يشتغل المغناطيسي النائية متري تحقيقات ل<em&gt; في الموقع</em&gt; رسم الخرائط 3D من البكتيريا بيوفيلم الخصائص الفيزيائية

Summary

يبين هذه الورقة منهجية الأصلي على أساس يشتغل النائية من الجزيئات المغناطيسية المصنفة في بيوفيلم البكتيرية وتطوير ملاقط المغناطيسي مخصص لقياس في الموقع الخواص الميكانيكية المحلية من المادة الحية المعقدة التي بناها الكائنات الحية الدقيقة في الواجهات.

Abstract

التصاق البكتيريا والنمو على واجهات تؤدي إلى تشكيل ثلاثي الأبعاد هياكل غير المتجانسة يسمى الأغشية الحيوية. وتعقد الخلايا مسكن في هذه الهياكل معا عن طريق التفاعلات المادية بوساطة شبكة من المواد البوليمرية خارج الخلية. الأغشية الحيوية البكتيرية تؤثر العديد من الأنشطة البشرية وفهم خصائصها أمر حاسم لتحسين السيطرة على تنميتها - صيانة أو القضاء - اعتمادا على نتائج سلبية أو المنفعة الخاصة بهم. وتصف هذه الورقة منهجية جديدة تهدف إلى قياس في الموقع الخصائص الفيزيائية المحلية من بيوفيلم التي كانت، حتى الآن، درست فقط من منظور المواد العيانية ومتجانسة. التجربة الموصوفة هنا ينطوي على إدخال الجزيئات المغناطيسية في بيوفيلم المتزايد على البذور المحلية تحقيقات التي يمكن دفعتها عن بعد دون إزعاج الخصائص الهيكلية للبيوفيلم. كانت ملاقط مخصصة المغناطيسي ديفيمتخطى لممارسة القوة تعريف على كل الجسيمات جزءا لا يتجزأ من بيوفيلم. هي التي شنت الإعداد على مسرح المجهر لتمكين تسجيل الوقت الفاصل بين الصور من فترة سحب الجسيمات. ثم يتم استخراج مسارات الجسيمات من تسلسل سحب ويتم اشتقاق المعلمات اللزجة المحلية من كل منحنى النزوح الجسيمات، وبالتالي توفير التوزيع المكاني 3D من المعلمات. اكتساب نظرة ثاقبة بيوفيلم الشخصي الميكانيكية أمر ضروري من وجهة مهندس وجهة نظر لأغراض المراقبة بيوفيلم ولكن أيضا من منظور الأساسية لتوضيح العلاقة بين الخصائص المعمارية وعلم الأحياء محددة من هذه الهياكل.

Introduction

الأغشية الحيوية البكتيرية هي مجتمعات من البكتيريا المرتبطة السطوح البيولوجية أو اصطناعية ^1-3. انهم يشكلون بواسطة آلية التصاق النمو إلى جانب إنتاج السكاريد الغنية المصفوفة خارج الخلية التي تحمي واستقرار الصرح ^4،5. هذه الأغشية الحيوية ليست مجرد تجمعات من الخلايا السلبي عالقة على الأسطح، ولكن النظم البيولوجية المعقدة الديناميكية المنظمة و. عند التبديل من البكتيريا العوالق لنمط الحياة بيوفيلم، ويلاحظ التغيرات في التعبير الجيني وعلم وظائف الأعضاء المحمولة، فضلا عن زيادة مقاومة مضادات الميكروبات لاستضافة والدفاعات المناعية يجري في أصل العديد من الالتهابات المستمرة والمزمنة ^6. ومع ذلك، فإن التنمية التي تسيطر عليها هذه الهياكل يعيشون توفر أيضا فرصا للتطبيقات الصناعية والبيئية، مثل المعالجة البيولوجية من مواقع النفايات الخطرة، والبيولوجية الترشيح من المياه الصناعية أو تشكيل حواجز الحيوي لحماية التربة والمياه الجوفية من كونتامانأوجه.

بينما الميزات الجزيئية محددة لطريقة بيوفيلم الحياة موصوفة على نحو متزايد، وآليات القيادة وتنمية المجتمع واستمرار تزال غير واضحة. استخدام التطورات الحديثة على قياسات الميكروسكيل باستخدام المسح الكهروكيميائية أو مضان المجهر، وقد ثبت أن هذه المنظمات الذين يعيشون لعرض كبيرة الهيكلية والكيميائية والبيولوجية التجانس ^7. حتى الآن، وحتى الآن، والميكانيكا بيوفيلم وقد تم فحص أساسا ظاهريا. على سبيل المثال، مراقبة اللافتات بيوفيلم تشوه بسبب الاختلافات في معدلات تدفق السوائل ^8،9، ضغط ذو محورين من القطع المتوسط ​​بيوفيلم رفع من أجار أو نمت على غطاء ينزلق ^10،11، والقص من بيوفيلم جمعها من البيئة ومن ثم نقلها إلى مواز لوحة مقياس غلفاني ^12،13، القوة الذرية الطيفي باستخدام حبة الزجاج والمغلفة مع بيوفيلم البكتيرية تعلق على ناتئ فؤاد ¹⁴ أو ميكر مخصصطريقة ocantilever لقياس قوة الشد من شظايا بيوفيلم فصل ^15،16 تم تنفيذها خلال السنوات العشر الأخيرة، وتوفير معلومات مفيدة عن طبيعة اللزجة من المواد ^17. ومع ذلك، يبدو من المرجح أن المعلومات المتعلقة بيوفيلم في الخواص الميكانيكية الموضع يتم فقدان عندما تتم إزالة المواد من بيئتها الأصلية، والتي كان الحال في هذه النهج في كثير من الأحيان. وعلاوة على ذلك، ومعاملة بيوفيلم كمادة متجانسة يفتقد المعلومات على التجانس ممكن من الخواص الفيزيائية داخل المجتمع. وبالتالي، لا يمكن ان اعترف آثار الدقيق للهيكل الميكانيكا في تشكيل بيوفيلم والصفات البيولوجية مثل الزخرفة التعبير الجيني أو التدرجات الكيميائية. في التقدم نحو وصف الميكروسكيل من بيوفيلم الخصائص الفيزيائية، هناك حاجة إلى أدوات جديدة مخصصة.

تفاصيل هذه الورقة مقاربة الأصلي تصور لتحقيققياس المعلمات الميكانيكية المحلية في الموقع، من دون إزعاج بيوفيلم وتمكين الرسم للتوزيع المكاني للخصائص المواد الميكروسكيل ثم عدم تجانس الميكانيكية. مبدأ التجربة تقع على المنشطات من بيوفيلم المتنامية مع المجهرية الدقيقة المغناطيسي تليها التحميل الخاصة بهم عن بعد باستخدام ملاقط المغناطيسي في بيوفيلم ناضجة. النزوح الجسيمات تحت رقابة تطبيق القوة المغناطيسية تصوير تحت المجهر تمكن المحلية الاشتقاق المعلمة اللزجة، كل جسيم الإبلاغ البيئة المحلية الخاصة بها. من هذه البيانات، يمكن استخلاص الشخصى 3D الميكانيكية للبيوفيلم، وكشف المكانية والبيئية الإعتماد الشرط. سيتم عرض التجربة كلها هنا على E. بيوفيلم القولونية التي أدلى بها سلالة معدلة وراثيا تحمل مثل F-البلازميد مزال الكظم. النتائج بالتفصيل في ورقة حديثة ¹⁸ تقديم رؤية فريدة من الداخل ميكانيكا بيوفيلم سليمة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. البكتيريا الثقافة والتعليق التحضير

1. اختيار مستعمرة نمت حديثا من استذابة مرق (LB) لوحة أجار، تطعيم في 5 مل السائل المتوسطة LB تحتوي على 100 ​​μ غ / مل الأمبيسلين و 7.5 μ غ / مل التتراسيكلين واحتضان لمدة 5-6 ساعة عند 37 درجة مئوية على لتهز النظام الأساسي.
2. ثم، إضافة 100 μ لتر من ثقافة البكتيرية في 5 مل الحد الأدنى المتوسطة (M63B1) تستكمل مع 0.4٪ الجلوكوز ونفس تركيزات المضادات الحيوية. احتضان هذا بين عشية وضحاها الثقافة المخفف الطازج عند 37 درجة مئوية على منصة تهتز.
3. بعد 16 ساعة من الحضانة، إضافة 100 ميكرولتر الثقافة بين عشية وضحاها إلى 5 مل M63B1، 0.4٪ الجلوكوز. إبقاء الأنبوب في 37 درجة مئوية إلى منصة تهتز حتى 0.5 OD يتم التوصل إليه. تعليق ثم هو على استعداد للحقن في القناة التجربة لتشكيل بيوفيلم.

2. إعداد الجسيمات المغناطيسية

1. يستغرق 10 ميكرولتر الجزيئات المغناطيسية -2.8 μ م في القطر - من الأسهم وغسلها 3x أخرى في 190 ميكرولتر الحد الأدنى المتوسطة مع المعونة من عينة الرف المغناطيسي.
2. ضبط تركيز الجسيمات إلى 5 × 10 ⁶ حبات / مل. عادة 50 ميكرولتر من الحل حبة غسلها ومختلطة مع 950 μ ل مزيد من M63B1 مع 0.4٪ الجلوكوز.

3. إعداد القناة وبيوفيلم النمو

1. تصاعد قناة
   1. قطع اثنين مربع (800 متر طول الجانب μ) الشعيرات الدموية الزجاج البورسليكات 10 سم طويلة للحصول على قطعتين 8 سم طويلة.
   2. الغراء قطعتين الشعرية على اثنين من الشرائح الزجاجية - قطع في النصف الأول - 2 سم بعيدا مع 1 سم عبء على حد سواء كما في الشكل 1 باستخدام الغراء فورية الغراء سريع المفعول (ما يسمى فائقة الغراء).
   3. الأوتوكلاف الإعداد بأكمله والأنابيب اللازمة لمواصلة الاتصال القناة.
   4. جمع كل المواد المعقمة تحتغطاء تدفق الصفحي: ط) القناة شنت وفخ 1، والثاني) الأنابيب والموصلات، والثالث) اثنين من الفخاخ فقاعة - مرشح فقاعة تستخدم عادة لتأمين الأطفال الرضاعة بالتنقيط (فخ 1) وفخ فقاعة محلية الصنع كما أنبوب 4 سم طويلة من قطر أكبر (فخ 2)، والرابع) والمشابك، والخامس) 30 مل المحاقن مليئة M63B1، 0.4٪ الجلوكوز، والسادس) زجاجة النفايات.
   5. ربط الإعداد كله مع الموصلات يور قفل أو تقاطعات بالترتيب التالي: 50 مل حقنة M63B1 يسيطر عليها ضخ حقنة، طب الاطفال مرشح فقاعة، فقاعة فخ محلية الصنع، والشعرية (الشكل 1، لوحة B)، وأنبوب لزجاجة النفايات. ثم ملء الإعداد مع M63B1 العقيمة، 0.4٪ الجلوكوز، وتحول على ضخ حقنة بمعدل حوالي 10 مل / ساعة، وارتفاع من معدلات التجريبية. تتبع بعناية والقضاء على جميع الفقاعات في الدائرة.
   6. تدفق المتوسطة من خلال نظام لمدة 10-15 دقيقة؛ مزيج بالتزامن 1 مل من تعليق البكتيريا في OD 0.5 من القسم1.3 مع 1 مل من محلول حبة غسلها أعدت في القسم 2.2.
   7. إرفاق (ولكن لا تغلق) المشابك للأنابيب على موقعين: قبل وبعد الشعيرات الدموية. التبديل تدفق قبالة.
   8. إدخال الخليط البكتيري حبة في شعري بعد فخ فقاعة المنزل الذي أدلى باستخدام حقنة 1 مل، مع الحرص على أن تعقد ما يصل أنبوب ينتهي لمنع دخول الهواء. إعادة نعلق الأنبوب ومن ثم إغلاق المشابك.
   9. كرر نفس الإجراء الشعرية الثانية وتحقق من كل أنابيب للفقاعات.
   10. نقل الجهاز إلى المجهر والسماح لها الوقوف لمدة 15-20 دقيقة لتمكين البكتيريا لتسوية ونعلق على سطح الشعرية. تثبيت الشعرية على خشبة المسرح المجهر مع حاوية النفايات على مستوى أعلى قليلا. وضع ضخ حقنة في أعلى العداد بجانب المجهر. رفع فخ فقاعة قبل شعري أعلى قليلا من الطائرة الشعرية لالتقاط فقاعات.
2. بيوفيلم غرووث
   1. ضبط معدل تدفق على ضخ حقنة وبدء تدفق، فإن تطوير بيوفيلم الآن على سطح شعري خلال الفترة المطلوبة - عادة 24 أو 48 ساعة في هذه التجارب.
   2. التركيز على الطائرة أسفل الشعرية وبدء تسجيل الوقت الفاصل بين الصور عينة - عادة ما تردد اقتناء الصور 2 / سوف يقدم تقريرا دقيقة بشكل كاف نمو بيوفيلم. هذه شاشات الفيديو بيوفيلم النمو آخر ضبط (انظر مقتطفات فيديو في 1 و 2 و 3).

4. الملقط المغناطيسي التثبيت

1. المسمار ملاقط المغناطيسي على micromanipulators XYZ التحكم يدويا والمسمار micromanipulators على المسرح المجهر لضبط الموقف من ملاقط نسبيا إلى الشعيرات الدموية. وضع ملاقط كما في الشكل 2 لضمان يتم إنشاء المجال المغناطيسي المناسب التدرج في منطقة المراقبة.
2. ربط ملاقط رس المولد وظيفة عبر مكبر للصوت السلطة لتوليد فترة 40 ثانية من الوقت مصنوعة من 24 ثانية إشارة الصفر و 16 ثانية من 4 أ التيار المباشر مع مشغل إرسالها إلى الضوء الساطع مصراع الملعب بعد 20 ثانية لمزامنة الإشارات تقديم سلسلة من الأحداث كما في الشكل 3.
   ملاحظة: لا يمكن أن يتحقق هاتان العمليتان في أي وقت بين التركيب الشعري والقياس البداية. نرى تجربة رسم نظرة عامة في الشكل 4.

5. زحف منحنى اكتساب

1. استخدام مراقبة الحركة س ص المرحلة المجهر لجلب حافة القطب المغناطيسي اليسرى والحافة اليسرى باليد من الشعرية في مجال الملاحظة نفسها. اتخاذ أصل المرجعي التحليل عند تقاطع س و y-المحاور التي حددها حافة الشعرية وحافة قطعة القطب، على التوالي (انظر الشكل 2).
2. ضبط الوضع الرأسي للالشعري باستخدام غرامة التركيز جمقبض ontrol الموقف المجهر. يقع عادة فحص الطائرة الاولى بين 4-7 μ متر فوق قاع الشعرية. فيديو 1 يتوافق مع الحقل س ص التي لديها أعلى الزاوية اليسرى إزاء أصل المرجعي المكانية.
3. يؤدي تسلسل 40 ثانية من الأحداث الموصوفة في القسم 4.2 والشكل (3) عن طريق التحول على مولد الحالية، وفي الوقت نفسه، يدويا تحريك الصورة تسلسل حيازة فيديو 1.
4. نقل شعري لمجال حق الجار قبل 250 ترجمة μ م المرحلة المجهر إلى اليسار وتعمل كما في القسم 5.3 لتوليد الفيديو 2 من 2 شريحة وهلم جرا للحصول على مقاطع الفيديو المطلوبة. يتم جمع عادة 3-4 مجالات 250 × 250 μ م ² على طول محور س قبل تغيير الطائرة وتكرار نفس العمليات للطائرة الجديدة.

6. معايرة القوة

1. يعد حل الجلسرين عن طريق خلط 39.8 غرام من الجلسرين مع 190 μ لتر من الماء المقطر ثنائية و 10 ميكرولتر من الجزيئات المغناطيسية في 2 × 10 ⁹ الجسيمات / مل وتملأ قناة تجريبية مع هذا الخليط ووضعه على المسرح المجهر كما هو موضح في عينة بيوفيلم.
2. بعد تثبيت ملاقط المغناطيسي كما هو مبين في الباب 4، تطبيق القوة المغناطيسية كما هو مبين في القسم 5.4 وجعل الصور الوقت الفاصل بين لاستخراج كل الجسيمات سرعة واحدة (ت) ومكانتها في شعري لاستخلاص ملف المعايرة. يجب أن يحتوي هذا الملف على القوة المستخدمة بوصفها وظيفة من مكانتها في المنطقة من تحليل الشعرية وفقا للقانون ستوكس، F = 6πRηv (R: نصف قطر من الجسيمات).

7. تحليل

1. استخدام "الجسيمات تعقب" البرمجيات للحصول على ملفات نصية مع مواقف الجسيمات في كل إطار لجميع أكوام من الصور المكتسبة كما هو مبين في القسم 5. النقيبز الصورة اقتناء كومة تردد، وحساب تشريد الجسيمات بوصفها وظيفة من الوقت (على سبيل المثال الشكل 5 وفيديو 4).
2. باستخدام ملف معايرة القوة، تحويل المنحنيات النزوح إلى منحنيات الامتثال (الالتزام الإجمالية للمواد - J (ر) - بوصفها وظيفة من الوقت) وفقا للصيغة الامتثال:
   
   الذي يعطي العلاقة بين سلالة المادية والإجهاد بطلب للحصول على الجسيمات التحقيق في دائرة نصف قطرها R مضمن في غير قابل، متجانسة المتوسطة اللزجة على النحو المحدد من قبل شور وزملاء العمل ^19.
3. ضبط منحنيات الامتثال زحف إلى البرغر النموذج العام للمواد اللزجة واشتقاق المعلمات اللزجة، J _0، J _1، η _{0، 1} η لكل الجسيمات ( الشكل 6) وفقا لصيغة البرغر ':
   
   ملاحظة: لقد استخدمت هذا التحليل الظواهر سابقا لمجموعة واسعة من المواد بما في ذلك المواد البيولوجية مثل الأغشية الحيوية لتفسير البيانات الريولوجيا العيانية ^20-22.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

وهناك تحليل نموذجي توفير التوزيع المكاني للمعلمات اللزجة في نطاق ميكرون على بيوفيلم الذين يعيشون من دون إزعاج الترتيب الأصلي. وتظهر نتائج نموذجية في الشكل 7 حيث قيم J ₀ - تعطى بوصفها وظيفة من ض محور على طول عمق والمحور الصادي على طول البعد الجانبي للبيوف...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

هذه الجسيمات المغناطيسية البذر وسحب تمكين تعيين 3D الموقع من المعلمات اللزجة من بيوفيلم نموا في حالته الأصلية في التجربة. وكشف هذا النهج عدم التجانس الميكانيكية للE. القولونية بيوفيلم نمت هنا وأعطى القرائن أن نشير إلى مكونات بيوفيلم دعم بيوفيلم الخصائ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Table 1: Reagents and cells
Magnetic particles	Life technologies	14307D	Micrometric magnetic particle, 2.8 µm diameter
Ampicillin (Antibiotic)	Sigma-Aldrich	A9518
Tetracycline (Antibiotic)	Sigma-Aldrich	87128
Bacterial strain MG1655gfpF	UGB, Institut Pasteur, France		Produces F pili at its surface, resistant to Ampicilllin and tetracycline.
Table 2: Capillaries and tubing
Filters for pediatric perfusion	Prodimed-Plastimed	6932002
Hollow Square Capillaries	Composite Metal Scientific	8280-100	Manufactured in Borosilicate glass. Square 0.8 mm x 0.8 mm
Tubing silicone peroxyde	VWR international	228-0512	Diameter 1 mm
Tubing silicone peroxyde	VWR international	228-0700	Diameter 3 mm
Table 3: Biofilm growth
Lysogeny Broth (LB) solution	Amresco-VWR	J106-10PK	Standard medium used to grow bacteria.
M63B1 solution	Home-made		Standard minimum medium used to grow bacteria.
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270	Used to make M63B1 medium with 0.4% glucose.
Table 4: Electronics
Camera EMCCD	Hamamatsu	C9100-02
Heater controller	World precision instruments	300354
Function generator	Agilent technologies	33210A
Power amplifier	Home-made		It gives a current signal with amplitudes up to 4 A.
Syringe pumps	Kd Scientific	KDS-220
Shutter	Vincent Associates	Uniblitz T132
Magnetic tweezers	Home-made		Two electromagnetic poles, each made of a copper coil with 2,120 turns of 0.56 mm in diameter copper wire and soft magnetic alloy cores (Supra50-Arcelor Mittal, France) square shaped according to the blueprint shown in Figure 10. The two cores are mounted north pole facing south pole, in order to generate a magnetic force in one direction along the length of the capillary. See coil wiring details in Figure 11.
Table 5: Optics
Inverted microscope	Nikon	TE-300
S Fluor x40 Objective (NA 0.9, WD0.3)	Nikon		This a long working distance objective enabling observation of the biofilm in the depth.
Epifluorescence filters: 1) for green fluorescence: Exc 480/20 nm; DM 495; Em 510/20  2) for Red fluorescence: Exc 540/25 nm; DM 565; Em 605/55	Chroma	1)#49020 2)#31002	Particle displacement upon force application is recorded using the red fluoresecnce filter block.
Table 6: Image analysis
ImageJ	NIH - particle tracker plugin