي هي بمثابة الشافطة التي يبلغ قطرها 1.5 سم.
3. الشريط على قطعة من ورق الترشيح على الجزء السفلي من داخل الكرتون لامتصاص القطرات.
4. تغلق أكواب الآيس كريم مع المعاوضة (طبقة مزدوجة من شبكة نايلون، حجم 1 مم × 1 مم) وتثبيته على والكرتون من خلال الشريط وشريط مطاطي.
5. للتجارب العدوى التي تحتاج إلى أعداد محددة من البعوض في الماوس، وإعداد أقفاص مع 10-15 البعوض المصابة، كل منها يحتوي على مركبات مثاليerage من 10،000 من النوع البري الغدة اللعابية P. sporozoites berghei.
6. من الناحية المثالية، تجويع البعوض لمدة 24 ساعة قبل إجراء وجبة الدم.

4. عدوى الملاريا من الفئران عن طريق لدغة بعوضة

طفيل الملاريا القوارض المستخدمة هنا هي P. berghei لكن أي سلالة القوارض المتصورة الأخرى ذات الاهتمام يمكن استخدامها. للحصول على البعوض المعدية لنقل حيوان بوغي يتم الحفاظ على دورة الحياة الكاملة للطفيل في كل من الفقاريات المضيف (الماوس) والبعوض الناقل للمرض. ويتم صيانة الطفيلي في لمعمل الحشرات. لنقل التجارب الطبيعية، وينبغي أن يكون الحد الأدنى لعدد sporozoites في الغدة اللعابية لا يقل عن 10،000. لبروتوكولات مفصلة عن الصيانة الطفيلي نشير إلى طرق في أبحاث الملاريا عن طريق مول وآخرون، 2013.

1. تخدير الفئران السذاجة أو الحيوانات preinfected لمدة 40 يوما مع MTB مع الكيتامين (100 ملغ / كغ)وزيلازين (7 ملغ / كلغ) حل عن طريق الحقن داخل الصفاق (200 ميكرولتر / الماوس). ملاحظة: إن الوقت بين العدوى المواضيع المتميزة والمتصورة يمكن تعديلها تبعا لسؤال البحث الأساسي. وبالمثل، يمكن عكس ترتيب التحديات الممرض، يمكن أن يتعرض أي الفئران المعدية لدغة بعوضة قبل الإصابة MTB.
2. وضع الفئران مخدرة على المعاوضة من أقفاص البعوض (الماوس واحد في قفص البعوض البعوض للتعرف إلى نسبة الماوس) والسماح للبعوض لتغذية عن طريق الغشاء لمدة 10-15 دقيقة. ملاحظة: إن وجود الدم في أحشاء البعوض يعني التغذية، وبالتالي، نقل حيوان بوغي.
3. نقل الفئران مرة أخرى إلى أقفاصها والإشراف باستمرار حتى يستيقظ من التخدير. ملاحظة: مكان الفئران على منشفة ورقية وليس على الفراش (خطر الاختناق) والاحتفاظ بها (المكان معا بشكل وثيق، وتغطي الهيئات مع منشفة ورقية) دافئة.
4. قتل البعوض عن طريق الرش لهم 70٪ من الإيثانول أو المطهرات الأخرى من خلال صافجي من القفص. أقفاص الأوتوكلاف وتجاهل إذا تم استخدام المتاح منها.

5. رصد الطفيل

1. الذيل ثقب الأوردة في نهاية جدا مع إبرة وجمع قطرة واحدة من الدم في نهاية كل شريحة.
2. استخدام شريحة أخرى لسحب قطرة واحدة من الدم أكثر من نصف طول الشريحة. اقلب رش لاستخدام حافة أخرى لتشويه الثانية. ترك الشرائح للهواء الجاف.
3. بالغيمزا صمة عار
   1. وضع الشرائح في أصحاب الشرائح وإصلاح مسحات الدم عن طريق الغمر وجيزة في الميثانول المطلق. ملاحظة: يجب أن تبقى لأن استخدام الزجاج وير في الحد الأدنى في BSL 3 نستخدمها cuvettes البولي بروبلين لجميع الحلول.
   2. تزج في مسحات بالغيمزا (1:10 في الماء منزوع الأيونات). بعد 10 دقيقة، وتراجع الشرائح داخل وخارج cuvettes تلطيخ مملوءة بالماء منزوع الأيونات عدة مرات لشطف بعيدا وصمة عار الزائدة.
   3. أخيرا، والشرائح الهواء الجاف في وضع عمودي.
4. STAIN البديلة: رايت & #180، ق وصمة عار
   1. حل وصمة عار رايت بتركيز 1 ملغ / مل في الميثانول.
   2. تصفية من خلال مرشح مطوية قبل استخدامها.
   3. تزج مسحات الدم في حل تلطيخ واحتضان لمدة 4 دقائق (ملاحظة: الميثانول التثبيت من مسحات ليس من الضروري كما هو الحل تلطيخ الميثانول القائم).
   4. غسل الشرائح الشطف في الماء منزوع الأيونات كما هو موضح اعلاه، وترك الشرائح للهواء الجاف.
   5. مرة واحدة وصمة عار بالغيمزا / رايت 'ق كاملة، نقل بلطف عن الكواشف المستخدمة في وعاء يحتوي على التخلص من Buraton.
5. تحليل لطاخة الدم
   1. تحليل مسحات الدم الملون بواسطة المجهر الضوئي في التكبير 100 أضعاف مع الغمر النفط.
   2. عد كريات الدم الحمراء غير مصاب ومصاب في منطقة مسحة الدم حيث يتم ترتيب الكريات الحمراء في أحادي الطبقة.
   3. من أجل تحقيق الطفيل محددة جيدا، عد لا يقل عن 10 حقول نظر مختلفة وعرض أحادي الطبقة كرات الدم الحمراء.
   4. Calculأكلت الطفيل النسبية (في٪) من خلال قسمة عدد الكريات الحمراء مطفول من قبل عدد من الكريات الحمراء وضرب الناتج في 100.

النتائج

إصابة الفئران مع المواضيع المتميزة وP. berghei عبر الطريق الطبيعي، أي الهباء الجوي ودغة البعوض، على التوالي، في نتائج متسقة وقابلة للتكرار العدوى لجميع الحيوانات (الجدول ¹⁾ 1. يمكننا رصد العدوى ناجحة وبالطبع كل من الملاريا والسل من خلال تحديد وقوع الأولي (سبقة الظهور) وعدد من الطفيليات في الدم (P. berghei الطفيل) وعبء المواضيع المتميزة في مختلف الأجهزة، على التوالي. ويرد مثال على نجاح انتقال طفيل الملاريا عن طريق لدغ البعوض المعدية في الجدول (1) والشكل (3). أدت التغذية من 10 البعوض المصابة حيوان بوغي على كل الماوس في معدل الإصابة بنسبة 100٪ على نحو ما أكده وجود الطفيليات مرحلة الدم 4-5 أيام في وقت لاحق (الجدول 1 والشكل 3A). الأهم من ذلك، نجد أعداد الطفيل مماثلة في دم الفئران الفردية من نفس غرام التجريبيةموعة، مشيرا إلى أن انتقال حيوان بوغي بالنتائج دغة بعوضة في عدوى متسقة وقابلة للتكرار. بمقارنة سبقة الظهور في السيطرة على الفئران السذاجة مع أنه في الحيوانات MTB-المصابون، يمكننا أن نرى أن يتم تأخير سبقة الظهور بشكل طفيف في الفئران التي تم preinfected مع MTB (الجدول 1، الشكل 3B) ^1. ونحن قد ذكرت سابقا ^1، يمكننا تحديد أثر MTB عدوى مرافقة على مسار الملاريا بحلول الطفيل الرصد اليومي في مسحات الدم بالغيمزا الملطخة كما هو مبين في الشكل 3B.

إصابة الفئران مع MTB عن طريق استخدام أحد نتائج التعرض للاستنشاق في نظام ترسب ناجحة من البكتيريا في الرئتين مع تقلب منخفض نسبيا بين الفئران الفردية (الشكل 4A). يمكننا متابعة الأحمال الفطرية في الرئتين والأعضاء الأخرى من الفائدة مع مرور الوقت عن طريق تقرير كفو. مثال لتحميل الفطرية في رئاتإصابة المواضيع المتميزة C57BL / 6 الفئران في غياب أو وجود P. ويظهر في الشكل 4B berghei.

الجدول 1. سبقة الظهور بعد انتقال حيوان بوغي بواسطة لدغة البعوض. جميع الفئران وضعت العدوى المرحلة الدم بعد انتقال طبيعي للP. berghei sporozoites بواسطة لدغة البعوض. مقتبس من ¹ بلوس وان، 7 (10)، e48110 بإذن.

مجموعة الماوس التجريبية (C57BL / 6)	تحدي بنسبة 10 دغات البعوض المعدية	عدد مرحلة الدم الحيوانات إيجابية / عدد الحيوانات لكل مجموعة	يعني سبقة الظهور [د]
السذاجة	P. berghei	7/7	4،4
المواضيع المتميزة المصابين	P. berghei	7/7	5،5 د>

الشكل 1. . يتعرض الخطة الشاملة للإجراءات التجريبية C57BL / 6 الفئران لMTB التي تحتوي على قطرات في غرفة الهباء الجوي غلاس كولونيل. بعد يوم واحد العدوى الهباء الجوي، يتم التحقق من امتصاص المواضيع المتميزة من خلال تحليل كفو في الرئة. بعد 40 يوما MTB التحدي (عندما أصبح السل المزمن في الفئران المصابة)، تتعرض الحيوانات لP. إصابة berghei البعوض. لتأكيد انتقال حيوان بوغي ناجحة ومتابعة مسار عدوى المتصورة، ويتم رصد الطفيل في مسحات الدم اليومية بالغيمزا الملطخة اعتبارا من 3 أيام بعد لدغة البعوض.

/ files/ftp_upload/50829/50829fig2highres.jpg "سرك =" / files/ftp_upload/50829/50829fig2.jpg "/>
الشكل 2. رسم من قفص البعوض. ترد البعوض المعدية داخل الكرتون مثل نصف باينت الآيس كريم الكرتون. يتم قطع فتحة صغيرة في جانب من الكرتون ومغطاة بطبقة مزدوجة من اللاتكس مع فتحة قطع في كل قطعة لإنشاء مدخل آمن للبعوض. وسجلت قطعة من ورق الترشيح على الجزء السفلي من داخل الكرتون لامتصاص القطرات. يتم إغلاق أكواب الآيس كريم قبالة مع المعاوضة (شبكة النايلون) الذي هو ثابت للكرتون بواسطة شريط وشريط مطاطي.

الرقم 3. الطفيل في الدم. A) مثال لرايت سيصدره اللطاخة الدموية الملون تظهر الكريات الحمراء مطفول (شريط مقياس، 20 & #تم رصد م) B) الطفيل في الدم عن طريق تحليل الماوس اليومية مسحات الدم ملطخة بالغيمزا؛ 181. الفئران المصابون لديهم انخفاض الطفيل مقارنة مع الفئران المصابة المتصورة واحد (ن = 10)، وتظهر النتائج على النحو يعني ± SD؛ *** ف <0،001. طبع من ¹ بلوس وان، 7 (10)، e48110 بإذن.

الشكل 4. الكشف عن MTB في الرئة. وقد تم الطعن C57BL / 6 الفئران الهباء الجوي مع 100 كفو من المواضيع المتميزة وبعد 40 يوما، المصابون P. berghei بواسطة لدغة البعوض. A) بعد يوم واحد من عدوى الهباء الجوي تم التحقق من امتصاص العدد المطلوب من المواضيع المتميزة من قبل الطلاء الخليط الرئة كله من أجل تقرير CFU. ب) البكتيرياتم تحديد لتر الأحمال في وقت عدوى مرافقة في الرئة لست] من 3 الفئران عن طريق تحليل كفو (MTB d40/d0). بعد 12 يوما عدوى مرافقة، كانت مطلية لست] الرئة لتحليل كفو لتحديد تأثير المتصورة عدوى مرافقة على السيطرة MTB. نلاحظ، أن أعدادا المواضيع المتميزة في الرئتين زادت خلال عدوى مرافقة مع P. berghei NK65. وضع العلامات المحور السيني: الوقت بعد MTB -infection/time بعد عدوى مرافقة. مقتبس من ¹ بلوس وان، 7 (10)، e48110 بإذن.

Discussion

وصفنا كيف الفئران يمكن أن يصاب مثمر مع المواضيع المتميزة وP. berghei عبر الطرق الطبيعية للعدوى. نطبق تأسيس بروتوكولات عدوى السل إلى دراسة تجريبية ¹³ أو ¹² الملاريا والتي اعتمدت مؤخرا لدراسة لهم عدوى مرافقة بين المواضيع المتميزة والمتصورة في نموذج الفأر ^1.

الخطوات الأكثر أهمية بالنسبة لالتهابات الناجحة هي انتقال مسببات الأمراض سواء على الأرقام المطلوبة. يجب أن لا تكون الأسهم المتفطرات مضى عليها أكثر من 2 سنوات لأنها سوف تفقد جدوى مع مرور الوقت، وسوف عيار مصممة أصلا للأسهم على الأرجح لن تكون دقيقة. ونتيجة لذلك، فإن الجرعات العدوى تكون أقل بكثير مما كان متوقعا. لذلك، ينبغي تحديد التتر كفو الثقافات الأسهم كل بضعة أشهر. نفس القدر من الأهمية هو زراعة موحدة وجيل من الأسهم المواضيع المتميزة في المقام الأول. ظروف مثل الثقافةالمتوسطة، وملاحق، والوقت، وحجم يجب أن تكون موحدة لكي تكون قادرا على مقارنة البيانات من التجارب باستخدام مخزونات مختلفة من المواضيع المتميزة. المتفطرات تميل إلى تتجمع خلال الثقافة، وبالتالي فإنه من المهم للحفاظ على ظروف ثقافة موحدة، والبكتيريا الحصاد في مرحلة النمو نفسه و resuspend في كثير من الأحيان خلال aliquoting. خلاف ذلك يمكن أن يكون هناك تباين واسع في التتر كفو ونتيجة العدوى.

توليد دفعات البعوض المصابة متجانس هو خطوة حاسمة أخرى. منذ البعوض المختلفة وتتغذى على كل فأر الفردية، من المهم أن جميع من البعوض تستخدم لعدوى التجربة واحدة تأتي من نفس الدفعة والتي تستخدم فقط تلك دفعات حيث يصاب أكثر من 90٪ من البعوض.

النموذج الحالي يمكن استخدامها لتشريح الاستجابات المناعية والتحويرات المناعي في مجموعة المصابون عن طريق مقارنتها إلى الاستجابات المناعية في المضيفين المصابة واحد. يمكننا تطبيق فامنهجيات rious زارة راسخة مثل الأنسجة، المناعية، تحليل الخلوي من السكان الخلايا المناعية، أو PCR وELISA للخلوى وكشف chemokine للأنسجة أو سوائل جسم من الفائدة. تجدر الإشارة إلى أن مثل هذه النماذج الماوس على قيود معينة. في حين أن الغالبية العظمى من المصابين MTB تطوير عدوى كامنة مع عدم وجود علامات لهذه الأعراض السريرية والفئران تطوير مرض مزمن مع التدريجي أمراض الرئة. لا يزال، C57BL / 6 الفئران هي مقاومة نسبيا للإصابة MTB ولا تطوير حبيبية الكلاسيكية كما لوحظ في مرضى السل الإنسان. ونتيجة لذلك، وردود الفعل immunopathological في الماوس لا تعكس ولا مرض السل الكامنة الإنسان ولا نشطة بشكل مناسب. على الرغم من التباين بين المرض الكامنة والمزمنة في الإنسان والفأر، وقد استخدمت على نطاق واسع الفئران لتحديد ودراسة العوامل المضيفة التي تتحكم العدوى المواضيع المتميزة وأدوات قيمة والتي لا غنى عنها للتحقيقالاستجابات المناعية في الأمراض المعدية. الأهم من ذلك، القابلية للإصابة MTB اختلافا كبيرا بين السلالات الفطرية الماوس استخداما وسلالات أكثر عرضة مثل DBA أو C3H يمكن تضمينها في الدراسات وشارك في العدوى واحد. علاوة على ذلك، وبصرف النظر عن الأنواع الممرض الموصوفة هنا، يمكن أن تستخدم أي نوع من الأنواع المتفطرة الأخرى ذات الاهتمام (على سبيل المثال العزلات السريرية). وبالمثل، في حين يعيد يوجد نموذج واحد الملاريا جميع جوانب المرض الإنسان نماذج الماوس مختلفة لا تشبه جوانب مختلفة من عدوى الملاريا البشرية المكتسبة بشكل طبيعي. على سبيل المثال، P. berghei أنكا وP. ودرس yoelii YM/17XL على نطاق واسع من النماذج البشرية (المتصورة المنجلية التي يسببها) الملاريا الحادة، مع P. berghei أنكا التي تعتبر نموذجا ممتازا للإنسان malari الدماغي و ^14،15. P. berghei NK65 هو نموذج ممتاز لhyperparasitaemia وفقر الدم الحاد الملاريا، وقد تم مؤخراوصفها بأنها نموذج تجريبي لمتلازمة المرتبطة بالملاريا الحادة الضائقة التنفسية (MA-ARDS ^16). باستخدام نموذج عدوى مرافقة وصفها، ويمكن أن تظهر في الآونة الأخيرة أن المتزامنة P. عدوى berghei NK65 تفاقم السل المزمن ^1.

وبصرف النظر عن استخدام مختلف الطفيليات القوارض والملاريا، ويمكن تكييفها ترتيب وتوقيت الأحداث العدوى اعتمادا على سؤال البحث الأساسي. في هذا المجال، وقد تكون العدوى المصاحبة المتصورة في الوقت الحاضر من العدوى المكتسبة MTB أو في وقت لاحق. في كل من السيناريوهات قد تتأثر الاستجابات المناعية لMTB والمتصورة بشكل مختلف. وبالتالي، يمكن أن تصاب الفئران مع sporozoites المتصورة إما قبل أو بعد الإصابة MTB. علاوة على ذلك، يمكن الطعن الفئران في أوقات مختلفة إصابة آخر المواضيع المتميزة لتقييم أثر الاستجابة المناعية التي يسببها المتصورة على الحادة مقابل المزمنةالسل. الأهم من ذلك، عند اختيار طفيلي الملاريا لدراسة عدوى مرافقة الملاريا والسل، وينبغي للمرء أن يكون على علم بأن بعض سلالات الملاريا القوارض تسبب المرض الحاد في بعض سلالات الفئران والاستسلام للإصابة خلال أيام أو أسابيع فقط في حين MTB يسبب التهابات مزمنة وطويلة الأمد في مناعيا الفئران. وبالتالي، توقيت عدوى مرافقة أمر بالغ الأهمية من أجل تجنب الوفاة المبكرة من حيوانات التجارب.

يبقى التشكيل الحصانة المضيف عن طريق العدوى المتزامنة مع الأنواع الممرض متعددة غير مفهومة. توفر لدينا نموذج عدوى مرافقة التجريبية أداة قوية لتحقيق المتفطرة - التفاعل المتصورة مع الجهاز المناعي للمضيف المصابون وسوف تسهم في فهمنا كيف يمكن أن تؤثر coinfections المرضية، نتيجة المرض، والتطعيم، والمناعي، والعلاج.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Buraton	Schülke		active ingredients: aldehyds (formaldehyde, glutaraldehyde, oxalaldehyde, ethyl hexanal)
Middlebrook 7H9	Sigma	M0178	For Mtb broth cultures
Middlebrook 7H11	BD Biosciences	283810	Agar medium for Mtb culture
Middlebrook OADC enrichment medium	BD Biosciences	212240	Add to 7H9 and 7H11 for Mtb culture
Staining Dish	Science Services	E62542-12
24-slide Holder w/Handle	Science Services	E62543-06
Giemsas Azur-Eosin-Methylene blue solution	Merck Millipore	109204
Wright´s stain	Sigma	W0625
Inhalation Exposure System	Glas-Col
Nebulizer-Venturi	Glas-Col
Ice cream cups	Häagen-Dazs		Used as mosquito cages
Metal-frame mosquito cages	BioQuip Products	1450A