Doğal İletim üzerine Tüberküloz-Sıtma Koenfeksiyonu Çalışması için Deneysel Bir Model Mycobacterium tuberculosis Ve Plasmodium berghei</i

Özet

Tüberküloz ve sıtma insan ve tropik yoksul toplumlarda morbidite ve mortalitenin önemli nedenlerinden en yaygın enfeksiyonlardan ikisidir. Bu enfeksiyon, doğal yoldan hem patojenler ile yüklemeden sonra farelerde sıtmaya tüberküloz koenfeksiyonu sonucunu çalışma deneysel bir model sistemi kurulmuştur.

Özet

Coinfections dolayı doğal patojen organizmaların farklı türlerine coğrafi üst üste meydana gelir. Eşzamanlı enfeksiyonları büyük olasılıkla her bir patojene ilgili immün yanıtı düzenleyen ve böylece patogenezi ve hastalık sonuçlarını etkileyebilir. Koinfekte hastaların aynı zamanda anti-enfektif müdahalelere farklı şekilde yanıt verebilir. Mikobakteriler ve Sahra-altı Afrika'nın birçok yerinde coendemic her ikisi de sıtma paraziti Plasmodium, neden olarak tüberküloz arasındaki Koenfeksiyonu detaylı olarak çalışılmamıştır. Bilimsel ve sıtma tüberküloz koenfeksiyonuna modüle konak bağışıklık ve her hastalığın seyri, bize koinfekte konakta hem patojenlere elicited bağışıklık tepkilerini incelemek için izin veren deneysel bir fare modeli kurulmuş nasıl klinik son derece alakalı soru zor ama yaklaşmak için . Notun, en doğrusu mimik doğal kazanılmış insan enfeksiyonları için, deneysel gerçekleştirmeksırasıyla enfeksiyon doğal yolları, yani aerosol ve sivrisinek ısırığı, hem patojenler ile farelerin enfeksiyonları.

Giriş

İnsan popülasyonları nadiren tek bir patojene maruz kalmaktadır. Özellikle böyle Sahra-altı Afrika gibi enfeksiyonların insidansı yüksek olan bölgelerde, coinfections bir başbakan ama son derece hakir halk sağlığı sorunu oluşturmaktadır. Tüberküloz ve sıtma sırasıyla insanlarda, en yaygın bakteriyel ve paraziter enfeksiyonlar ve tropik yoksul toplumlarda morbidite ve mortalite nedenidir olmaya devam etmektedir. Koenfeksiyonu riski tüberküloz ve sıtma ve bireylerin çok sayıda arasındaki geniş coğrafi örtüşme olmasına rağmen, çok az eşzamanlı koinfekte bireylerde sıtma parazitlerinin ve tüberküloz basilinin karşı ortaya çeşitli ve genellikle mücadele immün düzenleyiciler ve efektörler arasındaki etkileşimleri hakkında bilinmektedir.

Karışık enfeksiyonların kemirgen modelleri, böylece karşılıklı gribin ışık tutan, bir konakta farklı patojenlere karşı diferansiyel bağışıklık reaksiyonlarını karakterize izinAyrıca tedavi ve önlenmesi için yeni öneriler belirlemek yardımcı olacaktır modüle patoloji ve bireysel hastalığın klinik gidişini, farklılıklara. Biz aynı ana ^1. içinde Mycobacterium tuberculosis (MTB) ile eşzamanlı enfeksiyon neden etkileri ve kemirgen Plasmodium türlerini araştırmak için bize sağlayan deneysel bir fare modeli kurduk. Önemlisi, mümkün olduğunca yakından doğal kazanılmış insan enfeksiyonları taklit etmek, bizim modeli hem patojenler tarafından kullanılan enfeksiyon doğal yolları uygular. Tüberküloz, bu nedenle esas olarak akciğerlerde gösteren bir hava enfeksiyondur. Onlar öksürme veya hapşırma sırasında bulaşıcı aerosol damlacıkları sınırdışı zaman etkeni, Mtb aerosol yolla aktif hastalığı olan kişiler tarafından iletilir. Bu nedenle, aerosol enfeksiyon doğal enfeksiyonu taklit etmek için tercih edilen bir yöntemdir. MTB içeren havadaki partiküllerin Generation kullanımı ile elde edilebilirBir inhalasyon pozlama sistemi. Bütün vücut maruz odası bulaşıcı aerosol damlacıkları enfeksiyon ² başlatılır akciğerlerin alveollerine solunması (Şekil 1) Mtb içeren deneysel hayvanlar maruz sağlar.

Öte yandan Malaria doğal bir dişi sivrisinek anopheline türü ısırması ile iletilir protozoon Apicomplexan parazit Plasmodium neden olduğu bir vektör kaynaklı bir hastalıktır. Kan yemek sırasında, enfeksiyon sporozoites konakçı deri altında yatırılır ve daha sonra, kan dolaşımı yoluyla karaciğer ulaşır. Hepatositler içinde onlar geliştirmek ve hızla karaciğer aşamalı schizontsun içine çarpın. Sonunda, olgun schizontsun delinmesine ve kırmızı hücre işgali, çoğaltma, kırmızı hücre rüptürü, ve reinvasion ³ aşamalı bir döngüsü başlatmak nerede kan akışı içine patojenik ilk-nesil merozoit binlerce bırakın. Plasmodium yaşam döngüsü pazaBazı merozoit gibi daah cinsel parazit aşamalarında, kan yemek sırasında sivrisinekler tarafından alınabilir erkek ve dişi gametositlerine, gelişir. Sivrisinek, Plasmodium sporozoites sivrisinek midgut ikamet oocystsu içinde gelişir ve sonunda başka bir konak ^3,4 içine nakil için tükürük bezlerine göç.

Deneysel hayvan modellerinde, aerosol ve böylece en uygun yol aracılığıyla Mtb teslim çok yaygın olsa da, sıtma-tüberküloz koenfeksiyonu ^5-7 ile ilgili çalışmalar dahil olmak üzere pek çok deneysel çalışmalar kemirgen Plasmodium enfeksiyon yol açan, parazitli eritrosit ile enfekte fareler ile gerçekleştirilmiştir Klinik olarak sessiz karaciğer kademeli faz hariç tutulduğunda kan aşamalı sıtma enfeksiyonuna. Bununla birlikte, anti-karaciğer aşama plasmodial bağışıklık ^8-11 için enfeksiyon ve ilgili sırasında zorunlu bir adımdır. Biz karaciğer ph dahil etmek bu nedenle önemli düşününsıtma iletim ve sırasıyla sıtma ve sıtma-tüberküloz koenfeksiyonu, her iki çalışmalarında bakım ase. Buna ek olarak, doğal olarak iletilen sporozoites yerine izole tükürük bezi türetilmiş sporozoites enjekte bite sivrisinek ile sıtma enfeksiyonu belirlemek için istenir iğne enfeksiyonlar ¹² üzerinden aktarılır daha fazla bulaşıcı olduğu gösterilmiştir. Sıtma parazitlerinin doğal iletimi için bulaşıcı sivrisinek elde etmek için tek yol omurgalı bir konakçının (burada fare) ve sivrisinek vektör hem de parazitin tüm yaşam döngüsü korumaktır. Böylece, parazit bakım için bir insectary erişim lokma doğal iletimini gerçekleştirmek için kaçınılmazdır.

Burada tarif Bizim protokol Plasmodium ile koenfeksiyonuna kronik tüberküloz ¹ üzerindeki etkilerini Sporozoitlere nasıl araştırmak için geliştirilmiştir. Bunu yapmak için, farenin aerosol M. bulaştırılır tüberküloz ve 40 gün sonra, ne zaman M. tüberküloz enfeksiyonu fareler sıtma bulaşıcı sivrisinek maruz kalan, kronik faz ulaşmıştır. Koinfekte hayvanlarda sıtma ve tüberküloz her ikisinin de sonucu sırasıyla dokusundaki kan paraziteminin ve bakteri yükü izlenmesi ile takip edilebilir. Protokolde, biz onların doğal enfeksiyon güzergahı ve ne kadar başarılı patojen bulaşmasını teyit etmek yoluyla hem de patojenler ile fareler bulaştırmak için nasıl ayrıntılı olarak anlatacağız. Bizim ellerde, hem deneysel enfeksiyonlara sık elde enfeksiyon oranı% 100'dür. Bu protokoller, en zor insan enfeksiyon hastalıklarının ikisi arasında-enfeksiyon modeli ve çalışma için bizim gibi ayrı ayrı enfeksiyonlar ya da, her iki çalışma uygulanabilir. Bu model, bu protokolde tarif edilenler dışındaki diğer Mycobacterium kemirgen ve Plasmodium türleri için de geçerlidir.

Protokol

Güvenlik Önlemleri ve Etik Beyanı

Bu tarifnamede sunulan çalışmalar, insan patojen Mtb ve kemirgen sıtma paraziti Plasmodium berghei (P. berghei) ile çalışma içerir. Mtb (suş H37Rv) ve P. ile Deneyler berghei Uygun biyo-güvenlik koşullar altında gerçekleştirilmelidir. Biyogüvenlik düzeyi (BGS) 2 laboratuarlar, P. gibi kemirgen sıtma parazitleri için gerekli dolayısıyla berghei ve Mtb için BSL 3 ve bütün-enfeksiyon çalışmalar için burada tarif edildiği. NOT: Mtb ile enfekte edilen fareler hemen yakınında diğer farelerin (kendi gözlem) enfeksiyon yayılır yok. Deneyci Spread nedenle bırakılabilir ancak uygun koruyucu giysiler her zaman BSL 3 laboratuar içi giyilmelidir vardır. Bizim kurallara göre, deneyci dış bir zaman bir atılır hangi cerrahi fırçalama, saç ağları, tek solunum ve iki çift eldiven giymekrms kabineden çekilir. Yeni olanları tekrar kabine girmeden önce konur. İki kaplar,% 2 Buraton ile bir (NOT: MTB inaktive onaylanan diğer dezenfektanlar onaylı konsantrasyonda kullanılabilir), sıvı ve bulaşıcı atık malzeme ve yüzey dekontaminasyon için bir, deneyden önce hazırlanan ve kabine içine yerleştirilir. Buna ek olarak, plastik torba bulaşıcı olmayan bir katı atıklar için kullanılacaktır. Alman kurallarına göre, Mtb türetilen Mtb kültürlerin veya doku taşıma ve işleme ile ilgili tüm iş fareler bir BSL3 laboratuvar içinde bir sınıf 2 biyogüvenlik kabini içinde yapılmalıdır bulaşmış. Mikobakterıler tutarken tedbirler her zaman aerosollerin oluşumunu önlemek için alınması gerekir.

6-8 hafta arası Erkek C57BL / 6 fareleri (Charles River), her-enfeksiyon deneyleri için kullanılan ve BSL özel bariyer koşullar altında 3 imkanları muhafaza edilmiştir. Hayvan bakımı ve deney pe edildiTarım, Çevre ve Schleswig-Holstein Eyaleti Kırsal Alanlar için Bakanlığı Hayvan Deneyleri Etik Kurulu tarafından onaylanan protokoller uyarınca rformed

Sıtma sivrisinek aşamaları elde etmek için, NMRI fareler Charles River Laboratory, Sulzfeld, Almanya 'den satın alındı ​​ve Heidelberg Üniversitesi Hayvan imkan (IBF) içinde belirli bir patojen içermeyen koşullar altında tutuldu. Tüm hayvan deneyleri Avrupa yönetmeliklerine göre yapılır ve Baden-Württemberg'de (Regierungspräsidium Karlsruhe) ve devlet yetkilileri tarafından kabul edildi.

1.. Bir Glas-Col Aerosol odacığı kullanılarak Mtb ile Farelerin enfeksiyonu Aerosol

Mtb ile deney hayvanlarının aerosol enfeksiyonu standardize etmek için en iyi yolu, bilinen CFU titrelerle dondurulmuş stoklarından mikobakterıler kullanmaktır. Stok kültürleri hazırlamak, Middlebrook 7H9 broth kültürü Mtb OADC (oleik ile desteklenmişasit, albümin, dekstroz, Katalaz) zenginleştirme ortamı ve% 0.05 Tween 80, mikobakteriler için bir karbon kaynağı ve aynı zamanda bakteriyel kümeleşmeyi önlemek için ölçer. Kültürler hasat zamanında bir OD ≤ 1 olmalıdır. Yüksek OD olarak, bakteriyel topaklanma artar ve canlılığı azalır. -80 ° C'de saklayın 1 ml'lik eş payları % 0.5 gliserol, 1 g / L asparagin ile takviye 7H11 agar plakaları üzerinde üç bağımsız şişelerin 10 katlık seyreltileri, bir dizi kaplama ile dondurulmuş stok birim (CFU) oluşturan uygun bir koloni sayısı ve OADC belirlemek ve sonra 4 koloni saymak 37 ° C'de inkübasyon hafta Aşağıda tarif edildiği gibi aerosol enfeksiyon yapın.

1. Dikkatli bir şekilde çözülme Mtb bilinen CFU titresinin stokları ve bir 27 G iğne ile donatılmış bir 1 ml şırınga ile bakteri kümeleri dağıtmak için bir süspansiyon beş kez karıştırın. Aerosol üretimini önlemek.
2. İstenen enfeksiyon dozu bağlı olarak, içine mikobakteriyel stokunun istenen hacmi aktarmaksteril PBS içeren 50 ml'lik bir tüp. Nihai hacmi, 6 ml 'dir. NOT: Bu süspansiyon içinde mikroorganizma sayısının değiştirilmesiyle, aerosol damlacıkları taşıyan bakteri oranı değişir. Biz genellikle akciğer (düşük doz enfeksiyon) başına 100 canlı basil bir alımı hedefliyoruz. Deneyimlerimize göre, bu 5,5 ml nebulize olmak üzere 6 ml'lik bir toplam hacim içinde yaklaşık 1-2 x 10 ⁶ Mtb / ml (aşağıya bakın). Bu enfeksiyon için ideal koşullar bulmak için bakterilerin farklı konsantrasyonları ile deneysel aerosol zorlukların bir dizi yapmak için tavsiye edilir. Kadar 5000 mikobakteriyel enfeksiyonlar yüksek dozda 5 bakteriler gibi birkaç başarılı bir aerosol ile fareleri enfekte etmek için kullanılabilir olarak, enfeksiyon işlemini hızlandırmak için yapılabilir ise. Enfeksiyon oranı genellikle% 100'dür.
3. Inokulum titresini belirlemek için kaplama için (gerekli nihai hacme aşan hazırlanmıştır) yeterli hacmi çıkarın; genellikle teknik triplicates plaka 500 ul çıkarın.
4. Hayvanların koyunBir kompartman örgü dairesel aerosol odasının içinde sepet (sepet başına bir fare) ve aerosol odasının kapağını kapatın. NOT: Diğer modeller 20 fare ağırlayacak her biri beş ayrı bölmeleri, oluşan bir pasta şeklinde sepet ile donatılmıştır.
5. Üç paslanmaz çelik soket bağlantıları için Venturi-nebulizatör ünitesini takın.
6. Bir kör 18 G iğne ile donatılmış 10 ml'lik bir şırınga ile 50 ml tüpten mikobakteriyel süspansiyon çıkarın ve kapalı bir taşıma kutusu içinde aerosol bölmeye şırınga taşır.
7. Nebulizer biriminin vidalı kapağı çıkarın ve dikkatle nebulizer içine mikobakterler süspansiyonu enjekte. Aerosollerin nesil kaçının. 2% Buraton içeren bir kesici kabın içine şırınga atın. Vidalı kapaklı nebulizatörü Seal.
8. Ana güç anahtarı ve UV lamba açın. Kontrol tuş takımı üzerindeki ekran "Glas-Col Aparatı Co" gösterir.
9. Program düğmesini açın. Ekran iradegöstermek "nebulizatör hazır mı?" "sepet yerleştirilmiş mi?" ne zaman hazır enter tuşuna basın. " Enter tuşuna basın.
10. Ekranda "Onceden Zaman 900 girin" gösterir, bu 900 sn (egzoz havayı dekontamine) yakma fırını için ön ısıtma zamanı demektir. Enter tuşuna basın.
11. Göstergede "nebulizing süresi 1.800 Enter" olacaktır, bu spreyleme süresi varsayılan olarak 1.800 sn ayarlanır demektir. Nebulizing süresini uzatmak amacıyla, "2400" girin ve enter tuşuna basın. Not: nebulize edici döngüsü sırasında, basınç altında hava böylece mikobakteriler içeren küçük bir aerosol damlacıkları üreten, süspansiyon atomize. Ana hava akımı, bu damlacıklar (boyut olarak yaklaşık 2-5 um) aerosol odasına gerçekleştirilmektedir.
12. Ekranda "CD saatler 1.800 Enter" olacaktır, bu çürüme döngü 1.800 sn sürer demektir. "2.400" ve enter tuşuna basın ayarlayın. NOT: Bu döngü sırasında, bulut hangi u inşa edilmiştirnebulize edici döngüsü sırasında aerosol odası içinde p çürüme olabilir. Küçük damlacıklar, deney hayvanları tarafından teneffüs edilir.
13. Ekranda "Aralık Saat 900 girin" gösterecek, bu UV ışığı dekontaminasyon çevrimi 900 sn alacak demektir. Enter tuşuna basın. Makine ön ısıtma, nebulizing, bulut çürüme ve UV dekontaminasyon ile bisiklet başlayacaktır.
    DİKKAT: ve döngü başlar nebulizing zaman sıkıştırılmış hava akış metre 10 feet küp / saat (kontrol; buna göre hava kontrol valfi ayarlamak vakum debi ölçer (gerekirse vakum kontrol valfini ayarlamak ön ısıtma döngüsü başladığında kontrol) 60 ayak küp / saat belirtmelidir .)
14. Döngüsü tamamlandığında, tuş takımı "Süreci Tamamlandı - Numune Kaldır" gösterecektir. Program, UV ve ana güç anahtarını kapatın.
15. Mikobakteri süspansiyon tamamen nebulized ve değilse, dikkatli ile donatılmış uygun bir şırınga ile süspansiyon kaldırarak kalan hacmi rekor olup olmadığını kontrol edin18 G künt bir iğne. Geri kalan hacmi fazla 1 mi olmamalıdır.
16. Eklem nebulizatörü çıkarın ve 2 saat en az% 2 Buraton içeren bir tavada yerleştirin, genellikle dezenfeksiyon O / incelemeleri yapılır Daha sonra, taze bir tavaya nebulizatörü aktarmak ve su ile iyice durulayın. Kurumaya nebulizatörü bırakın.
17. Aerosol odasını açın ve kafeslerine hayvanların dönmek. Otoklav torbaları ve otoklavda çanta sepetler. . Güvenlik nedenlerinden dolayı, motorlu bir hava temizleyici respiratör Bu işlem sırasında giyilmelidir: 2% Buraton NOT aerosol odasının iç yüzeyleri silerek temizleyin.
18. 7H11 agar plakaları üzerinde bir teknik üç kez (3 x 100 ul), plaka 10-kat seyreltme (adım 1.3) mikobakteriyel süspansiyonun geri kalan 500 ul kullanılması.

2. Akciğerler İstenilen CFU Alımı doğrulayın

Deney hayvanlarının aerosol enfeksiyondan bir gün sonra bakteriyel lo belirlerİstenen CFU alımını teyit etmek için belirlenen kontrol hayvanların akciğerlerinde ad. NOT: Biz genellikle günde 1 CFU belirlenmesi için 3-5 farelerin ekstra grubunu belirlemek.

Zamanla Mtb enfeksiyonun seyrini izlemek için, mikobakteriyel doku yük CFU belirlenmesi için bütün organ homojenatlarının seri dilüsyonları kaplama ile incelenebilir. Akciğer tüberkülozunda hastalık tezahürü için birincil site ancak dalak, karaciğer ve lenf düğümleri genellikle buna göre analiz edilir. Kaplama olmak üzere dilüsyonlar dokuda, yanı sıra organ ve bir zaman noktasında farklı bakteri yüklere neden olur, ilk aşı (yüksek doz genel düşük doz) bağlıdır organlardaki beklenen mikobakteriyel yüke bağlıdır analiz edilebilir. Düşük dozda enfeksiyonu üzerine, akciğerde Mtb H37Rv bakteriyel yük genellikle günde 25-30 arasında bir düzlüğe ulaşır.

1. CO ₂ boğulma ya: ötenazi hayvanları (Ötanazi yerleştirinTerminal bir sınıf II biyogüvenlik kabini içinde bir diseksiyon gemide emici kağıt üzerinde anestezi) ve% 70 etanol ile dezenfekte fareler. NOT:% 70 alkol sadece yüzey dekontaminasyon için ve MTB öldürmez.
2. Karın ortasında küçük bir kesi yapmak ve başının üstünde fare derisi geri çekin.
3. Cerrahi makas ile karın ve göğüs kafesi açın ve akciğerler erişilebilir, böylece göğüs duvarını kaldırın.
4. Akciğerleri çıkarın ve homojen hale getirme tamponunda (steril su /% 1 h / h Tween 80/1% w / v albümini) ile bir 15 ml tüp içine aktarın.
5. Küçük bir Petri kabı içine 100 mikron elek ile 5 ml şırınga gerginlik akciğerlerin pistonu kullanarak.
6. Gömme elekler birkaç kez bir engel ucu ile donatılmış bir 1 ml pipet kullanılarak ve 8 agar plakaları arasında akciğer homojenatı dağıtmak (yaklaşık 250 ul / plaka;. Emin bir de kuru bir yüzeye sahip olun).
7. Dikkatlice% 2 içine atılan tek kullanımlık gübre kullanılarak örnekleri plakaBuraton.
8. Kabine içinde kurumaya agar plakaları bırakın. , Parafilm ile her bir levha mühür alüminyum folyo sarılmakta ve en az 4 hafta süreyle 37 ° C'de inkübe dik.

3. Kaçış-proof Sivrisinek Kafesleri İnşaatı

Kemirgen Plasmodium suşları insanlara zararlı değildir. Bununla birlikte, Mtb-enfekte edilmiş fareler parazit ve işin alıcıları olduğu BSL 3 koşullar altında yapılır, önlemler, kafesleri kaçmasını sivrisinek önlemek için gereklidir. Planlanan enfeksiyon rejimine bağlı olarak, otoklavlanabilir ve metal çerçeve kafesler veya kendi kendine yapılan tek kafesler yeniden kullanılabilir. Deney hayvanlarının bite enfeksiyonu ile fare başına sivrisinek tanımlanmış bir dizi ile gerçekleştirilebilir için gerekli ise, bu ikinci olanlar tavsiye edilmektedir. Self-made kafesleri gerekiyorsa, sivrisinek ve laboratuvar güvenliği sağlığı gibi tam özelliklerine kafesleri hazırlamak onların sou bağlıdırnd inşaat (Şekil 2).

1. Böyle bir yarım litrelik dondurma karton veya kağıt kahve fincan (Şekil 2) gibi bir karton alın.
2. Kartonun yan içine, küçük bir açıklık kesin ve sivrisinekler için güvenli bir giriş oluşturmak için her bir parça kesilmiş bir yarık ile lateks bir çift tabaka ile kapatın. Not: açıklığı 2 cm x 2 cm arasında bir toplam boyut vardır, biz getirmek ve / veya almak-out sivrisinekler için kullanılan boru (aspiratör cihazı) bir vakum pompasına bağlı bir tadil edilmiş 15 ml Falcon tüpü olan ve bu nedenle olarak hizmet 1.5 cm'lik bir çapa sahip bir aspiratör.
3. Damlar kadar emmek için kartonun iç altındaki filtre kağıt parçası bantlayın.
4. Netleştirme (Naylon örgü, çift katmanlı, büyüklüğü 1 mm x 1 mm) ile dondurma bardak kapatın kapatın ve bant ve elastik bant ile karton düzeltmek.
5. Fare başına sivrisinek sayısı tanımlanmış gerekmektedir enfeksiyon deneyleri için, enfekte olmuş 10-15 sivrisinek ile kafesleri hazırlamak, bunların her biri, ideal bir av içeren10.000 yabani tip tükürük bezi P. erage berghei sporozoites.
6. İdeal olarak, önce kan yemek yerine, 24 saat süre ile sivrisinekleri açlıktan.

4. Sivrisinek Bite Farelerde Sıtma Enfeksiyon

Burada kullanılan kemirgen malarya paraziti olan P. berghei ancak ilgi duyulan herhangi bir başka kemirgen Plasmodium suşu kullanılabilir. Bulaşıcı sivrisinek elde etmek için sporozoit iletim için parazitin bütün yaşam döngüsü omurgalı bir konakçının (fare) ve sivrisinek vektör hem de muhafaza edilmektedir. Parazit bakım bir insectary gerçekleştirilir. Doğal iletim deneyler için, tükürük bezi sporozoitler başına en az sayıda en az 10,000 olmalıdır. Detaylı protokollerin parazit bakım biz Moll ve ark Sıtma Araştırma Yöntemleri bakın., 2013.

1. Naif fare veya Ketamine ile Mtb ile 40 gün boyunca hayvanlar preinfected uyuşturan (100 mg / kg)intraperitoneal enjeksiyon ile (200 ul / fare) ile ve Xylazine (7 mg / kg) çözeltisi. NOT: Mtb ve Plasmodium enfeksiyonu arasındaki süre yatan araştırma sorusuna bağlı olarak ayarlanabilir. Aynı şekilde, patojen zorlukların sırası tersine çevrilebilir, yani önce fareler Mtb enfeksiyonu bulaşıcı sivrisinek ısırığı maruz olabilir.
2. Sivrisinek kafeslere (fare oranı olarak tanımlanır sivrisinek için sivrisinek kafes başına bir fare) ve örgü üzerine anestezi fareler yerleştirin ve sivrisinek 10-15 dakika boyunca zarın içinden beslemek için izin verir. Not: sivrisinek bağırsaklarında kan varlığı besleme ve dolayısıyla, iletim sporozoit ifade eder.
3. Geri kafesler içine fare aktarmak ve bunlar anestezi uyanmak kadar sürekli denetleyecek. Kağıt havlu üzerine değil, yatak (boğulma tehlikesi) yerleştirin fareler ve (yakından birlikte yer ve kağıt havlu ile organları kapsayan) sıcak tutmak: Not.
4. Nett ile,% 70 etanol ya da diğer dezenfektan püskürterek sivrisinek öldürmekKafesin ing. Tek olanlar kullanılmış olsaydı Otoklav kafesleri ve atın.

5. İzleme Parazitemi

1. Delinme kuyruk çok bir iğne ile sona erdirmek ve bir slayt her sonunda bir damla kan toplamak damarlar.
2. Slaytın uzunluğunun yarısından bir damla kan çekmek için başka bir slayt kullanın. Ikinci smear için diğer kenarı kullanmak için dağıtıcıya ters çevirin. Kuru hava slaytlar bırakın.
3. Giemsa leke
   1. Slayt sahipleri slaytlar yerleştirin ve mutlak metanol kısa daldırma tarafından kan smear düzeltmek. NOT: cam eşya kullanımı tüm çözümler için polipropilen cuvettes kullanmak BSL 3 minimumda tutulmalıdır çünkü.
   2. Giemsa lekesi içindeki (deiyonize su içinde 1:10) bırakın. 10 dakika sonra, fazla leke uzak durulamak için deiyonize su ile bir kaç kez doldurulmuş boyama küvetler içinde ve dışında slaytlar daldırma.
   3. Son olarak, dik bir konumda hava kuru kayar.
4. ALTERNATİF LEKE: Wright & #180; s leke
   1. Metanol içinde 1 mg / ml 'lik bir konsantrasyonda Wright lekesi çözülür.
   2. Kullanmadan önce katlanmış filtre üzerinden filtre.
   3. Boyama çözüm kan smear daldırın ve 4 dakika boyunca inkübe (NOT: boyama çözüm dayanır metanol gibi smear metanol tespit gerekli değildir).
   4. Yukarıda tarif edildiği gibi, iyonu giderilmiş su içinde durulama slaytlar ile yıkanır ve hava ile kurumasına slaytlar bırakın.
   5. Giemsa / Wright 'ın leke tamamlandıktan sonra, hafifçe bir Buraton içeren bertaraf pota kullanılan tüm reaktifler aktarın.
5. Kan yayması analizi
   1. Yağ daldırma ile 100 misli büyütmede, ışık mikroskobu ile lekeli kan smear analiz edin.
   2. Eritrositler, bir tek tabaka halinde düzenlenmiş kan yayma bir alanda enfekte edilmemiş ve enfekte eritrositler sayısı.
   3. Iyi tanımlanmış bir paraziteminin elde etmek için, bir tek tabaka eritrosit gösteren görünümü, en az 10 farklı alanları sayılır.
   4. Calculeritrositlerin sayısına göre parazitli eritrosit sayısına bölünmesi ve 100 ile çarpılması ile (% olarak) göreli paraziteminin yedi.

Sonuçlar

Mtb ve P. ile farelerin enfeksiyonu doğal yoldan örneğin, aerosol ve sivrisinek ısırığı, sırasıyla, her hayvan (Tablo 1) tutarlı ve tekrarlanabilir enfeksiyon sonuçları ile berghei ^1. Biz başarılı enfeksiyonu ve kan sırasıyla (P. berghei parazitemisi) ve farklı organlarda Mtb yükü, başlangıçtaki oluşumu (prepatensi) ve parazitlerin sayısını belirleyerek sıtma ve tüberküloz hem ders izleyebilirsiniz. Bulaşıcı sivrisinek ısırması ile başarılı bir sıtma paraziti iletiminin bir örneği, Tablo 1 ve Şekil 3 'de gösterilmiştir. 4-5 gün sonra (Tablo 1 ve Şekil 3A), kan-aşaması parazitlerin varlığı ile teyit edildiği gibi, her bir fare 10-sporozoit bulaşmış sivrisinek Besleme% 100 enfeksiyon oranı ile sonuçlanmıştır. Önemli bir şekilde, aynı deney gr tek tek farelerden kan içindeki parazit numaraları bulmakoup, tutarlı ve tekrarlanabilir enfeksiyon sivrisinek ısırığı sonuçlarına göre bu sporozoit iletimini göstermektedir. Mtb-koinfekte hayvanlannınki ile naif kontrol farelerinde hale gelmesinden karşılaştırarak, bu açık hale gelmesinden biraz Mtb (Tablo 1, Şekil 3B) ile preinfected edilmiş farelerde gecikir görebilirsiniz ^1. Daha önce ¹ rapor gibi Şekil 3B gösterildiği gibi, biz Giemsa lekeli kan lekeleriyle günlük izleme parazitemi tarafından sıtma seyrine Mtb koenfeksiyonu etkisini belirleyebilirsiniz.

Farelerin bireysel (Şekil 4A) arasında göreceli olarak düşük bir değişkenlik akciğerlerdeki bakteri başarılı depozisyonunda bir solunması sistemi sonuçları kullanılmasıyla Mtb ile farelerin enfeksiyonu. Biz akciğerler ve CFU belirlenmesi ile zamanla ilgi diğer organlarda mikrobakteriyel yükleri takip edebilirsiniz. Ciğerlerinde mikobakteriyel yük için bir örnekMtb P. yokluğunda veya varlığında, C57BL / 6 fareleri enfekte berghei Şekil 4B'de gösterilmiştir.

Tablo 1. Prepatensi sivrisinek ısırması ile sporozoit iletiminden sonra. Tüm fareler P. doğal iletiminden sonra kan-aşamalı enfeksiyonları geliştirilen berghei sivrisinek ısırığı ile Sporozoitlere. ¹ PLoS ONE, izni ile 7 (10), e48110 uyarlanmıştır.

Deney fare grubu (C57BL / 6)	10 bulaşıcı sivrisinek ısırıkları ile meydan	Grup başına hayvan kan kademeli pozitif hayvan / No No	Ortalama prepatensi [d]
naif	P. berghei	07/07	4,4
Mtb enfekte	P. berghei	07/07	5,5 d>

Şekil 1. Deneysel prosedür genel şeması. C57BL / 6 fareler, Glas-Col aerosol odasındaki Mtb içeren aerosol damlacıkları maruz kalmaktadır. Bir gün aerosol enfeksiyondan sonra, Mtb alımının akciğerin CFU analizi ile doğrulanır. (Tüberküloz enfekte farelerde kronik hale gelmiştir) Mtb meydan, hayvanlar P. maruz kalan yaklaşık 40 gün sonra berghei sivrisinek enfekte. Başarılı sporozoit iletim onaylamak ve Plasmodium enfeksiyonun seyrini takip etmek, parazitemisi sivrisinek ısırığı 3 gün sonra başlayan Giemsa lekeli kan lekeleriyle günlük takip edilmektedir.

/ Files/ftp_upload/50829/50829fig2highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50829/50829fig2.jpg "/>
Şekil 2. Bir sivrisinek kafesinin kroki. Bulaşıcı sivrisinek gibi bir yarım litrelik dondurma karton gibi bir karton içinde yer alır. Küçük bir açıklık kartonun yan kesilir ve sivrisinekler için güvenli bir giriş oluşturmak için her bir parça kesilmiş bir yarık ile lateks bir çift tabaka ile kaplanır. Filtre kağıt parçası damlaları kadar emmek için kartonun iç alt bantlanmış. Dondurma bardak bant ve elastik bant ile kartonun sabitlenmiş olduğu bir (Nylon ağ) örgü ile kapalıdır.

Şekil 3,. Parazitli eritrosit (Ölçek bar, 20 & # gösteren bir Wright `ın lekeli kan yaymasında kan parazitemisi. A) Örnek181;. Fare kanında m) B) Parazitemi günde Giemsa lekeli kan lekesi analizi ile izlenmiştir. Koinfekte farenin Plasmodium tek enfekte edilmiş farelerin (n = 10) ile karşılaştırıldığında daha düşük bir paraziteminin sahiptir; sonuçlar ± SD aracı olarak gösterilmiştir; *** p <0.001. ¹ PLoS ONE, izni ile 7 (10), e48110 yayımlanmaktadır.

Şekil 4. Akciğerde Mtb tespiti. C57BL / 6 fareleri aerosol Mtb 100 CFU ile tehdit edildi ve P ile 40 gün sonra, koinfekte berghei sivrisinek ısırmasıyla. A) bir gün aerosol Mtb enfeksiyonundan sonra, istenen sayıda alım CFU belirlenmesi için bütün akciğer homojenatları kaplama ile doğrulanmıştır. B) Bakterilerkoenfeksiyonu zamanında l yükler CFU analizi (Mtb d40/d0) üzerinden 3 fareden Akciğer lizatları içinde belirlenmiştir. 12 gün koenfeksiyonu sonra, akciğer lisatlar Mtb kontrolü Plasmodium koenfeksiyonu etkisini belirlemek CFU analiz için kaplandı. Akciğerlerde Mtb P. numaraları ile birlikte-enfeksiyon sırasında arttığını, dikkat berghei NK65. X-ekseni etiketleme: koenfeksiyonu sonra Mtb -infection/time sonra zaman. ¹ PLoS ONE, izni ile 7 (10), e48110 uyarlanmıştır.

Tartışmalar

Biz fareler verimli Mtb ve P. ile enfekte olabilir nasıl tarif Enfeksiyon doğal yolla berghei. Biz deneysel tüberküloz ¹³ veya sıtma ¹² çalışma enfeksiyon protokolleri kurulan ve son zamanlarda fare modelinde ¹ Mtb ve Plasmodium arasında Koenfeksiyonu incelemek için onları kabul uygulanır.

Başarılı enfeksiyon için en kritik adımlar, istenen sayı hem de patojen iletim bulunmaktadır. Zamanla canlılığını kaybeder çünkü Mikobakteriyel stokları 2 yıldan eski olmamalı ve stokların başlangıçta belirlenen titre büyük olasılıkla artık doğru olacaktır. Bunun bir sonucu olarak, enfeksiyon dozlar beklenenden daha düşük olacaktır. Bu nedenle, stok kültürleri CFU titerleri birkaç ayda belirlenmelidir. Aynı derecede önemli ilk etapta standart yetiştirme ve Mtb stoklarının nesil. Gibi kültür koşullarıorta, ek, zaman ve hacim Mtb farklı stokları kullanılarak yapılan deneylerden elde verileri karşılaştırma yapabilmek için standardize edilmelidir. Mikobakteri bu nedenle hasat bakteri aynı büyüme aşamasında, standart kültür koşulları tutmak ve şişelemeden sırasında sık sık tekrar süspansiyon önemlidir, kültür sırasında gelme eğilimindedir. Aksi CFU titreleri ve enfeksiyon sonucu geniş bir varyasyon olabilir.

Homojen enfekte sivrisinek toplu nesil bir başka önemli adımdır. Farklı sivrisinek, her bir fare doyurmaya bu yana, bir enfeksiyon deney için kullanılan sivrisinek aynı partiden gelen ve sivrisineklerin% 90'ından fazlası bulaşmış yalnızca toplu kullanılması önemlidir.

Mevcut model bir enfekte edilmiş bağışıklık yanıtlarına karşılaştırarak bir koinfekte konakçıda bağışıklık karşılıklarının ve bağışıklık modülasyon incelemek için kullanılabilir. Biz va uygulayabilirsinizbu tipi, immünohistokimya, immün hücre popülasyonlarının sitometri analizi ya da ilgi konusu doku ya da vücut sıvılarını sitokin ve kemokin tespiti için PCR ve ELISA gibi rious iyi kurulmuş yöntemleri. Bu tür fare modelleri bazı kısıtlamalar olduğu unutulmamalıdır. Mtb ile enfekte kişilerin çoğunluğu klinik belirtilerin hiçbir belirti ile bir latent enfeksiyon gelişir ise, fareler, ilerleyici akciğer patolojisi olan bir kronik hastalığı gelişebilir. Yine de, C57BL / 6 fareleri, Mtb çok enfeksiyona karşı dayanıklı olup, tüberküloz, insan hastalarda görülen gibi klasik granülom gelişmez. Sonuç olarak, fare, otoimmün reaksiyonların uygun şekilde de gizli, ne de aktif insan tüberküloz hastalığına yansıtmaktadır. Insan ve fare latent ve kronik hastalığı arasındaki tutarsızlık rağmen, fareler yoğun Mtb enfeksiyonu kontrol etmek ve araştırmak için değerli ve vazgeçilmez araçlardır konakçı faktörleri belirlemek ve incelemek için kullanılmıştırbulaşıcı hastalıklarda bağışıklık tepkileri. Önemli olarak, Mtb enfeksiyona karşı hassasiyet yaygın olarak kullanılan fare soylannda ve bu DBA veya C3H daha fazla duyarlı suşları arasında önemli farklılıklar ko-ve tek enfeksiyon çalışmalara dahil edilebilir. Ayrıca, dışında burada tarif edilen patojen türünden, de (örneğin, klinik izolat) herhangi bir başka Mycobacterium türleri kullanılabilir. Tek bir sıtma modeli, insan hastalık farklı fare modellerinin tüm yönleriyle çoğaltır Aynı şekilde, yakından doğal kazanılmış insan sıtma enfeksiyonu farklı yönlerini benzemektedir. Örneğin, P. berghei ANKA ve P. yoelii YM/17XL yaygın olarak P., insan (P. falciparum kaynaklı) ağır sıtma modelleri çalışılmaktadır berghei ANKA insan serebral malari s ^14,15 için mükemmel bir model olarak kabul ediliyor. P. berghei NK65 hyperparasitaemia ve akut sıtma anemi için mükemmel bir model olduğunu ve son zamanlarda olmuştursıtma ilişkili akut solunum distres sendromu (ARDS ^MA-16) için deneysel bir modeli olarak tarif. Açıklanan koenfeksiyonuna modelini kullanarak, son zamanlarda gösteriyor ki eşzamanlı P. berghei NK65 enfeksiyonu kronik tüberküloz ¹ şiddetlendirir.

Apart farklı kemirgen sıtma parazitleri kullanarak, enfeksiyon olayların sırası ve zamanlaması yatan araştırma sorusuna bağlı olarak adapte edilebilir. Alanında, eşlik eden enfeksiyonların Plasmodium Mtb enfeksiyonu zamanında mevcut ya da sonradan edinilmiş olabilir. Her iki senaryoda da Mtb ve Plasmodium bağışıklık tepkileri farklı şekilde etkilenebilir. Bu nedenle, fareler önce veya Mtb sonra enfeksiyon ya Plasmodium sporozoitler ile enfekte olabilir. Dahası, fareler farklı zamanlarda itiraz edilebilir kronik karşı akut üzerinde Plasmodium-uyarılmış bağışıklık tepkisinin etkisini değerlendirmek için Mtb efeksiyonutüberküloz. Sıtma tüberküloz Koenfeksiyonu eğitim için bir sıtma paraziti seçerken önemlisi, bir bazı kemirgen Plasmodium suşları bazı fare türlerinde akut hastalığa neden ve Mtb kronik ve imünokompetan uzun süreli enfeksiyonlara neden olurken, sadece gün veya hafta içinde enfeksiyon yenik farkında olmalıdır fareler. Bu nedenle, koenfeksiyonu zamanlaması deney hayvanlarının erken ölüm önlemek için çok önemlidir.

Birden fazla patojen türleri ile aynı anda bir ev sahibi enfeksiyonu ile bağışıklık modülasyonu az anlaşılmaktadır. Bir koinfekte konağın bağışıklık sistemi ile Plasmodium etkileşim ve coinfections patogenezi, hastalık sonucu, aşılama, Immunodiagnostics ve tedavisi nasıl etkilediğini anlamamıza katkıda bulunacaktır - Bizim deneysel koenfeksiyonuna modeli Mycobacterium araştırmak için güçlü bir araç sağlar.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Buraton	Schülke		active ingredients: aldehyds (formaldehyde, glutaraldehyde, oxalaldehyde, ethyl hexanal)
Middlebrook 7H9	Sigma	M0178	For Mtb broth cultures
Middlebrook 7H11	BD Biosciences	283810	Agar medium for Mtb culture
Middlebrook OADC enrichment medium	BD Biosciences	212240	Add to 7H9 and 7H11 for Mtb culture
Staining Dish	Science Services	E62542-12
24-slide Holder w/Handle	Science Services	E62543-06
Giemsas Azur-Eosin-Methylene blue solution	Merck Millipore	109204
Wright´s stain	Sigma	W0625
Inhalation Exposure System	Glas-Col
Nebulizer-Venturi	Glas-Col
Ice cream cups	Häagen-Dazs		Used as mosquito cages
Metal-frame mosquito cages	BioQuip Products	1450A